武夷山不同土壤利用類(lèi)型土壤氨氧化微生物群落的季節(jié)動(dòng)態(tài)

李巍 黃彪 黃敏敏 劉文靜 郭嘉 林香信

摘要：【目的】研究不同土地利用方式下土壤氨氧化微生物多樣性的季節(jié)響應(yīng)，以期了解武夷山不同土壤利用類(lèi)型氨氧化微生物群落特征和季節(jié)變化?！痉椒ā吭诟＝ㄊ∥湟纳降某＞G闊葉林區(qū)域，分別采集同一緯度下未被開(kāi)發(fā)利用的原始林地和已被開(kāi)發(fā)利用的茶園土壤，利用Illumina Hiseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)土壤氨氧化微生物的相對(duì)豐度及多樣性進(jìn)行分析，同時(shí)測(cè)定土壤理化性質(zhì)，并對(duì)二者進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析?！窘Y(jié)果】（1）武夷山常綠闊葉林土壤含有豐富的氨氧化微生物資源，不同土地利用方式下土壤氨氧化微生物在Family水平相似，主要包括氨氧化古菌界的Unclassified CandidatusⅣitrososphaera、 Unclassified Crenarchaeota、 Unclassified Thaumarchaeota、Nitrosopumilus、Others;氨氧化細(xì)菌界的Nitrosomonas、Nitrosospira

Unclassified Nitrosomonadaceae、Others，其中茶園擁有獨(dú)特的Ⅳitrosovibrio（亞硝化葉菌屬）存在。（2）武夷山林地和茶園氨氧化微生物相對(duì)豐度有顯著變化且隨季節(jié)變化顯著。（3）土壤氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)性分析表明，不同的環(huán)境因子對(duì)土壤氨氧化細(xì)菌和土壤氨氧化古菌的影響不同，且不同季節(jié)的主要影響因子也存在差異，有效鉀是影響氨氧化細(xì)菌變化的主要環(huán)境因子，而銨態(tài)氮是影響氨氧化古菌的主要環(huán)境因子?！窘Y(jié)論】隨季節(jié)變化武夷山常綠闊葉林土壤氨氧化微生物多樣性呈現(xiàn)出規(guī)律性變化，不同土地利用方式對(duì)氨氧化微生物種類(lèi)影響不大，但對(duì)其種群的相對(duì)豐度及季節(jié)相對(duì)豐度影響較大。

