不同穴組電針預(yù)處理減輕肝臟缺血再灌注損傷的效應(yīng)研究

譚思由，陳文雁，孔高茵，劉景詩(shī)，魏 來(lái)

（湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，長(zhǎng)沙 410005）

肝臟缺血再灌注損傷是指肝臟在缺血后恢復(fù)其血流供應(yīng)時(shí)，肝細(xì)胞的代謝和功能障礙以及細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)損傷較肝臟缺血時(shí)更為嚴(yán)重的一種現(xiàn)象，是一種常見(jiàn)于外科手術(shù)如肝臟切除術(shù)、肝移植術(shù)后、以及發(fā)生失血性休克和肝臟創(chuàng)傷時(shí)的嚴(yán)重并發(fā)癥［1-2］。HIRI 可造成肝臟部分切除患者或者肝移植患者肝臟功能的受損和下降，導(dǎo)致手術(shù)失敗甚至患者死亡。有相關(guān)研究顯示針刺具有抗炎、抑制應(yīng)激反應(yīng)的效應(yīng)［3-5］，然而電針是否具有防治肝臟缺血再灌注損傷，改善肝臟功能的作用尚不明確，且缺少對(duì)刺激穴位選擇的相關(guān)研究。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和中醫(yī)經(jīng)典理論，肝臟相關(guān)的穴位有肝俞、陽(yáng)陵泉、太沖、內(nèi)關(guān)等穴，本文旨在中醫(yī)理論指導(dǎo)下探究以上穴位不同的組合對(duì)肝臟缺血再灌注損傷發(fā)揮的效應(yīng)，揭示不同的穴位選擇治療效果的差異性，為臨床防治HIRI 提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠70 只，體質(zhì)量200g±20g（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SYXK（湘）2015-0013），以上大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)組、模型組、肝俞組、肝俞+陽(yáng)陵泉組、肝俞+內(nèi)關(guān)組、肝俞+太沖組、非經(jīng)非穴組共7 組，每組各10 只，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵照科技部（2006）398 號(hào)《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》文件要求執(zhí)行［6］。

1.2 主要儀器和試劑 儀器：SDZ-II 型華佗牌電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠(chǎng)有限公司），不銹鋼毫針（華佗牌，蘇州醫(yī)療用品有限公司），AnymicroDSSTM 圖像采集系統(tǒng)，德國(guó)LEICARM2245 型石蠟切片機(jī)，全自動(dòng)生化分析儀（siemens 公司，德國(guó)）；試劑：蘇木素-伊紅（HE）染色液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司），TNF-α、IL-6 檢測(cè)試劑盒（北京環(huán)宇金科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）；藥品：麻醉劑采用濃度為10%水合氯醛溶液（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 各組干預(yù)方法 參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》的標(biāo)準(zhǔn)取穴［8］，肝俞組取大鼠兩側(cè)肝俞穴；肝俞+陽(yáng)陵泉組取兩側(cè)肝俞和陽(yáng)陵泉穴；肝俞+內(nèi)關(guān)組取兩側(cè)肝俞和內(nèi)關(guān)穴；肝俞+太沖組取兩側(cè)肝俞和太沖穴；非經(jīng)非穴組取兩側(cè)肝俞穴區(qū)旁開(kāi)6～8mm 左右的非經(jīng)非穴肌肉結(jié)締組織。固定大鼠后，選用規(guī)格為0.30mm×13mm 的不銹鋼毫針，消毒后將針刺入相應(yīng)穴位（區(qū)域），左右各一對(duì)，針刺深度均為5mm。同側(cè)兩根毫針?lè)謩e連接電子針療儀正負(fù)極，接通電源后將波形調(diào)至疏密波，頻率為2/100Hz，強(qiáng)度以能見(jiàn)到針體顫動(dòng)為宜，干預(yù)時(shí)間為30min，干預(yù)結(jié)束后即開(kāi)始構(gòu)建70%HIRI 模型。

