灰綠堿蓬多糖脫蛋白工藝研究

付建鑫，邵家威，張炳文，方奕珊，張桂香*

（1.濟(jì)南大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)系，山東濟(jì)南 250002；2.齊魯工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程，山東濟(jì)南 250353）

近年來，岸基濕地、灘涂等土壤鹽漬化現(xiàn)象日益嚴(yán)重，耕地土壤土質(zhì)硬化，耕地資源緊缺，迫使人們不得不考慮開發(fā)利用鹽生植物資源，所以研究及推廣鹽生植物的種植勢在必行?；揖G堿蓬（Bunge）又名黃須菜，是一年生藜科堿蓬屬草本鹽生植物，多生長于灘涂及荒漠處，是鹽堿地的特征植物[1-2]。堿蓬在我國不僅分布廣泛，而且產(chǎn)量高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年僅黃河三角洲地區(qū)的堿蓬產(chǎn)量就高達(dá)3.3105t[3-4]。堿蓬莖、葉含有豐富的礦物質(zhì)、黃酮、皂苷，其種籽中含有大量的共軛亞油酸、花生四烯酸等不飽和脂肪酸[5-6]。醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，堿蓬提取物中的黃酮、多糖具有抗氧化、降低血漿膽固醇功能，可用于心腦血管疾病的預(yù)防及中老年人的保健；其芽、葉分離物具有抑菌消炎等功效[7]，因此具有很高的研究價(jià)值。

目前國內(nèi)外關(guān)于堿蓬的研究主要著眼于鹽地堿蓬、硬翅堿蓬的耐鹽機(jī)理研究及活性物質(zhì)提取等方面[8]，對(duì)灰綠堿蓬多糖的提取、純化等的研究鮮見報(bào)道。蛋白本身具有熱敏感性，糖蛋白復(fù)合物在脫除蛋白質(zhì)以后，多糖自身生物活性會(huì)明顯增加，因此，關(guān)于多糖脫蛋白的研究成為熱點(diǎn)。鑒于此，本研究以灰綠堿蓬為研究對(duì)象，測定了根、莖、葉及全株的基本營養(yǎng)成分并對(duì)灰綠堿蓬多糖的脫蛋白方式進(jìn)行了探究。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

灰綠堿蓬，采自山東東營；堿性蛋白酶，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；石油醚、無水乙醇、硫酸銅、氫氧化鈉、濃硫酸、苯酚、葡萄糖、氨水、TCA、(NH4)2SO4等試劑，均為分析純。

702A 紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；PHS-3B pH 酸度計(jì)，賽多普利斯科學(xué)儀器有限公司；FA2004N 電子天平，上海上平儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 灰綠堿蓬基本成分的測定

蛋白質(zhì)含量測定，按GB 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》執(zhí)行；總糖含量測定，按GB/T 15672-2009《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食用菌中總糖含量的測定》執(zhí)行；脂肪含量測定，按GB 5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》執(zhí)行；黃酮含量測定，按GB/T 20574-2006《蜂膠中總黃酮含量的測定方法分光光度比色法》執(zhí)行；皂苷含量測定，按GB/T 22464-2008《大豆皂苷》執(zhí)行。

1.2.2 灰綠堿蓬多糖提取工藝

通過溶劑浸提法去除植株少量脂肪及大量可溶性色素[8-9]。過量正己烷回流脫脂4～6 h，將脫脂后的索式提取系統(tǒng)用少量水沖洗，以75%乙醇為溶劑進(jìn)行色素沖洗，直至提取管內(nèi)無顏色變化為止。稱量單位質(zhì)量已處理的堿蓬干粉（200 目）于燒杯中，加入一定量的沸水，封膜密閉后于超聲清洗器中浸提。將冷卻沉降后的提取上清液在8 000 r/min 條件下離心10 min，取離心后的上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到粗多糖提取液。400 mL 無水乙醇按照4:1（V/V）的比例緩慢倒入100 mL 粗多糖提取液中，并攪拌均勻，放置于4條件下冷藏，每隔3 h 攪拌一次，沉淀過夜后，傾倒上層清液。下層溶液在7 000 r/min 離心12 min 后，將沉淀用無水乙醇和石油醚洗滌多次后過HZ-800 大孔樹脂脫色，收集脫色后溶液冷凍干燥，即為堿蓬粗多糖。