關(guān)鍵詞：Illumina Hiseq高通量測(cè)序;不同土地利用方式;氨氧化細(xì)菌;氨氧化古菌

中圖分類(lèi)號(hào)：S 154

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-0384（ 2020） 10-1119-12

0 引言

【研究意義】武夷山具有世界同緯度上現(xiàn)存面積最大、保存最完整的地帶性常綠闊葉林群落，是武夷山分布面積最廣、最具代表性的森林生態(tài)系統(tǒng)，具有豐富的生物資源和優(yōu)良的自然環(huán)境，是研究生物多樣性的優(yōu)勢(shì)自然基地[1]。氮素既是樹(shù)木生長(zhǎng)最主要的限制因子，直接影響土壤質(zhì)量以及森林植被的生產(chǎn)力，又會(huì)影響生態(tài)環(huán)境的變化（如酸雨、溫室效應(yīng)、硝態(tài)氮淋溶導(dǎo)致的水體富營(yíng)養(yǎng)化等）[2-7]。硝化作用是土壤氮循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，對(duì)土壤氮素轉(zhuǎn)化、吸收等過(guò)程有重要意義[8]。土壤微生物在土壤硝化過(guò)程中發(fā)揮著決定性作用，其中氨氧化細(xì)菌（ Ammonia-oxidizing bacteria，AOB）和氨氧化古菌（ Ammonia-oxidizing archaea，AOA）是土壤氮循環(huán)的重要驅(qū)動(dòng)者，也是硝化速率限制性步驟的關(guān)鍵微生物[9-16]。因此，在林地生態(tài)系統(tǒng)中氮循環(huán)過(guò)程與土壤氨氧化微生物多樣性密切相關(guān)[17]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了對(duì)不同森林類(lèi)型土壤氨氧化微生物群落多樣性的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)在森林土壤中氨氧化古菌是最豐富的氨氧化微生物，土壤中氨氧化古菌的amoA基因數(shù)量比氨氧化細(xì)菌高出2～3個(gè)數(shù)量級(jí)[18]，但也有研究證明氨氧化古菌主導(dǎo)了蘇格蘭典型農(nóng)田土壤氨氧化過(guò)程[19]。不同利用方式對(duì)草原氨氧化微生物的研究中發(fā)現(xiàn)放牧和圍封樣地的氨氧化古菌豐度均高于氨氧化細(xì)菌豐度[20]。四川南充市不同利用類(lèi)型的土壤理化性質(zhì)差異顯著，氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯的分異特征[21]。前人研究表明，耕作方式、施肥和種植不同作物等都會(huì)影響土壤的氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)[22]。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展的需要，許多林地被開(kāi)發(fā)利用，使土地利用方式發(fā)生了變化，造成土地退化和土壤生態(tài)功能的改變?nèi)找鎳?yán)重，土壤利用或管理方式的變化也逐漸引起了廣大學(xué)者的關(guān)注[21-25]。武夷山林地改茶園的現(xiàn)象較為普遍，且據(jù)Zulkamaen等[26]的研究發(fā)現(xiàn)在紅壤地區(qū)由于土地利用和管理方式的改變會(huì)降低土壤有機(jī)質(zhì)含量，同時(shí)會(huì)加劇土壤酸化，茶園的AOB豐度大于森林?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前針對(duì)酸性森林土壤中氨氧化古菌對(duì)硝化過(guò)程貢獻(xiàn)的研究雖有相關(guān)報(bào)道[17，20，22]，但對(duì)于不同土壤利用類(lèi)型下森林土壤氨氧化群落結(jié)構(gòu)的變化研究報(bào)道甚少。土地利用方式的改變是如何改變土壤氨氧化微生物，從而影響硝化作用和反硝化作用的生理機(jī)制還有待進(jìn)一步研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采用土壤分析化學(xué)和Illumina Hiseq高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，研究武夷山常綠闊葉林不同土壤利用類(lèi)型對(duì)土壤氨氧化微生物群落多樣性的影響及其季節(jié)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，探討不同環(huán)境因子對(duì)土壤氨氧化微生物群落多樣性及季節(jié)動(dòng)態(tài)變化的影響，以期了解氨氧化微生物在武夷山常綠闊葉林森林生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)中的作用，為維持武夷山自然生態(tài)系統(tǒng)平衡提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究樣地選自武夷山市星村鎮(zhèn)四新村附近常綠闊葉林下兩種土壤利用類(lèi)型（山地和茶園）的地塊（27°35'24.23”N，1 17°45'55.43”E），淘拔450—580m.該區(qū)域?qū)俚湫偷膩啛釒Ъ撅L(fēng)濕潤(rùn)氣候，年均溫17.0～18.4℃，年均相對(duì)濕度75%～84%，年降水量1 800mm，年均日照時(shí)數(shù)1 910.2 h，無(wú)霜期227～246 d[1]。土壤以黃壤和紅壤為主，武夷山常綠闊葉林未開(kāi)發(fā)利用原始林地的森林植被種類(lèi)組成復(fù)雜，呈復(fù)層結(jié)構(gòu)，優(yōu)勢(shì)種為米櫧（Castanopsis carlesii）、甜櫧（Castanopsis eyrei）、木荷（Schima superba）等;已被開(kāi)墾的茶園區(qū)域，常年種植肉桂、水仙、105、304等品種的巖茶。

1.2 土壤樣品采集

采集同一生境下兩種不同土地利用方式的土壤為研究對(duì)象：未開(kāi)發(fā)利用的林地（SD）和相鄰開(kāi)發(fā)利用的茶園（CY），茶園每年施用復(fù)合肥一次。根據(jù)不同季節(jié)設(shè)定取樣時(shí)間為秋季2015年9月18日、冬季2015年12月22日，春季2016年3月29日、夏季2016年6月21日，共采樣4次，分別采集不同土壤利用類(lèi)型的表層土壤（0～10 cm），每種利用方式土壤選取3個(gè)樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)采用隨機(jī)取點(diǎn)法取樣，混合均勻后取1kg裝入滅菌袋中，在4℃冷藏箱保存并盡快帶回實(shí)驗(yàn)室，挑根去石礫，將土樣分成2份，一份置于超低溫冰箱（一70℃）中保存，用于土壤微生物多樣性分析;另一份自然風(fēng)干后過(guò)篩，用于土壤理化性質(zhì)分析。

1.3 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

采用凱氏定氮法測(cè)定土壤全氮;氯化鉀浸提.靛酚藍(lán)比色法測(cè)定土壤銨態(tài)氮;重鉻酸鉀氧化.外加熱法測(cè)定土壤總有機(jī)碳;冷硝酸浸提一火焰光度法測(cè)定土壤有效鉀;電位法測(cè)定土壤pH;烘干法測(cè)定土壤濕度;土壤溫濕度計(jì)測(cè)定土壤溫度。具體測(cè)定方法參考《土壤農(nóng)化分析》[27]。