模型組操作見(jiàn)1.4，假手術(shù)組僅行剖腹、肝門(mén)暴露1h 后縫合，不行其他任何手法操作。

1.4 70%HIRI 模型的制備 對(duì)于模型組、肝俞組、肝俞+陽(yáng)陵泉組、肝俞+內(nèi)關(guān)組、肝俞+太沖組、非經(jīng)非穴組，參照Z(yǔ)abala［7］等方法，大鼠禁食6h，自由飲水，行10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉（350mg/kg）后，固定大鼠、備皮、消毒，于劍突下沿正中線(xiàn)作一約 3cm 切口。暴露肝門(mén)后解剖肝十二指腸韌帶，并進(jìn)一步分離供應(yīng)肝左葉和肝中葉的動(dòng)脈、靜脈和膽管，然后應(yīng)用無(wú)創(chuàng)血管夾阻斷1h，誘發(fā)70%肝臟熱缺血（liver warm ischemia，IWI）。松開(kāi)血管夾后腹部滴入0.5mL 生理鹽水并縫合腹部切口，4h 后肝臟再灌注完成。成功構(gòu)建70%HIRI 模型后，行大鼠腹主動(dòng)脈穿刺取血3～4mL 于采血管中，直立靜置30min 后4?C 、1，500 × g 離心20 min，取其上清-20 ?C 保存，同時(shí)迅速切取肝臟組織置于10%中性福爾馬林溶液中固定。

1.5 觀(guān)察指標(biāo)

1.5.1 形態(tài)學(xué)觀(guān)察 在再灌注4h 后收取各組肝中葉及肝左葉組織標(biāo)本，放置于10%中性福爾馬林溶液中固定48h，隨后利用蘇木精尹紅（HE）染色光鏡下觀(guān)察各組肝臟組織病理形態(tài)，并行肝臟組織病理?yè)p傷評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0 分：靜脈血管及肝小葉內(nèi)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及肝細(xì)胞變性、壞死；1 分：匯管區(qū)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞少量變性及壞死；2 分：肝小葉內(nèi)散在肝細(xì)胞變性及灶狀壞死，肝組織內(nèi)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝小葉結(jié)構(gòu)尚完整；3 分：肝竇、肝中央靜脈內(nèi)游血，廣泛肝細(xì)胞變性、壞死，肝組織大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肝小葉破壞［9］。

1.5.2 血清ALT、AST 檢測(cè) 在再灌注4h 后從腹主動(dòng)脈取血3～4mL，所獲取的標(biāo)本均于24h 內(nèi)利用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中ALT 和AST 水平。

1.5.3 ELISA 法測(cè)定血清TNF-α 和IL-6 水平 TNF-α和IL-6 ELISA 試劑盒購(gòu)自北京環(huán)宇金科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司。將目的蛋白單抗包被于酶標(biāo)板，加入試劑盒內(nèi)抗目的蛋白抗體以及親和素，加顯色底物和終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm 波長(zhǎng)下吸光度值，并通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算蛋白水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0.1 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均采用mean±SD 表示，兩樣本均數(shù)間比較用t 檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下各組大鼠肝臟組織病理改變及病理?yè)p傷評(píng)分的比較 病理結(jié)果顯示假手術(shù)組肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，匯管區(qū)內(nèi)未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝竇及肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)有明顯的肝細(xì)胞變性及壞死；模型組肝組織細(xì)胞大范圍出血壞死，匯管區(qū)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)中央靜脈，肝竇內(nèi)亦有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，大量肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)破壞，肝小葉結(jié)構(gòu)尚正常；其余五組可見(jiàn)部分肝細(xì)胞水腫變性、壞死，散在空泡樣變性，肝竇及匯管區(qū)可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)破壞，見(jiàn)圖1。評(píng)分結(jié)果：肝俞組、肝俞+陽(yáng)陵泉組、肝俞+內(nèi)關(guān)組、肝俞+太沖組各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但以上四組各組評(píng)分均高于假手術(shù)組（P<0.01），且低于模型組和非經(jīng)非穴組（P<0.01），且模型組和非經(jīng)非穴組損傷評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖1H。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理改變（HE，X200）和損傷評(píng)分A：假手術(shù)組；B：模型組；C：肝俞組；D：肝俞+陽(yáng)陵泉組；E：肝俞+內(nèi)關(guān)組；F：肝俞+太沖組； G：非經(jīng)非穴組；H：肝臟組織病理?yè)p傷評(píng)分

