苦瓜枯萎病原菌的綠色熒光蛋白基因標(biāo)記

陳燕萍　劉欣　肖榮鳳　朱育菁　林永勝　劉波

摘要：【目的】苦瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌苦瓜?；停‵usarium oxysporum f.sp.momodicae）侵染引起的一種重要土傳病害。為有效防控該病害，對(duì)其病原菌進(jìn)行綠色熒光蛋白基兇（gfp）標(biāo)記，為研究病原菌在苦瓜植株體內(nèi)的侵染特性提供可視化跟蹤檢測(cè)手段。【方法】采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法對(duì)苦瓜枯萎病原菌強(qiáng)致病性野生型菌株FJAT-3018進(jìn)行綠色熒光蛋白基兇（gfp）標(biāo)記，通過對(duì)轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)觀察、生長(zhǎng)速率和致病性測(cè)定，篩選出遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。【結(jié)果】野生型菌株FJAT-3018的轉(zhuǎn)化效率約為14.5個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)孢子。經(jīng)10次繼代培養(yǎng)，篩選獲得的轉(zhuǎn)化子在菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速率和致病性方面與野生型菌株FJAT-3018無明顯差異，gfp基兇在轉(zhuǎn)化子的菌絲體和分生孢子中均能強(qiáng)表達(dá);通過激光共聚焦顯微鏡掃描跟蹤發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化子能夠在苦瓜植株根部和莖部侵染與定殖?！窘Y(jié)論】綠色熒光蛋白基因已成功轉(zhuǎn)入到苦瓜野生型菌株FJAT-3018中，其轉(zhuǎn)化子具有良好的遺傳穩(wěn)定性且致病力不受影響。

關(guān)鍵詞：苦瓜;枯萎病;綠色熒光蛋白;基因標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S436.8

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-0384（2020）11-1228-06

0引言

【研究意義】苦瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌苦瓜?；停‵usarium oxysporum f.sp.Momodicae）侵染引起的一種毀滅性土傳病害，該病害在苦瓜整個(gè)生育期均可發(fā)生，并導(dǎo)致植株萎蔫死亡，造成產(chǎn)量損失，嚴(yán)重制約了苦瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-2]。為有效防控該病害，亟需了解該病原菌對(duì)苦瓜的侵染特性。因此，建立一種可視化的跟蹤標(biāo)記手段，有助于深入研究該病原菌的侵染過程和指導(dǎo)該病害防控?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】綠色熒光蛋白標(biāo)記基因（gfp）可為研究病原菌在植株體內(nèi)的侵染蔓延提供可視化跟蹤技術(shù)[3]。它具有熒光性質(zhì)穩(wěn)定、直觀、操作方便和不需要添加外源底物就可以在活細(xì)胞中直接檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于真菌分子生物學(xué)研究[4-5]。適用于鐮刀菌屬真菌的gfp基因轉(zhuǎn)化方法有多種，如PEG介導(dǎo)法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍介導(dǎo)法等[6-8]。其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法是直接以真菌孢子或菌絲為受體，較PEG介導(dǎo)法和基因槍介導(dǎo)法的操作更簡(jiǎn)單，可減少轉(zhuǎn)化過程中其他因素的影響，且轉(zhuǎn)化效率和遺傳穩(wěn)定性也更高[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已利用gfp基因成功標(biāo)記了番茄、香蕉、甜瓜和玉米等寄主作物尖孢鐮刀菌[10-14]，但未見苦瓜枯萎病原菌的gfp基因標(biāo)記的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為有效防控該病害，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法對(duì)苦瓜枯萎病原菌強(qiáng)致病性野生型菌株FJAT-3018進(jìn)行綠色熒光蛋白基因（gfp）標(biāo)記，并比較轉(zhuǎn)化前后菌株的菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速率和致病性差異，篩選m遺傳穩(wěn)定標(biāo)記的轉(zhuǎn)化子，有助于通過可視化跟蹤觀察深入研究該病原菌的侵染過程和指導(dǎo)該病害防控。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