土壤硝化勢(shì)的測(cè)定參照宋亞娜等[13-14]在稻田測(cè)定土壤硝化勢(shì)的方法，具體方法：稱取5 g鮮土置于50 mL離心管中，加20 mL含（NH4） 2S04濃度為1 mmol.L^-1的磷酸緩沖液，黑暗的條件下保持在室溫培養(yǎng)24 h，加入質(zhì)量濃度為10 g.L^-1KC103來(lái)抑制亞硝酸鹽氧化;培養(yǎng)完成后加入5 mL 2 mol.L^-1的KCI，提取NO2-N后離心，再用格里斯試劑比色法測(cè)定提取液中NO2_N濃度（單位：μg.g^-1.h^-1干土）。

1.4 土壤氨氧化微生物群落多樣性分析

1.4.1 土壤DNA提取和測(cè)序 將上述-70℃保存的土壤樣品進(jìn)行宏基因組DNA提取，對(duì)檢測(cè)合格的DNA樣品進(jìn)行高通量測(cè)序。土壤氨氧化細(xì)菌的測(cè)序以Illumina Hiseq 2 500 PE250為測(cè)序平臺(tái)，以土壤總DNA作為模板，土壤氨氧化細(xì)菌基因利用特異引物對(duì)AOB+ad-1（5 '-TCCCTACACG ACGCTCTTCCGATCTGGGGTTTCTACTGGTGG T-3）和AOB+ad-2（5-AGACGTGTGCT CTTCCGAT CTCCCCTCKGSAAAG CCTTCTTC-3）進(jìn)行擴(kuò)增;土壤氨氧化古菌基因利用特異引物對(duì)AOA+ad-I（5，_TCCCTACACGA CGCTCTTCCATCTSTAATGGTCTGGC TTAGACG-3）和AOA+ad-2（5-AGACGTGTGCTCT TCCGATCTGCGGCCATCC ATCTGTATGT-3'）進(jìn)行擴(kuò)增，引物由北京百邁客生物科技有限公司合成。

1.4.2土壤微生物數(shù)據(jù)分析 土壤氨氧化微生物序列分析利用QIIME software package和UPARSE pipeline完成。利用QIIME的默認(rèn)參數(shù)過(guò)濾掉低質(zhì)量、具有嵌合體結(jié)構(gòu)的序列;然后利用UPARSE軟件生成OTU（ Operational taxonomic units），利用RDP從每個(gè)OTU中選擇一條序列作為OTU代表;根據(jù)獲得的OTU數(shù)據(jù)，以測(cè)序樣本的序列數(shù)為橫坐標(biāo)，OTU值作為縱坐標(biāo)繪出每個(gè)樣品的稀釋曲線，同時(shí)根據(jù)樣本中所共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目作OTU分布Venn圖。然后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行冗余分析（ Redundancy analysis，RDA）、直接梯度分析，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度評(píng)價(jià)一個(gè)或一組變量與另一組多變量數(shù)據(jù)之間的關(guān)系。同時(shí)，通過(guò)顏色梯度來(lái)代表數(shù)據(jù)矩陣中數(shù)值的大小并根據(jù)物種或樣品豐度相似性進(jìn)行聚類(lèi)形成熱圖（ Heat map）展示。

1.5 土壤理化性質(zhì)與微生物多樣性的相關(guān)性分析

利用Excel 2010和R語(yǔ)言進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過(guò)主成分分析（ Principal Component Analysis，PCA）將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，坐標(biāo)軸能夠最大反映方差的兩個(gè)特征值，兩個(gè)樣品距離越近表示這兩個(gè)樣品的組成越相似。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同土地利用方式對(duì)土壤氨氧化微生物豐度的影響

武夷山林地土壤中的氨氧化細(xì)菌變化具有一定的規(guī)律性（圖1-A），在春季，亞硝化單胞菌屬Nitrosomonas是氨氧化細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)屬，占50.08%，但至夏季時(shí)驟然減少，僅占0.98%，秋季低至0.000 695%，冬季略微上升至0.001 16%。在春季，相對(duì)豐度第二位為Nitrosomonadaceae的其他屬，占28.7g%，但在夏季的土壤樣品中達(dá)到90.92%，在秋冬季節(jié)分別為84.03%和77.94%。在春季相對(duì)豐度第三位的細(xì)菌是亞硝化螺菌屬Nitrosospira，占2.50%，該屬在夏、秋、冬季的豐度也相對(duì)較低，分別為4.02%、9.33%、9.20%。而亞硝化葉菌屬Nitrosovibrio在四季的土壤中均未被檢出。Others部分包括了大部分未歸屬的Proteobacteria及在界分類(lèi)中未能歸屬的OTU，其在四季的相對(duì)豐度分別為18.62%、4.09%、6.63%、12.86%。

