雷帕霉素眼用緩釋膜的制備及體外釋放分析

顏志超，游秀華，鄧彩彬

（1.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院眼科，廣東廣州 510260；2.中山大學藥學院，廣東廣州 510006；3.中山大學中山眼科中心眼科學國家重點實驗室，廣東廣州 510060）

青光眼是世界上第一位不可逆致盲眼?。?］，雖然青光眼的治療手段有很多，但降低眼內壓是目前最明確的治療手段［1-3］。多數患者早期可以通過藥物控制眼壓，但到了后期仍然需要接受手術降眼壓治療［1，4］。濾過性手術是目前治療青光眼最常用的手術方式［4-5］，然而濾過泡瘢痕化則是導致手術失敗的主要原因［6］，因此抗濾過泡瘢痕化已成為當前的研究熱點。盡管目前應用于濾過區(qū)抗瘢痕形成的藥物很多，例如絲裂霉素C（mito?mycin C，MMC）［6-7］和5-氟尿嘧啶（5-FU）［6，8］，但是，這些藥物的應用可能導致術后持續(xù)性低眼壓、角膜上皮損傷、眼內炎、濾過泡滲漏、白內障［2，9-14］等諸多并發(fā)癥的發(fā)生，且遠期效果不理想。因此，尋找一種安全、有效、低毒、作用持久的藥物一直是青光眼研究領域的重要課題之一。雷帕霉素（rapamycin，RAPA）又稱西羅莫司（sirolimus），是從吸水性鏈霉素發(fā)酵液中提取的三烯大環(huán)內酯類抗排斥藥物，是目前最新的強效免疫抑制劑之一［15-16］，具有低毒、高效的特性［17］，臨床上已用于自身免疫性疾病和器官移植后抗排斥反應的治療［16-18］。有研究［19］表明，RAPA對人Tenon′s囊成纖維細胞的有較強的抑制作用，因此它極有可能成為理想的抗瘢痕增殖的新藥。根據青光眼濾過術后傷口的愈合過程可知，術后2周內為成纖維細胞增生最活躍的時期［19］，由此我們設計以具有良好生物相容性的PLGA作為載體，制備RAPA藥物緩釋膜，擬在術中置入手術區(qū)域的Tenon′s囊下，使RAPA能夠持續(xù)穩(wěn)定地釋放，在局部達到一定的有效濃度，從而控制術后成纖維細胞的增殖達15 d之久。因此，本研究通過研制RAPA眼用緩釋膜，并對該緩釋膜的藥物含量進行測定及體外釋放進行驗證研究。

1 材料與方法

1.1 RAPA眼用緩釋膜的制備

用精密分析天平（925M-202A-DRSCS PRE?CISA）稱取聚乙二醇-4000（PEG-4000，化學純，廣東汕頭市西隴化工廠）36 mg于5 mL離心管中，加入1.5 mL二氯甲烷，用渦旋混合器（Scientific industries Vortexgenie2）渦旋溶解。

稱取PLGA 50：50 poly（DL-Lactide-co-Gly?colide，特性粘度0.55～0.75 dL/g，Durect Corpora?tion Birmingham）42 mg，PLGA 50：50 poly（DLLactide-co-Glycolide，特性粘度0.17 dL/g，Durect Corporation Birmingham）15.6 mg，RAPA 14 mg于2 mL離心管中，加入1.1.1中溶液600 μL，渦旋溶解10 min，靜置5 min，將制得的溶液均勻滴加到載玻片中，置于通風櫥中3 d，待溶劑揮干，脫膜。將制得的膜片裁剪成2.5 mm×2.5 mm小片（圖1），即得。

1.2 緩釋膜中RAPA含量測定方法學的建立

1.2.1 色譜條件 使用高效液相色譜儀（Agilent 1200美國）和色譜柱GraceSMart RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相設置為：甲醇∶水為80∶20，檢測波長為278 nm，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL，柱溫為45 ℃。

1.2.2 RAPA標準曲線制備 用精密稱取RAPA固體粉末（090901LP，純度99.5%，杭州中美華東制藥有限公司）10.2 mg于10 mL容量瓶中，用適量無水乙醇溶解，并定容至刻度，即得濃度為1.02 mg/mL RAPA無水乙醇溶液。

取1.02 mg/mL RAPA標準液2 mL，于25 mL棕色容量瓶中，用體積分數0.3%十二烷基硫酸鈉（SDS，分析純，天津福晨化學試劑廠）溶液定容至刻度，即得濃度為81.6 μg/mL RAPA儲備液。

分別取RAPA標準儲備液5、2.5、1.25 mL，和625、250、125、50 μL于10 mL容量瓶中，加體積分數0.3% SDS溶液定容至刻度，即得濃度為40.8、20.4、10.20、5.1、2.04、1.02和0.408 μg/mL RAPA標準液。注意避光操作。取上述標準液10 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積對RAPA濃度進行線性回歸。