2.2 各組大鼠血清中ALT、AST 水平的比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中ALT 和AST 水平明顯升高（P<0.01），電針預(yù)處理后非經(jīng)非穴組與模型組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），模型組和非經(jīng)非穴組ALT與AST 水平均高于肝俞組、肝俞+陽(yáng)陵泉組、肝俞+內(nèi)關(guān)組和肝俞+太沖組（P<0.01），各電針組兩兩之間比較，肝俞+陽(yáng)陵泉組ALT（P<0.05）和AST（P=0.011）水平低于肝俞組，但其余各組之間ALT 和AST 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。詳見(jiàn)圖2A、B。

2.3 各組大鼠血清炎性因子水平的比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6 水平明顯升高（P<0.01），經(jīng)電針預(yù)處理后非經(jīng)非穴組與模型組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但肝俞組、肝俞+陽(yáng)陵泉組、肝俞+內(nèi)關(guān)組、肝俞+太沖組TNF-α、IL-6 水平均較模型組和非經(jīng)非穴組降低（P<0.01），各電針組兩兩之間比較，肝俞+陽(yáng)陵泉組TNF-α（P<0.05）、 IL-6（P<0.05）水平低于肝俞組，其余各組之間ALT 和AST 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見(jiàn)圖2C、D。

圖2 各組大鼠血清中ALT、AST、TNF-α和IL-6水平比較注：*P<0.05；**P<0.01

3 討論

HIRI 并不局限于肝臟的病理生理過(guò)程，而是一個(gè)涉及多個(gè)組織器官的復(fù)雜的系統(tǒng)過(guò)程。HIRI 可嚴(yán)重?fù)p害肝功能，甚至產(chǎn)生不可逆的損傷，引起多個(gè)器官的功能障礙。厭氧代謝、線(xiàn)粒體損傷、氧化應(yīng)激、ROS 分泌、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子和趨化因子以及NO 等都參與了HIRI 的發(fā)生和發(fā)展［10-11］。