古菌界相對(duì)豐度變化比較穩(wěn)定（圖1-B），Unclassified Candidatus Nitrososphaera四季相對(duì)豐度分別為0.061%、0.021%、0.051%、0.042%;泉古菌屬Unclassified Crenarchaeota的四季相對(duì)豐度分別為1.24%、1.72%、1.38%、1.51%; UnclassifiedThaumarchaeota的四季相對(duì)豐度為4.68%、2.77%、2.8g%、3.43%，Nitrosopumilus屬相對(duì)豐度極低，僅在春季被檢出，相對(duì)豐度為0.000 167%。

武夷山茶園土壤中的氨氧化微生物在屬水平上的相對(duì)豐度較為穩(wěn)定（圖1）。細(xì)菌界中Nitrosomonadaceae下的其他屬是氨氧化細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)屬，在4個(gè)季節(jié)的樣本中分別占73.75%、65.62%、60.95%、68.61%，即該屬在春、夏、秋三季不斷減少，在冬季回升。與林地土壤不同的是，Nitrosospira是茶園土壤中的第二大屬，其變化規(guī)律與Nitrosomonadaceae下的其他屬相反，在春、夏、秋三季不斷增加，但在冬季降低。Nitrosomonas在四季中的相對(duì)豐度逐漸增加，分別為0.000 2%，0.01%，0.13%，4.74%.Nitrosovibrio的相對(duì)豐度是最低的，其規(guī)律為冬、春、夏季逐漸降低，秋季豐度最高，分別為0.005 6%、0.007 7%、0.0002 2%、0.018%。Others在四季的相對(duì)豐度分別為0.25%、0.055%、0.008 2%、0.022 8%，即在冬春季節(jié)逐漸增加，夏秋季減少。

武夷山茶園土壤中的氨氧化古菌的UnclassifiedCrenarchaeota與Unclassified Candidatus Nitrososphaera在秋、冬、春三季逐漸下降，但在夏季快速下降，變化規(guī)律與Others相反，僅在夏季表現(xiàn)出了較高的相對(duì)豐度，其中，Unclassified Crenarchaeota的四季相對(duì)豐度為1.42%、13.48%、3.32%、1.44%， UnclassifiedCandidatusNitrososphaera的相對(duì)豐度分別為0.028%、7.48%、0.30%、0.24%。

2.2不同土地利用方式對(duì)土壤氨氧化微生物組成的影響

根據(jù)武夷山林地土壤樣本不同分組繪制成OTU-Venn（韋恩）圖，通過(guò)對(duì)土壤樣品測(cè)序所得OTU（圖2）進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明：林地土壤樣品中，春季細(xì)菌界特有OTU 16個(gè)，夏季23個(gè)，秋季35個(gè)，冬季78個(gè);春季古菌界特有OTU數(shù)為8個(gè)，夏季為2個(gè)，秋季1個(gè)，冬季2個(gè)。韋恩圖能夠在一定程度上從OTU層面反映出土壤菌群的季節(jié)多樣性，利于發(fā)現(xiàn)特殊物種。從研究結(jié)果中可以看出，春季土壤古菌界中發(fā)現(xiàn)1條特有OTU，歸屬于Nitrosopumilus。由于所得OTU在RDP分類(lèi)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分類(lèi)時(shí)大部分物種無(wú)法歸類(lèi)到屬或種，導(dǎo)致特殊OTU所代表的物種無(wú)法被精確挖掘，但特殊OTU的數(shù)量可證明不同季節(jié)的樣本中存在不同的微生物。其中，春季細(xì)菌界中特有OTU中有10個(gè)被歸屬為Nitrosomonas，但也有5個(gè)OTU屬于Others，1條屬于Nitrosomonadaceae;古菌界中則有7條屬于Others，1條屬于Nitrosopumilus。

根據(jù)武夷山茶園土壤微生物文庫(kù)中的OTU繪制成韋恩圖（圖3），比較4個(gè)季節(jié)特有的OTU可知，細(xì)菌界中，春季擁有4個(gè)特殊的OTU，夏季10個(gè)，秋季1個(gè)，冬季11個(gè)。其中，春季特殊OTU中3個(gè)屬于Others，1個(gè)屬于Nitrosomonas;夏季的10個(gè)OTU中有6個(gè)被分類(lèi)為Others，1個(gè)為Nitrosomonas，3個(gè)屬于Nitrosomonadaceae的其他屬;秋季僅含的1個(gè)特殊的OTU歸屬于Others;冬季細(xì)菌界包含11個(gè)特殊OTU。古菌界中所含的特有OTU數(shù)量較少，其中，春季1個(gè)，屬于Others;夏季3個(gè)，2個(gè)OTU屬于Others，1個(gè)屬于Unclassified Crenarchaeota;秋季1個(gè)，屬于Others;冬季3個(gè)，屬于Others。雖然從RDP分類(lèi)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)得到的分類(lèi)結(jié)果無(wú)法識(shí)別出不同樣本中氨氧化微生物的特殊核心微生物，但是從所得Venn圖可知，不同樣本中存在不同的微生物。