1.2.3 多糖脫蛋白工藝

（1）TCA 脫蛋白

TCA 屬于有機(jī)弱酸類，它可以改變?nèi)芤后w系中pH使其呈酸性，溶液中懸浮蛋白質(zhì)在酸性條件下變性形成沉淀析出，蛋白質(zhì)析出速度和脫除率與TCA 濃度直接相關(guān)[15]。將100 mL、10 mg/mL 脫色后的堿蓬多糖溶液按照1%、3%、7%、10%、15%的比例與30%粗多糖提取液（V/V）混合，攪拌30 min 后于200 W 功率下超聲10 min，用0.1 mol/LNaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.8，使蛋白質(zhì)沉淀，再以7 000 r/min 離心10 min，取上清液測定蛋白質(zhì)含量，確定TCA 脫蛋白的效果及最佳條件[10]。

（2）Savage 脫蛋白

四氯化碳溶液又稱氯仿，具有極強(qiáng)的破壞作用，可以使蛋白質(zhì)急劇變性，正丁醇可以溶解變性蛋白形成凝膠體體系利于分層。按照1:4（V/V）的比例將氯仿（CCl4）與正丁醇復(fù)配成Savage 溶劑，按照5:1（V/V）的比例將復(fù)配溶劑與脫色后的多糖溶液混合振蕩，并以1.5104r/min破碎機(jī)高速攪拌，移入分液漏斗后靜置分層，測定5 次脫蛋白的效果，確定Savage 脫蛋白法的效果及最佳脫蛋白次數(shù)[11]。

（3）(NH4)SO4沉淀法

蛋白質(zhì)鹽析（salting out）是指溶液體系中的蛋白質(zhì)隨著外源中性鹽（硫酸銨、氯化銨等）的加入而逐漸析出的現(xiàn)象。鹽溶液是強(qiáng)電解質(zhì)，在溶液中完全電離，具有較高的溶解度。鹽離子會(huì)附著蛋白質(zhì)表面的水膜爭奪水分子破壞水膜結(jié)構(gòu)。另一方面，陰離子如Cl-可以結(jié)合蛋白質(zhì)表面的，從而使蛋白質(zhì)顆粒團(tuán)聚形成沉淀析出。取100 mL、10 mg/mL 脫色后的灰綠堿蓬多糖溶液，用0.1 mol/L 的氨水溶液調(diào)節(jié)pH 至8.3 左右，按照1%、3%、7%、10%、15%的比例加入5 mol/L 的(NH4)SO4溶液，封口膜封閉錐形瓶口，劇烈振蕩后于85的水浴條件下保持40 min。反應(yīng)完畢后，靜置到室溫，10 000 r/min 離心10 min，取上清液測定蛋白質(zhì)含量，探究(NH4)SO4的最佳濃度[12]。

（4）酶-Savage 法

取100 mL、10 mg/mL 脫色后的灰綠堿蓬多糖溶液，按照1%、3%、7%、10%、15%比例加入堿性蛋白酶（按照每100 mL 溶液104U），使用0.1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.5，在37水浴保持3.5 h，反應(yīng)完畢后在100水浴滅酶15 min，10 000 r/min 離心10 min，上清液再按照（2）所述操作1 次，取上清液測定蛋白質(zhì)含量，確定最佳酶添加量[13]。

1.2.4 考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量

（1）多糖溶液的配制

取堿蓬粗多糖用蒸餾水配置成10 mg/mL 粗多糖溶液，充分溶解后冷藏、靜置備用[14]。

（2）考馬斯亮藍(lán)G-250 的配制

取0.1 g G-250 溶于50 mL、85%無水乙醇中，超聲充分溶解，2 000 r/min 離心10 min，取上清液與100 mL、85%（w/V）的磷酸混合，用去離子水定容至1 L。

按照表1 依次加入溶劑，混合均勻后，取0.1 mL加入5 mL G-250 搖勻室溫反應(yīng)10 min，595 nm 條件下測定吸光值，用去離子水做空白對(duì)照，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線試劑量Table 1 The amount reagent of standard curve

蛋白質(zhì)脫除率計(jì)算公式見式（1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰綠堿蓬物質(zhì)成分含量