既往研究中，電針能夠改善心、腦、腎等器官的缺血再灌注損傷［12-14］，但目前關(guān)于電針對(duì)HIRI 保護(hù)性效應(yīng)的研究很少，而且針對(duì)于相關(guān)穴位選擇和搭配的研究更加匱乏。在中醫(yī)理論中，肝俞是肝臟的背俞穴，是肝臟之氣輸注于背部的特定穴，有調(diào)整肝臟功能的作用，如《千金方》：肝俞主“積聚病痛，兩脅急痛”；《針灸甲乙經(jīng)》：“肝脹者，肝俞主之，《針灸大全》：“肝俞……五積氣塊，血積業(yè)癖”，等等。太沖是肝經(jīng)的原穴，亦可以治療肝臟的疾病，正如《靈樞·九針十二原》所說(shuō)：“五臟有疾，當(dāng)取之十二原”；“五臟有疾也，應(yīng)出十二原”；“陰中之少陽(yáng)，肝也，其原出于太沖”，按照根結(jié)、標(biāo)本理論，太沖與肝俞配伍能夠起到治療肝臟疾病，保護(hù)肝臟功能的效果。 而陽(yáng)陵泉是治療膽腑疾病十分有效的穴位，《靈樞·邪氣臟腑病形》中提到：“膽病者，善太息，口苦，嘔吐宿汁，心下潺潺，恐人將捕之，隘中介介然，數(shù)唾……取陽(yáng)陵泉”，《針灸甲乙經(jīng)》亦云“脅下支滿(mǎn)，嘔吐逆，陽(yáng)陵泉主之”，此穴與肝俞配伍能起到肝膽同治，發(fā)揮護(hù)肝利膽的有益作用。內(nèi)關(guān)穴常常用于主治心痛、驚悸、神昏等，具有醒神定志的功能，其與肝俞穴配伍能起到扶正祛邪，調(diào)和陰陽(yáng)，疏通經(jīng)絡(luò)，使失調(diào)的氣血津液或臟腑趨向正常狀態(tài)的作用。故而選擇以上所述穴位，以肝俞為主穴，分別配伍太沖、陽(yáng)陵泉、內(nèi)關(guān)，研究比較三組配穴抗HIRI 的效應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示：穴位電針預(yù)刺激具有防治肝臟缺血再灌注損傷的作用，且穴位配伍的不同在防治HIRI 上具有不同的效應(yīng)，通過(guò)肝臟缺血前同時(shí)刺激肝俞、陽(yáng)陵泉二穴相對(duì)于刺激肝俞+太沖、肝俞+內(nèi)關(guān)和單一刺激肝俞穴可能具有更好的減輕HIRI 的作用。該作用主要體現(xiàn)為：電針預(yù)刺激能夠減輕大鼠缺血再灌注肝臟細(xì)胞壞死的嚴(yán)重程度；以及能夠減少匯管區(qū)和肝竇內(nèi)炎癥細(xì)胞的聚集，保護(hù)正常的肝臟組織結(jié)構(gòu)。另外，在肝俞組、肝俞+陽(yáng)陵泉組、肝俞+內(nèi)關(guān)組和肝俞+太沖組中，各電針穴組的肝臟組織損傷評(píng)分差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而肝俞+陽(yáng)陵泉組和肝俞組兩組之間比較，前者血清轉(zhuǎn)氨酶和TNF-α、IL-6 水平更低，肝俞組相對(duì)于肝俞+內(nèi)關(guān)組和肝俞+太沖組無(wú)明顯差異。本結(jié)果一方面說(shuō)明了轉(zhuǎn)氨酶和相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)也許比肝臟病理?yè)p傷評(píng)分能更早的提示HIRI 的發(fā)生；另一方面，說(shuō)明了肝俞穴和陽(yáng)陵泉穴配伍相對(duì)于其它穴位配伍可能具有更好的抗HIRI 效應(yīng)。本團(tuán)隊(duì)在本次結(jié)果的基礎(chǔ)上，結(jié)合既往研究考慮，擴(kuò)大樣本量和豐富檢測(cè)指標(biāo)的多樣化或許能夠得到更為確切的研究結(jié)果。此外，針對(duì)于不同的電針干預(yù)參數(shù)結(jié)合特定穴位是否發(fā)揮了不同的抗肝臟缺血再灌注損傷的作用還有待進(jìn)一步的研究。

本研究證明了穴位電針預(yù)刺激能夠有效減輕肝門(mén)阻斷引起的肝臟缺血再灌注損傷，且該效應(yīng)因配伍穴組的不同而有差異，并證明了肝俞穴與陽(yáng)陵泉穴配伍相對(duì)于單一刺激肝俞穴具有更顯著的作用，但是其內(nèi)在機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。本項(xiàng)研究得出的結(jié)果有可能對(duì)于進(jìn)一步探索穴位配伍效應(yīng)的研究模式有一定的啟發(fā)意義，以此來(lái)驗(yàn)證并揭示穴位功能與機(jī)體狀態(tài)的相關(guān)規(guī)律，在科學(xué)研究基礎(chǔ)上，建立并優(yōu)化有效的穴位配伍方案，為臨床治療和研究提供依據(jù)。