苦瓜枯萎病原菌強(qiáng)致病菌株FJAT-3018屬于尖孢鐮刀菌苦瓜?；停‵usarium oxysporum f.sp.Momodicae），由本研究室保存;供試苦瓜感病品種（新翠）植株購(gòu)自廈門如意種苗高科技股份有限公司;農(nóng)桿菌AGL-1菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)，載體pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供;潮霉素B、卡那霉素、特美汀等抗生素均購(gòu)白美國(guó)Sigma公司;PDB培養(yǎng)基（200g馬鈴薯，15g葡萄糖，加水定容至1000 mL）;PDA固體培養(yǎng)基（200g馬鈴薯，15g葡萄糖，15g瓊脂粉，加水定容至1000mL），篩選培養(yǎng)基（含終濃度為100μg·mL-1潮霉素B和200μg·mL-1特美汀的PDA固體培養(yǎng)基）;農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化所需的試劑及3種培養(yǎng)基配方（基礎(chǔ)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基和共培養(yǎng)培養(yǎng)基）參考文獻(xiàn)[15]，具體配方見表1?；旌侠w維微孔濾膜（購(gòu)白上海生工）.0.22μm微孔過濾器（Millipore）。

1.2苦瓜枯萎病菌的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行苦瓜枯萎病菌的gfp基因轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化方法參照文獻(xiàn)[15]，略做改動(dòng)。具體步驟如下：（1）苦瓜枯萎病原菌菌株FJAT-3018于含200μg·mL-1硫酸鏈霉素的PDA固體培養(yǎng)基純化培養(yǎng)7d，在培養(yǎng)皿中加入適量無菌水，用無菌涂布棒刮洗菌落表面洗出分生孢子，孢子懸浮液用雙層無菌擦鏡紙過濾，并用誘導(dǎo)培養(yǎng)基調(diào)整分生孢子濃度為1×106個(gè)·mL-1備用。（2）將已轉(zhuǎn)入pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp載體的農(nóng)桿菌AGL-1用基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MM培養(yǎng)基）于28℃、250r·min-1搖床培養(yǎng)48h，后用誘導(dǎo)培養(yǎng)基（IM培養(yǎng)基）調(diào)整菌液濃度為OD600=0.15，繼續(xù)搖床培養(yǎng)約6h至菌液OD600約為0.60。（3）將滅菌的混合纖維微孔濾膜放置在共培養(yǎng)培養(yǎng)基（CM培養(yǎng)基）上，并取已制備好的FJAT-3018孢子懸浮液和農(nóng)桿菌液各100μL混勻后于混合纖維微孔濾膜上均勻涂布，10個(gè)重復(fù)，并于25℃暗培養(yǎng)48h。（4）共培養(yǎng)48h后，將混合纖維微孔濾膜用無菌刀片劃成小塊分散擺放到篩選培養(yǎng)基（含終濃度為150μg·mL-1潮霉素B和200μg·mL-1特美汀的PDA培養(yǎng)基）上，于28℃暗培養(yǎng)72h。（5）篩選培養(yǎng)基平板放置在BD-BGC1藍(lán)光切膠儀中，挑取發(fā)出明亮綠色熒光菌落邊緣的菌絲體于篩選培養(yǎng)基上復(fù)篩，繼續(xù)用藍(lán)光切膠儀挑選出發(fā)出明亮綠色熒光的平板，并通過單孢分離法獲得相對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)化子。

1.3轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

單孢分離純化獲得的強(qiáng)綠色熒光表達(dá)的不同轉(zhuǎn)化子在PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)6d后，選取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)以上方法連續(xù)培養(yǎng)10代，觀察各轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)變化，測(cè)量菌落生長(zhǎng)速度，以野生型菌株FJAT-3018為對(duì)照。挑取熒光強(qiáng)且遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子于-80℃甘油冷凍保存，同時(shí)挑取代表性轉(zhuǎn)化子的菌絲體制成玻片，置于熒光顯微鏡下觀察菌絲和孢子的熒光強(qiáng)度。