2.3不同土地利用方式對(duì)土壤氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

根據(jù)組間PCA分析結(jié)果，在第一、第二主成分上的累積貢獻(xiàn)率大于90%，代表性強(qiáng)，在細(xì)菌界PCA圖4-A中，茶園土壤與林地土壤組內(nèi)、組間的樣本離散性都很高，說(shuō)明樣本差異性受季節(jié)及采集地影響很大。在古菌界PCA圖.B中，茶園土壤組內(nèi)樣本離散性很高，說(shuō)明樣本差異性受季節(jié)影響很大，但林地土壤樣本的離散性較小，即具有重復(fù)性，說(shuō)明樣本內(nèi)的古菌變化受季節(jié)影響較小。林地與茶園古菌組間離散型高，說(shuō)明不同采集地獲得的樣本古菌組成差異性大。

從林地土壤及茶園土壤樣品屬分類(lèi)水平上的Heat map聚類(lèi)分析（圖5），可以反映出不同季節(jié)、不同采集地樣本群落組成的相似性和差異性。由樣本細(xì)菌界熱圖聚類(lèi)結(jié)果可知，夏季林地土壤樣本與秋季林地土壤樣本具有最高的相似性，春季林地土壤與其他土壤樣本具有最大的差異性。在所有樣本中，春季林地土壤含有最高Nitrosomonas及Others豐度;夏季林地土壤中Unclasified Nitrosomonadaceae相對(duì)豐度最高;Nitrosospira在秋季茶園土壤中相對(duì)豐度最高;Nirosovibrio在冬季茶園土壤中相對(duì)豐度最高。由樣本古菌界的熱圖可知，夏季林地、秋季林地、春季茶園3個(gè)土壤樣本古菌相對(duì)豐度具有很高的相似性;夏季茶園與其他土壤樣品古菌相對(duì)豐度差異性最高，Nitrosopumilus，Unclassified CandidatusNitrososphaera，Unclassified Crenarchaeota在夏季茶園土壤樣本中相對(duì)豐度最高，Unclassified Thaumarchaeota在春季林地土壤中的豐度最高。

在氨氧化細(xì)菌界中，由于土壤耕作的利用方式不同，在相同季節(jié)，茶園土壤中Nitrosospira相對(duì)豐度總是高于林地土壤，但四季豐度變化趨勢(shì)相同，即氣候變化對(duì)Nitrosospira的影響是相同的。此外，Nitrosovibrio僅存在茶園土壤中，而不存在林地土壤中。特別的是，林地土壤中Nitrosomonas的相對(duì)豐度在春、夏季比茶園土壤多，但在秋冬季節(jié)比茶園土壤少，而茶園土壤中Nitrosomonas的相對(duì)豐度較穩(wěn)定;Unclassified Nitrosomonadaceae在林地土壤中的相對(duì)豐度波動(dòng)較大，在茶園土壤中處于較穩(wěn)定狀態(tài)。因此，在對(duì)比相同季節(jié)不同采集地樣品后可知，土壤中Nitrosomonas與Unclassified Nitrosomonadaceae的相對(duì)豐度與土地利用方式具有很大關(guān)系。

在氨氧化古菌界中，在相同季節(jié)，茶園土壤中的Nitrosopumilus的相對(duì)豐度始終比林地土壤高;林地土壤中Unclassified Thaumarchaeota相對(duì)豐度始終比茶園土壤高;在夏季時(shí)，茶園土壤中UnclassifiedCrenarchaeota及Unclassified Candidatus Nitrososphaera的相對(duì)豐度比林地土壤高出很多，而在其他季節(jié)則與林地土壤的相對(duì)豐度相似，因此，這些微生物在夏季相對(duì)豐度上升與茶園土壤的利用方式有很大關(guān)聯(lián)。

