雞爪槭ApMYB306基因克隆及功能分析

朱璐 李淑順 聞婧 馬秋月 顏坤元 任杰 李倩中

摘要：采用基因克隆的方法獲得雞爪槭金陵黃楓R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，經(jīng)同源比對(duì)和生物信息學(xué)分析將其命名為ApMYB306。通過(guò)組織表達(dá)特性分析發(fā)現(xiàn)ApMYB306在莖中表達(dá)量最高，葉中表達(dá)量次之，根中表達(dá)量最低。在洋蔥表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)分析結(jié)果顯示ApMYB306蛋白定位于細(xì)胞核中。ApMYB306對(duì)于高溫、低溫、干旱和鹽脅迫均有明顯的響應(yīng)，受脅迫誘導(dǎo)后表達(dá)量顯著上升。冷凍處理后，轉(zhuǎn)ApMYB306基因株系成活率較野生型升高。ApMYB306超表達(dá)擬南芥株系較野生型開(kāi)花延遲，表明ApMYB306可能通過(guò)抑制擬南芥FT基因啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控花期。

關(guān)鍵詞：雞爪槭;ApMYB306基因;抗逆性

中圖分類(lèi)號(hào)：S687文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）06-1512-09

Abstract：In this study， the R2R3-MYB transcription factor gene was obtained from Acer palmatum Jinlinghuangfeng by gene cloning and named ApMYB306 via homology comparison and bioinformatics analysis. Through the analysis of tissue expression characteristics， it was found that the expression level of ApMYB306 was the highest in the stem， followed by leaves， and the expression level was lowest in the roots. The results of transient expression analysis in onion epidermal cells showed that ApMYB306 protein was localized in the nucleus. ApMYB306 had obvious response to high temperature， low temperature， drought and salt stress， and its expression level increased significantly after induction. After freezing treatment， the survival rate of ApMYB306 transgenic lines was higher than that of the wild-type lines. The flowering time of ApMYB306 overexpressing Arabidopsis lines was later than that of the wild-type lines， which indicated that ApMYB306 might regulate the flowering time by inhibiting the expression of the FT gene promoter.

Key words：Acer palmatum;ApMYB306 gene;stress resistance

雞爪槭（Acer palmatum Thunb.）為槭樹(shù)科槭屬植物，其葉色豐富，葉形優(yōu)美，是中國(guó)極為重要的彩葉樹(shù)種，具有很高的觀賞價(jià)值，在彩葉苗木生產(chǎn)中具有十分重要的地位[1]。在雞爪槭苗木栽培和生產(chǎn)過(guò)程中，干旱、鹽脅迫、寒害和熱脅迫等非生物脅迫是制約雞爪槭生產(chǎn)和園林應(yīng)用的關(guān)鍵因素，因此挖掘雞爪槭抗性基因，解析其調(diào)控機(jī)制，可為獲得優(yōu)良抗性的雞爪槭品種及其分子遺傳育種提供重要基礎(chǔ)。

MYB轉(zhuǎn)錄因子大家族包括3個(gè)亞類(lèi)，即MYB1R、R2R3-MYB和MYB3R。其中，植物中最大的亞類(lèi)是R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子[2-3]。例如，模式植物擬南芥具有126個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子[3]，而玉米的基因組則具有173個(gè)[4]，蘋(píng)果具有222個(gè)[5]，番茄具有121個(gè)[6]，黑楊木具有192個(gè)[7]。R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子功能繁多，參與調(diào)控植物初生和次生代謝反應(yīng)、植物生長(zhǎng)發(fā)育及生物和非生物脅迫等過(guò)程。例如，蘋(píng)果MdMYB23受冷脅迫誘導(dǎo)。MdMYB23超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果愈傷組織和擬南芥耐寒性增強(qiáng)[8]。水稻OsMYB2在鹽、冷和干旱脅迫下表達(dá)增強(qiáng)，超表達(dá)植株比野生型對(duì)鹽、冷和干旱脅迫的耐受性更強(qiáng)[9]。而在擬南芥中，AtMYB30、AtMYB60和AtMYB96（亞家族1）[10-12]，AtMYB13和AtMYB15（亞家族2）[13]，AtMYB102和AtMYB41（亞家族11）[14-15]，AtMYB33和AtMYB101（亞家族18）[16]，AtMYB2、AtMYB62和AtMYB108（亞家族20）[17]，AtMYB44、AtMYB70、AtMYB73和AtMYB77（亞家族22）[18-19]等均參與調(diào)控生物和非生物脅迫響應(yīng)途徑。菊花R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子CmMYB2不僅參與非生物脅迫應(yīng)答，還參與調(diào)控菊花和擬南芥開(kāi)花[19-20]。本研究根據(jù)轉(zhuǎn)錄組序列克隆雞爪槭R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，并對(duì)其基因和編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，利用熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)其基因在不同組織和非生物脅迫下的表達(dá)進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究雞爪槭R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)非生物脅迫和開(kāi)花機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料及處理方式