1.2.3 專屬性考察 取PLGA空白膜，加入0.5 mL乙腈溶解，取0.25 mL于10 mL容量瓶中，加體積分數0.3% SDS溶液定容至刻度，過濾，按1.2.1項色譜條件進樣分析，考察輔料對RAPA含量測定是否存在干擾。

1.2.4 回收率及精密度測定 取PLGA空白膜9片，于2 mL離心管中，分高、中、低3組，每組平行3份。高、中、低組分別加入RAPA 61.2、122.4和183.6 μg，加入乙腈至0.5 mL渦旋溶解，取0.25 mL于10 mL容量瓶中，加體積分數0.3% SDS溶液定容至刻度，過濾，按1.2.1項色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積，同時取濃度與樣品濃度接近的RAPA標準液10 μL注入色譜儀，按外標法計算回收率。

1.2.5 緩釋膜中RAPA含量測定 取RAPA緩釋眼膜6片于2 mL離心管中，加入0.5 mL乙腈渦旋溶解，取0.25 mL于10 mL容量瓶中，加0.3% SDS溶液定容至刻度，過濾，取樣品10 μL注入色譜儀進樣分析，記錄色譜圖及峰面積，同時取濃度與樣品濃度接近的RAPA標準液10 μL注入色譜儀，按外標法計算膜片中RAPA含量。

1.2.6 RAPA穩(wěn)定性測定 分別于0、1、5、10和15 d進樣測定，考察RAPA在0.3% SDS溶液中的穩(wěn)定性。

1.3 RAPA眼用緩釋膜體外釋放考察

1.3.1 RAPA在不同溶劑中的溶解度考察 取過量的RAPA固體粉末，分別加入2 mL體積分數0.1%、0.5%失水山梨醇單油酸酯聚氧乙烯醚（Tween-80，化學純，天津市百世化工有限公司）及體積分數20%乙醇、30%乙醇、0.3%SDS渦旋溶解5 min，再放入37 ℃水浴恒溫振蕩器（SHA-B江蘇省金壇市宏華儀器廠）中，以100 r/min（r=25 mm）振搖48 h，離心取上清液，稀釋，按1.2.1項下色譜條件進樣分析。

1.3.2 RAPA眼用緩釋膜體外釋放 取RAPA眼膜1片 于20 mL西林瓶中，加 入0.3% SDS溶液10 mL，封口，置于37 ℃的水浴恒溫振蕩器中，轉速100 r/min（r=25 mm），分別于第0、1、2、3、5、8、11和15 d取出樣品0.5 mL，再加入新鮮介質0.5 mL。樣品液過濾，按1.2.1項下色譜條件進樣分析，平行測定3份。

1.4 數據處理

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。數值變量符合正態(tài)分布以（）描述，不符合正態(tài)分布以中位數和四分位數間距描述，分類變量以例數（n）及其百分比（%）描述。RAPA濃度與峰面積的關系采用簡單線性回歸，R2＞0.99提示呈良好的線性關系。RAPA在不同溶劑中的溶解度考察以及RAPA眼用緩釋膜體外釋放結果比較，不同組別之間數值變量比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），有統(tǒng)計學差異的兩兩比較使用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 RAPA緩釋膜的特性及RAPA含量測定

2.1.1 RAPA標準曲線 經線性回歸得出RAPA標準曲線?？芍猂APA濃度在0.408～40.8 μg/mL范圍內，與峰面積呈良好的線性關系（圖2）。

2.1.2 專屬性考察 藥膜中輔料及0.3% SDS溶液對RAPA含量測定沒有干擾，含量測定專屬性好（圖3）。

2.1.3 回收率及精密度測定 高濃度藥物含量組的回收率為100.34%～105.43%，平均回收率為103.35%，精密度為2.58%；中濃度藥物含量組的回收率為98.08%～103.32%，平均回收率為101.47%，精密度為2.90%；低濃度藥物含量組的回收率為101.69%～106.01%，平均回收率為103.67%，精密度為2.41%（表1）。

2.1.4 緩釋膜中RAPA含量測定結果 緩釋膜中RAPA的含量在98.68～125.34 μg之間，平均含量為（112.6±10.1）μg/片，RSD為8.99%（表2）。

圖3 專屬性考察Fig.3 Specificity test of RAPA

表1 回收率及精密度測定Table 1 Test of recovery and relative standard deviation（RSD）

表2 緩釋膜中RAPA含量測定Table 2 Determination of drug content of the sustained release film

2.1.5 RAPA穩(wěn)定性測定 通過RAPA穩(wěn)定性測定表明，以0.3% SDS溶液為釋放介質的RAPA在0～15 d的峰面積為101.5～112.3，平均約107.4，提示以0.3%SDS溶液為釋放介質的RAPA在15 d內穩(wěn)定性好（表3）。