表2 灰綠堿蓬物質(zhì)成分含量Table 2 The content of each substance

2.2 堿蓬多糖脫蛋白的方法比較

2.2.1 TCA 脫蛋白的效果

圖2（見下頁）顯示了TCA 脫蛋白效果。由圖2 可知，隨著TCA 含量增加，脫除率呈擬線性增加，說明蛋白質(zhì)脫除率逐漸增大，溶液中蛋白質(zhì)含量逐漸減少。蛋白質(zhì)脫除趨勢可以看出蛋白質(zhì)的脫除效果對(duì)三氯乙酸呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，在達(dá)到TCA 飽和濃度前，游離蛋白和結(jié)合蛋白會(huì)隨著TCA 增加而減少。除此之外，三氯乙酸也可能破壞糖苷鍵分解糖蛋白，因此10%TCA 用量效果最佳。

對(duì)于女性的上述角色定位及德性要求與儒家所建構(gòu)的秩序體系是內(nèi)在一體的。在儒家而言，“男女之別”只是人倫之起點(diǎn)，其目的在于建立“父子親”“君臣義”的等差性社會(huì)秩序。因而盡管人們認(rèn)為女性通常被限定于“內(nèi)”和“私”的領(lǐng)域之中而無緣于公共事務(wù)，但實(shí)際上，儒家女性是被裹挾于家族與政治的“公”之中并為“公”服務(wù)的。從公私觀上考察，可以清晰地看出其邏輯線索。

2.2.2 Savage 脫蛋白的效果

圖3 顯示了Savage 脫蛋白的效果，由圖可知，隨著脫蛋白次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)脫除率明顯增大，脫蛋白次數(shù)為4 次時(shí)，蛋白質(zhì)含量趨于穩(wěn)定，此時(shí)蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到最大，為89.14%。李小榮等[16]對(duì)倒卵葉五加多糖脫蛋白結(jié)論中，Savage 法脫蛋白為5 次時(shí)，蛋白質(zhì)最佳脫除率為80.32%；對(duì)蒲公英多糖脫蛋白效果研究中發(fā)現(xiàn)，相同方法處理6 次，蛋白質(zhì)脫除率穩(wěn)定在80.21%[17]。整體來看，Savage 法具有較好的脫蛋白能力和普適性，灰綠堿蓬多糖Savage 法脫蛋白處理4 次較好。

2.2.3 (NH4)2SO4沉淀法脫蛋白的效果

圖4 顯示了(NH4)2SO4脫蛋白效果。如圖4 所示，隨著(NH4)2SO4濃度增大，蛋白脫除率增大，蛋白鹽析形成沉淀，溶液中蛋白質(zhì)含量逐漸減少。鹽析法主要針對(duì)游離蛋白質(zhì)顆粒，同時(shí)(NH4)2SO4濃度對(duì)鹽析效果存在較大影響，高濃度鹽溶液與體系存在濃度差，因此脫蛋白效果較好。(NH4)2SO4濃度為10%時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率最高為15.36%。

2.2.4 酶-Savage 法脫蛋白的效果

2.3 脫蛋白方式的選擇

選取最佳脫蛋白方式主要考慮蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率兩個(gè)指標(biāo)，以多糖為研究目標(biāo)，脫除游離蛋白及糖蛋白可以更好地測定多糖的生物活性。如表3 可知，TCA法和鹽析法蛋白質(zhì)脫除率分別為38.43%、14.24%，蛋白質(zhì)脫除率較低，無法得到高純度的多糖。比較Savage 法和酶-Savage 法，兩種脫蛋白工藝的都具有較好的蛋白質(zhì)脫除效果，除此之外，酶-Savage 法的多糖保留率高于Savage 法，在酶添加量7%、Savage 溶液處理一次，此時(shí)多糖保留率達(dá)到67.27%。因此，灰綠堿蓬多糖最佳脫蛋白方法為酶-Savage 法。

表3 脫蛋白效果與多糖保留率/%Table 3 Deproteinization effect and polysaccharide retention rate/%

3 結(jié)論

通過測定灰綠堿蓬根、莖、葉的基本營養(yǎng)物質(zhì)成分，發(fā)現(xiàn)全植株水分含量較高而脂肪含量極少，含有部分蛋白質(zhì)，葉片中的總黃酮、總皂苷和總糖含量最多。在脫蛋白研究中，比較了Savage 法、鹽析法、TCA 法和酶-Savage 法脫蛋白效果?？紤]到最低溶劑使用量和脫蛋白效果最優(yōu)，選擇酶-Savage 法作為灰綠堿蓬多糖的脫蛋白方式，酶添加量為7%，Savage 溶液處理一次蛋白質(zhì)脫除率80.71%，多糖保留率為67.27%，此時(shí)脫蛋白效果和多糖保留率最好。