供試雞爪槭品種金陵黃楓種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院槭樹(shù)良種基地。取當(dāng)年生新鮮枝條作為外植體，通過(guò)組織培養(yǎng)快繁獲得無(wú)菌幼苗，將幼苗練苗并移栽到穴盤(pán)中培養(yǎng)。取生長(zhǎng)一致的約10 cm左右的幼苗用于低溫（4 ℃）處理和高溫（40 ℃）處理。將組織培養(yǎng)獲得的幼苗在Hoaglands營(yíng)養(yǎng)液中水培，取生長(zhǎng)一致的約10 cm左右的幼苗用于鹽脅迫（200 mmol/L NaCl）處理和干旱（20% PEG6000）處理。4種非生物脅迫處理均以上午9∶00為0 h，分別在0 h、1 h、4 h、8 h、12 h和24 h取樣。低溫處理和高溫處理取樣部位為第3和第4片完全展開(kāi)葉，鹽脅迫處理和干旱處理取樣部位為不定根，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。未處理的穴盤(pán)苗和水培小苗植株，取其根、莖和葉片，立即放入液氮中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，每個(gè)組織3個(gè)重復(fù)。將3周齡的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系置于光照培養(yǎng)箱（Sanyo，MIR-154）4 ℃處理24 h，-9 ℃處理6 h后，轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)條件的光培箱培養(yǎng)14 d，統(tǒng)計(jì)觀察成活率。培養(yǎng)條件為光周期16 h/8 h（光照/黑暗），溫度22 ℃/18 ℃，光照度200 μmol/（m2·s），相對(duì)濕度為70%。

1.2總RNA提取及cDNA合成

總RNA提取使用Trizol（TaKaRa， Tokyo， Japan）提取法，使用RNase-free DNase I（TaKaRa公司產(chǎn)品）去除基因組DNA。取1 μg總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV反轉(zhuǎn)錄獲得cNDA備用。

1.3雞爪槭金陵黃楓ApMYB306基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

從雞爪槭轉(zhuǎn)錄組庫(kù)（SRX833686 ULRs： http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/）中查找獲得雞爪槭ApMYB306 cNDA全長(zhǎng)序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)ApMYB306全長(zhǎng)引物和RT-PCR引物。利用高保真酶Ex Taq（TaKaRa公司產(chǎn)品）進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得ApMYB306 cNDA全長(zhǎng)序列，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接pMD19-T載體（TaKaRa公司產(chǎn)品）進(jìn)行測(cè)序，獲得ApMYB306在雞爪槭金陵黃楓中的cNDA全長(zhǎng)序列。將ApMYB306開(kāi)放閱讀框（ORF）使用含有酶切位點(diǎn)BamH I和Not I序列的引物擴(kuò)增，同時(shí)使用BamH I和Not I對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和pENTR1A（Invitrogen， Carlsbad， CA， USA）進(jìn)行雙酶切。將酶切后的產(chǎn)物回收并利用連接酶T4 DNA ligase（TaKaRa公司產(chǎn)品）進(jìn)行連接，獲得載體pENTR1A-ApMYB306。將該載體進(jìn)行單酶切，使之線性化，通過(guò)LR（LR ClonaseTM II enzyme system，Invitrogen）重組構(gòu)建到pMDC43載體[21]上，最終獲得載體pMDC43-ApMYB306，提取質(zhì)粒-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4ApMYB306序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