2.4 土壤氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)性分析

氨氧化微生物受多種環(huán)境因素影響，這些因素包括土壤中銨態(tài)氮濃度、pH值、溫度等[28-30]。因此，本研究測(cè)定了武夷山常綠闊葉林下林地和茶園的有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮、速效磷、有效鉀和pH值5項(xiàng)基本土壤理化性質(zhì)（表1），對(duì)5個(gè)環(huán)境因子分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到其重要性排序，以評(píng)估每個(gè)備選環(huán)境變量對(duì)相應(yīng)變量的解釋貢獻(xiàn)，其中，環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌群落在約束性排序的前兩軸的累積解釋量為61.68%，對(duì)古菌的累積解釋量為81.60%，因此，環(huán)境因子的變化能夠解釋林地土壤中氨氧化微生物的變化（表2）。

對(duì)環(huán)境因子和微生物物種之間進(jìn)行相關(guān)系數(shù)和重要性分析（表3），結(jié)果表明，環(huán)境因子對(duì)氨氧化細(xì)菌的重要性由大到小依次為有效鉀>pH值>總有機(jī)碳>銨態(tài)氮>速效磷;對(duì)氨氧化古菌結(jié)構(gòu)影響重要性大小依次為銨態(tài)氮>有效鉀>pH值>總有機(jī)碳>速效磷。由此可知，環(huán)境中的有效鉀、pH值、總有機(jī)碳與氨氧化微生物的相關(guān)性較大，相關(guān)系數(shù)均大于0.2;銨態(tài)氮與古菌的相關(guān)性最大，相關(guān)系數(shù)為0.457 8，但其與細(xì)菌的相關(guān)性最小僅為0.066 9;速效磷與細(xì)菌豐度變化的相關(guān)系數(shù)0.056 4，與古菌的相關(guān)系數(shù)僅0.047 3，所以氨氧化微生物受土壤速效磷影響較小。

對(duì)武夷山常綠闊葉林下不同土地利用類(lèi)型土壤中氨氧化細(xì)菌與古菌群落結(jié)構(gòu)與季節(jié)變化中環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)性分別進(jìn)行RDA分析（圖6）的結(jié)果亦表明，不同的環(huán)境因子對(duì)氨氧化細(xì)菌和古菌的影響不同，而且不同季節(jié)的主要影響因子也存在差異。對(duì)于氨氧化細(xì)菌（圖6-A）來(lái)說(shuō)，相關(guān)性最大的環(huán)境因子是有效鉀;而對(duì)于氨氧化古菌（圖6-B），相關(guān)性最大的環(huán)境因子是銨態(tài)氮。對(duì)于林地樣本來(lái)說(shuō)，氨氧化細(xì)菌和古菌的物種結(jié)構(gòu)相似性季節(jié)變化一致，均是夏、秋、冬三季相似性高，而春季則與其他3個(gè)季節(jié)相似性較低;而對(duì)于茶園樣本來(lái)說(shuō)，氨氧化細(xì)菌的物種結(jié)構(gòu)為春夏兩季相似性高，而與秋冬兩季節(jié)相似性較低，氨氧化古菌的物種結(jié)構(gòu)為春、秋、冬三季相似性高，而夏季則與其他3個(gè)季節(jié)相似性較低。

從RDA（圖6-A）中可以看出Nitrosospira菌屬與Apo、Aph呈正相關(guān)，而與pH、An、Oc呈負(fù)相關(guān);Nitrosomonas和Others菌屬與pH、An、Oc呈正相關(guān)，而與Apo、Aph負(fù)相關(guān)，分析物種垂直投影于環(huán)境變量延長(zhǎng)線上距離可以看出，pH值上升對(duì)Nitrosomonas的生長(zhǎng)最有利，UnclassifiedNitrosomon-adaceae適合相對(duì)低的pH值;有效鉀對(duì)秋季茶園土壤氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異性具有較大貢獻(xiàn)。從物種之間的卡方距離來(lái)看，Others與Nitrosomonas親疏關(guān)系較近，可能存在互惠的生存關(guān)系，而與其他菌屬親疏關(guān)系較遠(yuǎn)，可能存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。

從RDA（圖6-B）中可以看出，UnclassifiedCandidatusNitrososphaera、Unclassified Crenarchaeota，Nitrosopumilus均與An呈正相關(guān)，而與Apo、pH呈負(fù)相關(guān);Unclassified Thaumarchaeota與pH、Oc呈正相關(guān)，而與Apo、Aph呈負(fù)相關(guān)。分析物種垂直投影于環(huán)境變量延長(zhǎng)線上距離可以看出，UnclassifiedCandidatus Nitrososphaera適合相對(duì)較高銨態(tài)氮的環(huán)境，而Others適合相對(duì)低的銨態(tài)氮的環(huán)境。銨態(tài)氮對(duì)春季林地土壤氨氧化古菌群落結(jié)構(gòu)的差異性具有較大貢獻(xiàn)。從物種之間的卡方距離來(lái)看，UnclassifiedCandidatus Nitrososphaera、Unclassified Crenarchaeota與Nitrosopumilus親疏關(guān)系較近，可能存在互惠的生存關(guān)系，而與其他菌屬親疏關(guān)系較遠(yuǎn)，可能存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。