1.4轉(zhuǎn)化子對(duì)苦瓜植株的致病性測(cè)定

選取2株代表性轉(zhuǎn)化子和野生型菌株FJAT-3018分別于PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d，雙層紗布過濾后分別調(diào)整孢子懸浮液濃度為106個(gè)·mL-1備用。取株高為10～15cm的苦瓜實(shí)生苗用栽培基質(zhì)種植于盆缽中，7d后用轉(zhuǎn)化子孢子懸浮液傷根澆灌接種，每株澆灌50mL，以野生型菌株FJAT-3018和清水處理為對(duì)照，每處理組分別接種30株苦瓜苗，于（28±2）℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。逐日觀察苦瓜苗的發(fā)病情況，通過發(fā)病速度和發(fā)病率比較轉(zhuǎn)化子與野生型菌株的致病力差異?？喙厦?片及以上葉片表現(xiàn)萎蔫癥狀即計(jì)為發(fā)病株，發(fā)病率=（各處理組發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)）×100%。同時(shí)，在接種后7d和14d拔取發(fā)病植株分段切片檢測(cè)，植株從盆缽中拔出后用流水將根及莖部表皮雜質(zhì)沖洗干凈，采用徒手切片法，切取根部及莖部組織薄片，放置于載玻片上，利用激光共聚焦顯微鏡（Leica SP8）于波長(zhǎng)500～525nm下觀察病原菌在植株根部與莖部的侵染情況。

2結(jié)果與分析

2.1苦瓜枯萎病菌的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行菌株FJAT-3018的gfp基因轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，共培養(yǎng)后的10張混合纖維微孔濾膜在篩選培養(yǎng)基上共長(zhǎng)出145個(gè)發(fā)綠色熒光的菌落，遺傳轉(zhuǎn)化效率約為14.5個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)孢子。發(fā)光菌落復(fù)篩后，經(jīng)單孢分離和熒光強(qiáng)度檢測(cè)挑取15個(gè)綠色熒光基因強(qiáng)表達(dá)的轉(zhuǎn)化子（編號(hào)為FJAT-31284～FJAT-31298）進(jìn)行保存。

2.2轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

15個(gè)轉(zhuǎn)化子在無潮霉素選擇壓力的PDA培養(yǎng)基上分別繼代培養(yǎng)10次后，菌落形態(tài)、色澤與野生型較一致（圖1-A、B）。各轉(zhuǎn)化子在藍(lán)光切膠儀中菌落呈現(xiàn)明亮的綠色（圖1-C）。轉(zhuǎn)化子的菌絲、產(chǎn)孢器和分生孢子在顯微鏡下與野生型菌株一致，且在熒光顯微鏡下發(fā)出明亮的綠色熒光（圖1-D～F）。培養(yǎng)7d時(shí)的平均生長(zhǎng)速率為（6.6±0.6）cm，與野生型菌株FJAT-3018的生長(zhǎng)速率（6.5±0.5）cm差異不顯著。通過菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速率和綠色熒光檢測(cè)，說明gfp基因已成功轉(zhuǎn)入到菌株FJAT-3018中，且各轉(zhuǎn)化子具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.3轉(zhuǎn)化子對(duì)苦瓜植株的致病性測(cè)定