從GenBank下載ApMYB306同源蛋白質(zhì)氨基酸序列，與ApMYB306氨基酸序列共同使用ClustalW軟件進(jìn)行多重比對(duì)分析[22]。使用MEGA 7.0軟件，基于Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5ApMYB306亞細(xì)胞定位

通過(guò)基因槍?zhuān)≒DS-100， Bio-Rad， Hercules， CA， USA）轟擊洋蔥表皮細(xì)胞，將2 μg質(zhì)粒pMDC43-ApMYB306和pMDC43空載（對(duì)照）分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮細(xì)胞在MS（Murashige and Skoog）培養(yǎng)基上23 ℃暗培養(yǎng)16 h，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡（LSM800， Zeiss， Germany）觀察GFP蛋白的表達(dá)情況。

1.6ApMYB306基因表達(dá)分析

利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)ApMYB306基因進(jìn)行表達(dá)分析，使用ApActin基因（MN026864）作為內(nèi)參基因。每個(gè)qPCR體系終體積為20.0 μl，均由10.0 μl SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa公司產(chǎn)品），0.4 μl上游和下游引物（10 μmol/L）（F：5′-TGTCCCCTGAAAAACCAAATA-3′;R：5′-TTCCTCCCCCATCAGCAAA-3′），5.0 μl模板cDNA（1 ng/μl）和0.4 μl ROX組成。使用Real Time PCR熒光定量?jī)x（Applied Biosystems 7500， Carlsbad， CA， USA）進(jìn)行相對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s 40個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s[23]。使用2-△△Ct方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)反應(yīng)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.7轉(zhuǎn)ApMYB306基因擬南芥

將構(gòu)建好的質(zhì)粒pMDC43-ApMYB306轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，利用蘸花法侵染擬南芥花序，在含有潮霉素（Hygromycin）的培養(yǎng)基上篩選獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系。選擇2個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系用于表型分析。

1.8ApMYB306與擬南芥AtFT啟動(dòng)子結(jié)合性試驗(yàn)

將1.0 kb的AtFT啟動(dòng)子構(gòu)建到pCAMBIA1381-LUC載體，與pMDC43-ApMYB306分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，將含有陽(yáng)性質(zhì)粒的農(nóng)桿菌和增強(qiáng)表達(dá)菌株P(guān)19培養(yǎng)至OD值1.5左右。然后離心，收集菌體，將菌體使用侵染緩沖液[10 mmol/L 2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES）、50 mmol/L MgCl2和100 μmol/L 乙酰丁香酮（AS）]重懸。根據(jù)試驗(yàn)要求將含有不同載體的菌液混合，同時(shí)在每一個(gè)組合中添加菌株P(guān)19。將混合后的菌液離心，黑暗靜止3 h，然后注射煙草葉片。注射后的煙草暗培養(yǎng)1 d，光培養(yǎng)2 d后摘下侵染葉片，在背面噴施熒光素酶（LUC）底物甲蟲(chóng)熒光素（Beetle luciferin），暗處理5 min，使用天能化學(xué)發(fā)光儀器5200Multi進(jìn)行曝光拍照。

1.9數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016和SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理及分析，差異顯著性采用ANOVA分析，Duncans檢驗(yàn)（P<0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1ApMYB306基因堿基序列