硝化勢(shì)是研究氨氧化微生物活動(dòng)的重要指標(biāo)，從圖6-C中可以看出，Nitrosospira及Nirosovibrio適合在硝化勢(shì)較低的環(huán)境中生長(zhǎng)，即在硝化勢(shì)較高的環(huán)境中可能因?yàn)闊o(wú)法適應(yīng)環(huán)境而失去對(duì)硝化作用的貢獻(xiàn)，而Unclassified Nitrosomonadaceae則在較高的硝化勢(shì)環(huán)境中依然能夠完成硝化作用。夏季林地的硝化勢(shì)最高，因此夏季林地土壤中細(xì)菌的結(jié)構(gòu)容易形成較高的硝化勢(shì)。從圖6-D中可以看出，Nitrosopumilus適合在較低的硝化勢(shì)環(huán)境中生長(zhǎng)，而Other適合在較高的硝化勢(shì)環(huán)境中生長(zhǎng)。秋季林地樣本的硝化勢(shì)是最高的，說(shuō)明秋季林地土壤中古菌結(jié)構(gòu)適合造成較高的硝化勢(shì)。同時(shí)，針對(duì)夏季林地土壤中的細(xì)菌結(jié)構(gòu)和秋季林地土壤中的古菌結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，細(xì)菌中的Unclassified Nitrosomonadaceae和古菌中的Other可能是形成高硝化勢(shì)的主要微生物，抑或可能是這些時(shí)期的群落結(jié)構(gòu)容易使菌群對(duì)土壤產(chǎn)生較高的硝化勢(shì)，而不是單一微生物引起的。然而硝化勢(shì)的形成是由微生物之間的緩慢的更替形成，若無(wú)低硝化勢(shì)時(shí)期的微生物群落結(jié)構(gòu)，可能也無(wú)法形成高硝化勢(shì)的微生物群落結(jié)構(gòu)。

3 討論

土壤氨氧化微生物在武夷山常綠闊葉林森林生態(tài)系統(tǒng)的氮循環(huán)過(guò)程中具有重要的意義。本文結(jié)合了土壤化學(xué)和現(xiàn)代分子生態(tài)學(xué)研究方法對(duì)武夷山常綠闊葉林生態(tài)系統(tǒng)下不同土地利用類(lèi)型的氨氧化微生物的群落多樣性進(jìn)行了初步分析，研究結(jié)果表明：武夷山常綠闊葉林原始林地土壤及同域下茶園土壤中氨氧化微生物種類(lèi)相似，在茶園土壤中僅發(fā)現(xiàn)亞硝化葉菌屬Nitrosovibrio被檢出，但豐度極低。這與廣東省國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的研究結(jié)果不同，在廣東南嶺亞熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)中所有的氨氧化細(xì)菌都屬于亞硝化螺菌屬Nitrosospira[31]，說(shuō)明武夷山常綠闊葉林土壤的氨氧化細(xì)菌微生物的資源更加豐富。

武夷山林地和茶園中氨氧化微生物在不同的季節(jié)其群落結(jié)構(gòu)的相對(duì)豐度大不相同，分別在以下季節(jié)中達(dá)到最高的相對(duì)豐度，土壤氨氧化細(xì)菌的林地樣本中春季Nitrosomonas占比較大，夏、秋、冬季均是Unclasified Nitrosomonadaceae相對(duì)豐度占比最大，而茶園樣本中4個(gè)季節(jié)均為Unclasified Nitroso-monadaceae相對(duì)豐度占比最大;土壤氨氧化古菌中林地樣本除Others屬外林地夏、秋季UnclassifiedThaumarchaeota占比較大，而茶園夏、秋季UnclassifiedCrenarchaeota占比較大。

對(duì)中國(guó)桃園研究站[32]3種土地利用類(lèi)型中（農(nóng)田、天然林、茶園）的研究結(jié)果表明，土地利用類(lèi)型是引起氨氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)和相對(duì)豐度顯著變化的主要因素之一，前人的研究結(jié)果[16， 33-36]與本文的研究結(jié)果一致。本研究也發(fā)現(xiàn)不同采集地的樣本結(jié)構(gòu)差異較大，武夷山常綠闊葉林下除春季茶園土壤樣本與夏、秋季林地古菌的相對(duì)豐度相似外，其他樣本的均無(wú)相似性，其中夏季茶園與其他土壤樣品古菌相對(duì)豐度差異性最高，Nitrosopumilus，Unclassified Candidatus，Nitrososphaera.UnclassifiedCrenarchaeota在夏季茶園土壤樣本中相對(duì)豐度最高，Unclassified Thaumarchaeota在春季林地土壤中的豐度最高。在對(duì)比相同季節(jié)不同采集地樣品后可知，土壤中Nitrosomonas與UnclassifiedNitrosomonadaceae的相對(duì)豐度與土壤利用方式具有很大關(guān)系。