表3 RAPA穩(wěn)定性測定Table 3 Stability test of RAPA

2.2 RAPA眼用緩釋膜體外釋放分析結果

2.2.1 RAPA在不同溶劑中的溶解度考察 RAPA在20%乙醇、30%乙醇、0.1% Tween-80、0.5%Tween-80和0.3% SDS中的溶解度分別為：（15.0±6.1）、（100.0±8.4）、（6.5±4.6）、（14.8±6.2）、（548.0±25.4）μg/mL（圖4）。統(tǒng)計學兩兩比較分析提示，RAPA在20%乙醇、0.1% Tween-80、0.5% Tween-80中的溶解度均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），在30%乙醇、0.3%SDS中的溶解度與上述3組均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），在30%乙醇與0.3%SDS中的溶解度有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

RAPA在20%乙 醇、0.1% Tween-80、0.5%Tween-80中溶解度均較低，在30%乙醇中溶解度一般，均難達到漏槽條件，而在0.3% SDS溶液中的溶解度最大（圖4），滿足漏槽條件。

2.2.2 RAPA眼用緩釋膜體外釋放結果分析 通過RAPA眼用緩釋膜體外釋放研究發(fā)現，藥物釋放量隨時間推移逐漸增加。第1、2、3、5、8、11和第15天的峰值濃度分別為（50.97±12.28）%、（58.30±16.45）%、（57.39±12.35）%、（93.66±5.36）%、（95.46±2.98）%、（90.74±3.08）%、（90.18±3.98）%。統(tǒng)計學兩兩比較分析提示，第1、2、3天之間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），第5、8、11、15天的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），第3天與第5天的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖5）。RAPA體外釋放在第5天時基本達到峰值濃度，并持續(xù)維持至15 d。

圖4 RAPA在不同溶劑中的溶解度Fig.4 Solubility of RAPA in different solvents

圖5 RAPA眼用緩釋膜體外釋放曲線Fig.5 Release profile of RAPA sustained-release film

3 討論

通過本實驗發(fā)現，以PLGA為載體的RAPA眼用緩釋膜，其15 d內RAPA含量及穩(wěn)定性良好，同時體外釋放研究發(fā)現，藥物釋放量隨時間推移逐漸增加，在第5天左右達到峰值濃度，并持續(xù)維持至15 d左右，達到預期要求。

目前臨床上RAPA用于自身免疫性疾病和器官移植后抗排斥反應的治療以全身給藥為主，但因全身給藥而帶來的口腔潰瘍（10%～19%）、間質性肺疾?。?%～17%）、高脂血癥（30%～64%）、貧血（12%～76%）、白細胞減少（11%）、蛋白尿（10%）、淋巴水腫（6.4%～12%）等副作用不可避免［20］。常規(guī)抗青光眼手術中抗代謝藥的使用均以局部應用為主，例如MMC、5-FU在術中的應用［7-8］，且常為術中單次應用，術后除了少數眼部并發(fā)癥外，未見全身嚴重并發(fā)癥報導［10，13-14］。因此本課題設計仍是以局部給藥，本實驗結果顯示每片緩釋膜的RAPA平均含量很低為（112.6±10.1）μg，給藥劑量遠比全身給藥的量?。?1］，同時制成緩釋制劑，通過在青光眼濾過術區(qū)局部釋放15 d，達到局部抗瘢痕化的作用［19］。

既往很多研究表明PLGA具有良好的生物相容性，作為RAPA的常用載體已被多數人所采用［22-23］，因此本研究同樣選擇PLGA作為RAPA的載體材料。由于不同粘度PLGA降解時間不同，對藥物釋放的速度和程度有不同影響。本實驗發(fā)現，當DL-PLGA50/50的特性粘度為0.55～0.75 dL/g時，其降解時間為1～2月，而當DL-PLGA50/50的特性粘度為0.15～0.25 dL/g時，其降解時間為2～4周，但粘度偏小不易成膜，結合PLGA（特性粘度0.55～0.75 dL/g）使用容易成膜，且膜光滑無氣泡。文獻報道［24］，RAPA在37 ℃，pH為7.4的磷酸緩沖介質中半衰期僅為13 h，又由于RAPA為難溶性藥物，在水中溶解度僅為2.6 μg/mL，本實驗結果顯示RAPA在20%、30%乙醇，和0.1%、0.5%Tween-80中溶解度均較低，難達到漏槽條件，而在0.3% SDS溶液中的溶解度最大，滿足漏槽條件，故實驗選擇對RAPA穩(wěn)定，且能達到漏槽條件的0.3% SDS溶液作為RAPA眼膜體外釋放介質。我們的動物實驗結果也表明［19］，RAPA眼用緩釋膜在兔子抗青光眼手術后濾過泡的抗瘢痕化的作用明顯，術后濾過泡形態(tài)可維持至28 d后，術后房水中RAPA的有效藥物濃度維持時間達2周以上，且無出現術后并發(fā)癥，而空白組和術中單用RAPA棉片浸泡組其濾過泡均在1周內消失，因此，該RAPA眼用緩釋膜可明顯提高抗青光眼手術成功率。

綜上所述，一定行為學參數的RAPA眼用緩釋膜具有良好的緩釋性能，具有青光眼術后抗瘢痕化的應用潛力。