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組中的序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)特異引物，以雞爪槭金陵黃楓cDNA為模板，利用高保真酶PCR技術(shù)獲得一個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的全長(zhǎng)序列，通過(guò)同源比對(duì)和生物信息學(xué)分析將其命名為ApMYB306。ApMYB306開(kāi)放閱讀框（ORF）具有1 065 bp，編碼一條355個(gè)氨基酸殘基的多肽。推測(cè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量約為3.967×104，理論等電點(diǎn)為6.35。將ApMYB306基因編碼的氨基酸序列在NCBI站點(diǎn)進(jìn)行BLASTp比對(duì)，發(fā)現(xiàn)ApMYB306編碼的氨基酸序列與龍眼（Dimocarpus longan）MYB22基因（Accession Number：QCH41134.1）、柑桔（Citrus macrophylla）MYB60基因（Accession Number：ABK59039.1）、小柑桔（Citrus clementina）MYB306基因（Accession Number：XP_006431144.1）、葡萄（Vitis vinifera）MYB306基因（Accession Number：XP_002283575.1）、榴蓮（Durio zibethinus）MYB306基因（Accession Number：XP_022751922.1）、哥倫比亞錦葵（Herrania umbratica）MYB306基因（Accession Number：XP_021297573.1）和可可（Theobroma cacao）MYB306基因（Accession Number：XP_007032529.1）編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)（圖1），同源性依次為78.99%、67.5%、65.57%、66.95%、65.66%、67.80%、67.80%。ApMYB306蛋白分別在14～63 aa和67～111 aa處含有2個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域，為典型的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。另外將ApMYB306蛋白氨基酸序列與其他物種中的同源序列進(jìn)行多重比較，并進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中可以看出ApMYB306與龍眼DlMYB22親緣關(guān)系最近，推測(cè)其可能具有類(lèi)似的功能（圖2）。

2.2ApMYB306基因組織表達(dá)特性及定位

取雞爪槭幼苗根、莖和葉提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析ApMYB306基因在不同組織中的表達(dá)。結(jié)果表明，ApMYB306基因在莖中表達(dá)量最高，葉片次之，根中表達(dá)量最低（圖3）。

為了檢測(cè)ApMYB306蛋白的亞細(xì)胞定位情況，本研究在洋蔥表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)了p35S：：GFP-ApMYB306。結(jié)果表明ApMYB306蛋白在細(xì)胞核中積累。同時(shí)，在整個(gè)細(xì)胞中都觀察到了陽(yáng)性對(duì)照p35S：：GFP瞬時(shí)表達(dá)產(chǎn)生的GFP信號(hào)（圖4）。

各氨基酸來(lái)源及序列登錄號(hào)為：DlMYB22（龍眼QCH41134.1）、CmMYB60（柑桔ABK59039.1）、CcMYB306（小柑桔XP_006431144.1）、VvMYB306（葡萄XP_002283575.1）、DzMYB306（榴蓮XP_022751922.1）、HuMYB306（哥倫比亞錦葵XP_021297573.1）和TcMYB306（可可XP_007032529.1）。

2.3ApMYB306基因在不同脅迫處理下的表達(dá)

2.3.1ApMYB306基因在低溫和高溫脅迫下的表達(dá)如圖5所示，ApMYB306基因表達(dá)受低溫（4 ℃）和高溫（40 ℃）誘導(dǎo)。ApMYB306基因在低溫和高溫條件下，表達(dá)量均在24 h內(nèi)持續(xù)升高，并在24 h表達(dá)量達(dá)到最高值，分別是0 h表達(dá)量的8.9倍和5.8倍，表明ApMYB306基因受低溫和高溫脅迫顯著誘導(dǎo)。

2.3.2ApMYB306基因在鹽和干旱脅迫下的表達(dá)如圖6所示，在200 mmol/L NaCl處理下，ApMYB306基因被迅速誘導(dǎo)表達(dá)，在處理8 h后，ApMYB306表達(dá)量達(dá)到最高值，是0 h表達(dá)量的3.1倍，隨后表達(dá)量略有降低，但仍高于對(duì)照。ApMYB306基因在20% PEG6000模擬干旱條件下，表達(dá)量迅速升高，并在處理8 h后ApMYB306表達(dá)量達(dá)到最高值，隨后逐漸降低，表明ApMYB306基因受鹽和干旱脅迫誘導(dǎo)顯著。