接種野生菌株FJAT-3018和轉(zhuǎn)化子FJAT-31284、FJAT-31290的苦瓜植株，在接種約7d時(shí)，不同處理的植株葉片均開始出現(xiàn)輕微萎蔫癥狀;接種10d左右，植株大部分葉片出現(xiàn)萎蔫癥狀;接種14d后，植株完全萎蔫死亡;但清水處理的植株無萎蔫癥狀，正常生長(zhǎng)（圖2）。發(fā)病率統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，接種野生菌株FJAT-3018和轉(zhuǎn)化子FJAT-31284、FJAT-31290的植株發(fā)病率均為100%，清水對(duì)照發(fā)病率為0。重新分離接種病原菌FJAT-3018和轉(zhuǎn)化子FJAT-31284、FJAT-31290的回接發(fā)病植株，均獲得與接種時(shí)相同的病原物;清水對(duì)照未分離到培養(yǎng)物。進(jìn)一步利用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化子FJAT-31284和FJAT-31290在苦瓜植株體內(nèi)的侵染情況，結(jié)果表明，接種兩個(gè)轉(zhuǎn)化子7d時(shí)，植株的少許根部出現(xiàn)褐變，此時(shí)均可觀察到呈現(xiàn)綠色熒光的菌絲體在根部組織細(xì)胞間隙侵染蔓延，但在莖部組織尚未檢測(cè)到綠色熒光的菌絲體（圖3-A、B）;接種轉(zhuǎn)化子14d時(shí)，大部分根部組織褐變，距離莖基部1-2cm處的莖組織切片后，均可觀察到大量呈現(xiàn)綠色熒光的菌絲體在莖部組織細(xì)胞間隙侵染蔓延（圖3-C、D）。通過致病力測(cè)定和侵染觀察，說明供試的2個(gè)轉(zhuǎn)化子對(duì)苦瓜植株的致病力與野生型菌株較一致，且兩個(gè)轉(zhuǎn)化子均能在植株體內(nèi)侵染蔓延并呈現(xiàn)明亮的綠色熒光。

3討論與結(jié)論

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化已在淡紫擬青霉Paecilomvces lilacinus、小麥赤霉菌F.graminearum和稻瘟病菌Magnaporthe grisea等多種作物真菌上應(yīng)用[14，16-17]。但農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的效率會(huì)受到多種因素的影響，如農(nóng)桿菌菌株類型、轉(zhuǎn)化受體菌株類型、乙酰丁香酮濃度等因素[18]。任俊杰等[19]轉(zhuǎn)化西瓜枯萎病菌的效率為1177個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)孢子;劉朋娟等[20]轉(zhuǎn)化稻瘟病菌的效率為約300個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)孢子;本研究轉(zhuǎn)化苦瓜枯萎病菌的效率約為14.5個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)孢子。雖然本研究的轉(zhuǎn)化效率略低，但是所獲得轉(zhuǎn)化子在菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速率和致病力等方面與野生型菌株FJAT-3018相比無明顯差異，且均能穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白基因，該結(jié)果與姚錦愛等[17]、任俊杰等[19]和郭強(qiáng)等[21]的研究結(jié)果一致。綠色熒光蛋白基因標(biāo)記是研究病原菌與寄主植物互作的良好可視化工具[3]。Zvirin等[22]和李春強(qiáng)等[23]分別利用gfp基因標(biāo)記的甜瓜尖孢鐮刀菌和西瓜尖孢鐮刀菌菌株，研究了病原菌在寄主植株的侵染定殖，結(jié)果表明在激光共聚焦顯微鏡下，能清晰地觀察到發(fā)熒光的病原菌菌絲體在植株體內(nèi)侵染蔓延。本研究也利用激光共聚焦顯微鏡觀察了2個(gè)轉(zhuǎn)化子FJAT-31284和FJAT-31290在苦瓜植株體內(nèi)的侵染定殖，也表明轉(zhuǎn)化后的菌株均能在植株體內(nèi)侵染蔓延且穩(wěn)定表達(dá)。綠色熒光蛋白基因已成功轉(zhuǎn)入到苦瓜野生型菌株FJAT-3018中，其轉(zhuǎn)化子具有良好的遺傳穩(wěn)定性且致病力不受影響。后續(xù)將利用成功標(biāo)記gfp基因且遺傳性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行示蹤觀察，為研究病原菌在苦瓜植株體內(nèi)的侵染特性提供可視化跟蹤檢測(cè)手段。

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（責(zé)任編輯：林海清）

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收稿日期：2020-09-14初稿：2020-10-14修改稿

作者簡(jiǎn)介：陳燕萍（1985-），女，碩士，助理研究員，主要從事生物技術(shù)及生物防治（E-mail：chenyanping071@sina.com）

*通信作者：劉波（1957-），男，博士，研究員，主要從事微生物生物技術(shù)與農(nóng)業(yè)生物藥物研究（E-mail：fzliubo@163.com）

基金項(xiàng)目：福建省科技計(jì)劃公益類專項(xiàng)（2018Rl017-9）：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（STIT2017-2-8）