不同的環(huán)境因子對(duì)氨氧化細(xì)菌和古菌的影響不同，而且不同季節(jié)的主要影響因子也存在差異。有效鉀是影響氨氧化細(xì)菌變化的主要環(huán)境因子;而銨態(tài)氮是影響氨氧化古菌變化的主要環(huán)境因子;速效磷對(duì)氨氧化古菌和細(xì)菌的影響均最小。有研究也證明[37]AOA和AOB在中國(guó)亞熱帶森林的酸性土壤中差異分布，其受土壤理化特性的影響也不同[37]。Nitrosospira菌屬與銨態(tài)氮呈負(fù)相關(guān);Nitrosomonas菌屬與銨態(tài)氮呈正相關(guān)，這與曹彥強(qiáng)[38]等的研究結(jié)果也一致，Nitrosomonas菌屬適合在高濃度銨環(huán)境下存在，而Nitrosospira菌屬在自然環(huán)境中經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)對(duì)亞硝酸鹽的親和力較高。對(duì)于林地樣本來(lái)說(shuō)，氨氧化細(xì)菌和古菌的物種結(jié)構(gòu)相似性一致，均是夏、秋、冬三季相似性高，而春季則與其他3個(gè)季節(jié)相似性較低;而對(duì)于茶園樣本來(lái)說(shuō)，氨氧化細(xì)菌的物種結(jié)構(gòu)為春、夏兩季相似性高，而與秋冬兩季節(jié)相似性較低，氨氧化古菌的物種結(jié)構(gòu)為春、秋、冬三季相似性高，而夏季則與其他3個(gè)季節(jié)相似性較低。

據(jù)Lu等人[39]的研究結(jié)果也證明，森林土壤改為茶園土壤后，其主導(dǎo)的AOA菌群從隸屬于陸地分支的Group 1.1b變?yōu)殡`屬于海洋分支的Group 1.1a-associated;氨氧化微生物菌群豐度與土壤硝化勢(shì)有相關(guān)性，如硝化潛勢(shì)與隸屬于54d9-like cluster的AOA呈正相關(guān)。這一研究結(jié)果與本研究的結(jié)論相似。在武夷山在較高的硝化勢(shì)環(huán)境中，秋季林地樣本中氨氧化古菌豐度及夏季林地中氨氧化細(xì)菌豐度都更為豐富，其中，細(xì)菌中的Unclassified Nitrosomonadac-eae和古菌中的Other均有可能是在高硝化勢(shì)的土壤中形成的主要微生物，此外，也有可能是采樣時(shí)間影響了群落結(jié)構(gòu)（即各微生物的相對(duì)豐度結(jié)構(gòu)，形成利于硝化勢(shì)升高的代謝途徑），容易使菌群對(duì)土壤產(chǎn)生較高的硝化勢(shì)，而不是單一微生物引起的。

4 結(jié)論

武夷山常綠闊葉林土壤含有豐富的氨氧化微生物資源，不同土地利用類(lèi)型的氨氧化微生物種類(lèi)大致相似，但茶園有獨(dú)特的Nitrosovibrio亞硝化葉菌屬存在，且氨氧化微生物的相對(duì)豐度有顯著差異;同時(shí)，氨氧化細(xì)菌和古菌菌落相對(duì)豐度隨季節(jié)變化發(fā)生明顯變化。有效鉀是影響氨氧化細(xì)菌變化的主要環(huán)境因子，而銨態(tài)氮是影響氨氧化古菌變化的主要環(huán)境因子。本研究有助于增強(qiáng)對(duì)氨氧化微生物在武夷山常綠闊葉林生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)中的作用的認(rèn)識(shí)，同時(shí)為武夷山自然保護(hù)區(qū)的土壤利用開(kāi)發(fā)及經(jīng)營(yíng)管理提供科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：張梅）

作者簡(jiǎn)介：李?。?984-），女，碩士，助理研究員，主要從事土壤化學(xué)與植物營(yíng)養(yǎng)研究（E-mail： liwei6055@126.com）

通信作者：林香信（1972-），男，副研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究（E-mail： 1353645173@qq.com）