2.4ApMYB306超表達(dá)擬南芥的抗凍性和開(kāi)花期變化

將獲得的ApMYB306超表達(dá)擬南芥陽(yáng)性株系進(jìn)行篩選和鑒定，選取表達(dá)量最高的2個(gè)獨(dú)立株系用于后續(xù)功能鑒定。如圖7所示，對(duì)野生型和ApMYB306超表達(dá)擬南芥株系（35S：：ApMYB306-1、35S：：ApMYB306-2）進(jìn)行冷凍處理后，ApMYB306超表達(dá)擬南芥株系較野生型成活率明顯升高。推測(cè)ApMYB306基因提高了擬南芥的抗凍性。

對(duì)ApMYB306超表達(dá)擬南芥株系（35S：：ApMYB306-1、35S：：ApMYB306-2）進(jìn)行表型觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，ApMYB306超表達(dá)擬南芥較野生型擬南芥開(kāi)花延遲（圖8）。野生型擬南芥在播種后（36.6±1.2） d開(kāi)花，而35S：：ApMYB306-1、35S：：ApMYB306-2則分別在播種后（42.3±1.5） d和（41.5±1.1） d開(kāi)花（圖8b）。測(cè)量野生型和ApMYB306超表達(dá)擬南芥株系的蓮座葉數(shù)量，發(fā)現(xiàn)野生型蓮座葉數(shù)量為12.2±0.9，而35S：：ApMYB306-1、35S：：ApMYB306-2蓮座葉數(shù)量多于野生型，分別為16.1±1.2和15.7±1.1（圖8c）。對(duì)開(kāi)花關(guān)鍵基因AtFT和AtFLC的表達(dá)進(jìn)行熒光定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)AtFT的表達(dá)量在ApMYB306超表達(dá)擬南芥株系中明顯降低（圖8d），AtFLC的表達(dá)量則無(wú)明顯變化（圖8e）。

將擬南芥AtFT 1.0 kb長(zhǎng)度的啟動(dòng)子序列構(gòu)建到無(wú)啟動(dòng)子、下游具有LUC標(biāo)簽的載體上，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，與ApMYB306共同侵染煙草葉片，暗培養(yǎng)1 d，光照培養(yǎng)2 d后噴施LUC底物，用CCD冷凍相機(jī)觀察。結(jié)果表明，陰性對(duì)照（只加AtFTpro）亮度較強(qiáng)，添加ApMYB306后，亮度變?nèi)?，說(shuō)明ApMYB306與AtFT啟動(dòng)子結(jié)合，并抑制了其表達(dá)（圖9）。推測(cè)ApMYB306可能通過(guò)抑制AtFT啟動(dòng)子表達(dá)使得ApMYB306超表達(dá)擬南芥株系開(kāi)花延遲，其調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3討論

隨著全球環(huán)境的不斷惡劣，干旱、洪澇等極端天氣頻現(xiàn)。植物的生長(zhǎng)受逆境脅迫影響越來(lái)越嚴(yán)重。因此尋找抗逆脅迫下的應(yīng)答基因，解析其分子調(diào)控機(jī)制，是進(jìn)行植物抗逆分子改良與育種的前提。本研究從雞爪槭金陵黃楓中克隆獲得了一個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子含有2個(gè)MYB保守結(jié)構(gòu)域，屬于R2R3-MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)氨基酸序列比對(duì)和生物信息學(xué)分析將其命名為ApMYB306。

研究結(jié)果表明，不同的MYB家族成員具有不同的組織表達(dá)特性，可能在不同的組織器官中發(fā)揮重要作用。如柳枝稷PvMYB4在根、莖、葉、葉鞘和花序中均有表達(dá)，但在葉和葉鞘中表達(dá)量最高[24]。大部分的番茄R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子基因在根、莖、葉和果實(shí)中均有表達(dá)，但表達(dá)水平不同，如SlMYB16在莖、葉和未成熟的果實(shí)中表達(dá)量都很高，但在根中表達(dá)量相對(duì)較低，SlMYB2、SlMYB20、SlMYB29、SlMYB43、SlMYB45、SlMYB53、SlMYB58、SlMYB73、SlMYB74、SlMYB79、SlMYB92、SlMYB93和SlMYB102在根中的表達(dá)量則高于其他組織器官[6]。ApMYB306在根、莖和葉中均有表達(dá)，但在莖和葉中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于根中的表達(dá)量。轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子部位，進(jìn)而激活或抑制靶基因的表達(dá)，該過(guò)程發(fā)生于細(xì)胞核中，因此轉(zhuǎn)錄因子必須要進(jìn)入細(xì)胞核中，才能發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基本功能。我們通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)洋蔥表皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ApMYB306蛋白定位于細(xì)胞核中，具有調(diào)控轉(zhuǎn)錄的基本條件。越來(lái)越多的證據(jù)表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子家族在參與植物脅迫應(yīng)答調(diào)控中起著關(guān)鍵作用[18，25-26]。水稻OsMYB55通過(guò)直接激活谷氨酸代謝途徑基因GS1、GAT1和GAD1提高對(duì)高溫脅迫的抗性，超表達(dá)OsMYB55可提高在高溫脅迫下的產(chǎn)量[25]。擬南芥AtMYB44負(fù)調(diào)控SOS2的基因ABI1、ABI2、PP2CA、HAB1和HAB2，使得超表達(dá)擬南芥對(duì)干旱和鹽脅迫的抗性增強(qiáng)[18]。小麥TaMYB33響應(yīng)ABA調(diào)控的脅迫應(yīng)答，超表達(dá)擬南芥株系耐旱性和耐鹽性增強(qiáng)，這些是通過(guò)TaMYB33提高細(xì)胞活性氧的清除能力和積累滲透壓調(diào)節(jié)物實(shí)現(xiàn)的[26]。桃PpMYB3的表達(dá)量變化則與溫度的變化趨勢(shì)一致，推測(cè)PpMYB3可能負(fù)調(diào)控桃的抗寒性[27]。小麥TaMYB165在小麥苗期和灌漿期均響應(yīng)熱脅迫，熱脅迫處理后，過(guò)表達(dá)擬南芥株系較野生型成活率升高[28]。燕子花IlMYB306也參與了非生物脅迫的調(diào)控[29]。本研究通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)分析了ApMYB306在不同脅迫下的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)ApMYB306受高溫、低溫、干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，在該4種脅迫誘導(dǎo)下表達(dá)量明顯上調(diào)，暗示ApMYB306參與了脅迫響應(yīng)過(guò)程，但其響應(yīng)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

開(kāi)花是高等植物生活史的重要過(guò)程[30-32]，目前已知的調(diào)控植物開(kāi)花的主要途徑有：光周期途徑（Photoperiod pathway）、春化途徑（Vernalization pathway）[33]、赤霉素途徑（Gibberellin pathway）和自主途徑（Autonomous pathway）[34]。研究結(jié)果表明，多個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子參與了開(kāi)花時(shí)間的調(diào)節(jié)。菊花CmMYB2超表達(dá)株系開(kāi)花提前，CmMYB2通過(guò)赤霉素途徑調(diào)控菊花開(kāi)花[20]。楊樹(shù)PtrMYB192基因超表達(dá)擬南芥株系較野生型開(kāi)花延遲，其中春化途徑關(guān)鍵基因FLC表達(dá)量升高，而光周期途徑關(guān)鍵基因CO表達(dá)量降低[35]。擬南芥MYB30通過(guò)直接調(diào)節(jié)FT基因的表達(dá)調(diào)控開(kāi)花[36]。本研究ApMYB306超表達(dá)擬南芥株系較野生型開(kāi)花延遲，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ApMYB306可結(jié)合擬南芥FT的啟動(dòng)子序列，并抑制其表達(dá)，F(xiàn)T基因是開(kāi)花途徑的整合子，推測(cè)ApMYB306通過(guò)抑制FT的表達(dá)調(diào)節(jié)擬南芥開(kāi)花。相關(guān)研究結(jié)果為ApMYB306進(jìn)一步的功能研究奠定了基礎(chǔ)，為培育雞爪槭抗逆和不同花期新種質(zhì)提供了候選基因。

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