香蕉MaAQP1啟動子誘餌載體及干旱脅迫酵母單雜交cDNA文庫的構(gòu)建

許奕 李羽佳 魏卿 王安邦 王笑一 宋順 李敬陽

摘要：【目的】香蕉MaAQP1能夠提高植物的耐旱性，研究香蕉MaAQP1的相關(guān)特性可為了解其干旱脅迫響應(yīng)機制奠定基礎(chǔ)。 【方法】通過克隆MaAQP1的啟動子，將啟動子構(gòu)建到pHIS2誘餌質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化酵母菌構(gòu)建誘餌表達載體，同時構(gòu)建干旱脅迫的香蕉（Musa acuminat L.AAA group cv. Brazilian）cDNA文庫。 【結(jié)果】克隆獲得1362 bp的啟動子序列，通過分析其順式作用元件，結(jié)果顯示啟動子序列中共有72個順式作用元件，包括了TATA-box和CAAT-box核心元件，ABA響應(yīng)元件、MYB元件、MYC元件、ERE元件、MejA響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件以及分生組織響應(yīng)元件等;成功構(gòu)建了MaAQPI誘餌載體和干旱脅迫條件下的cDNA文庫，文庫庫容為1.25×107 CFU，插入片段平均在1200 bp左右。 【結(jié)論】本研究克隆獲得了香蕉MaAQPI啟動子并構(gòu)建了干旱脅迫酵母單雜交cDNA文庫，為下一步運用酵母單雜交篩選MaAQPI互作的轉(zhuǎn)錄因子、解析MaAQPI響應(yīng)干旱脅迫的作用機制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：香蕉;干旱;MaAQP1;誘餌載體;cDNA文庫

中圖分類號：S 668.1

文獻標志碼：A

文章編號：1008-0384（ 2020） 10-1078-08

0 引言

【研究意義】香蕉（Musa acuminat，AAA groupcv.Brazilian）是熱帶地區(qū)的重要經(jīng)濟作物之一，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）定位為發(fā)展中國家僅次于水稻、小麥、玉米之后的第四大糧食作物。然而其根系淺生，易受旱，干旱脅迫極大地傷害香蕉正常的生理代謝活動，造成香蕉減產(chǎn)和品質(zhì)下降，是香蕉產(chǎn)業(yè)中亟需解決的關(guān)鍵問題?！厩叭搜芯窟M展】香蕉水通道蛋白（ Aquaporin，AQP）是生物體內(nèi)廣泛存在的一類位于各種細胞膜上24～34 kD的小分子跨膜蛋白[1-2]，隸屬于MIP（ Major intrinsic protein，MIP）超家族，能夠調(diào)節(jié)水分以及甘油、硼、二氧化碳等小分子物質(zhì)的運輸[3_4]。AQP在植物的生長發(fā)育中起著重要的作用[5-7]，如種子萌發(fā)、細胞伸長、種子發(fā)芽、生殖生長和氣孔運動等[8]。越來越多的研究表明，AQP能夠維持植物中水的穩(wěn)態(tài)響應(yīng)各種非生物脅迫[4]，主要包括冷害、鹽害、旱害等。近年來的研究結(jié)果表明AQP能夠提高植物的抗旱性，在植物中過表達OsPIP1、OsPIP2、VfPIP1、BnPIP1能夠增加植物對滲透脅迫或干旱脅迫的耐受性‘卅。過表達TaAQP7提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性[9]。用小麥TaTIP2; 2轉(zhuǎn)化擬南芥提高了轉(zhuǎn)基因植物的抗旱能力[10]?！颈狙芯壳腥它c】前期試驗表明了MaAQP1提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性[11]，而其提高植物抗旱性的作用機制仍未有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗通過對干旱脅迫的香蕉進行cDNA合成及文庫構(gòu)建，克隆MaAQP1啟動子并構(gòu)建其誘餌載體，為進一步進行酵母單雜等研究MaAQP1響應(yīng)干旱脅迫的作用機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1植物材料 將5葉1心的巴西蕉（Musa acuminat L.AAA group cv.Brazilian）進行干旱脅迫處理[11]，當(dāng)土壤含水量為45%時取根、莖、葉一起混合凍樣。

1.1.2試驗試劑 Plasmid Maxi Kit購自德國Qiagen公司，TRIzoIReagent購自美國Invitrogen公司，lkbDNALadder和超純瓊脂糖購自上海?？粕锛夹g(shù)有限公司，Taq DNA聚合酶等購自寶生物工程有限公司。cDNA文庫構(gòu)建試劑盒購自Clontech公司;Adenine Sulfate（ Ade）為Amresco公司產(chǎn)品。各種工具酶、Marker購自TaKaRa公司。PCR引物合成和測序由華大完成。

1.2試驗方法

1.2.1 MaAQP1啟動子克隆及序列分析 在香蕉全基因組測序[12]的基礎(chǔ)上通過香蕉A基因組網(wǎng)址（http：//banana.genome.cirad.fr/）獲得 MaAQP1的ATG起始密碼子的2 kb的5'側(cè)翼區(qū)域。通過引物從香蕉基因組DNA擴增序列，最后獲得MaAQP1的翻譯起始位點（ATG）的1 362 bp視為全長啟動子，將其構(gòu)建到pMD19.T載體上并測序確認。利用啟動子順式作用元件預(yù)測軟件PlantCARE（http：//bioinfomatics.psb.ugent.be/Webt001s/plantcare/thml/）對該啟動子元件進行預(yù)測分析。

1.2.2 pHIS2一pMaAQP1誘餌載體構(gòu)建 根據(jù)MaAQP1啟動子序列分別在其兩端添加Eco RI和Sac I的酶切位點序列設(shè)計引物，引物序列pMaAQP1.FAAGAATTCCTGCGACGGTTCGTAAAGAG;pMaAQP 1-R：GGGAGCTCTGAGTGGAGGAATCAGGGTG，從pMD 1 9T—pMaAQP1上進行擴增，將擴增條帶回收，和pHIS2表達載體分別用Eco RI和SacI進行雙酶切，酶切產(chǎn)物分別純化回收后進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.c01iDH5a感受態(tài)細胞中，活化后涂布于LB固體培養(yǎng)基上（內(nèi)含30 ng.mL^-1Amp），37℃過夜培養(yǎng)后挑取單菌落搖菌，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，然后選取陽性單克隆送華大基因測序，測序正確的即為誘餌載體pHIS2一pMaAQP 1。

1.2.3誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母菌株及自激活檢測 將誘餌質(zhì)粒pHIS2.pMaAQP1、陽性和陰性對照分別轉(zhuǎn)化到酵母菌Y187感受態(tài)中，并涂布于平板SD—TIp—Leu—His+50 mm01.L^-13AT上生長。從SD—T平板中挑取單菌落于50 mL液體培養(yǎng)基中，在溫度30℃、轉(zhuǎn)速225 r.min^-1培養(yǎng)18 h。將菌液轉(zhuǎn)接于500 mL液體YPDA培養(yǎng)基中，使初始0D600=0.2，30℃，轉(zhuǎn)速824 r.min^-1條件下培養(yǎng)4～5 h，至0D600=0.6。在轉(zhuǎn)速1 737 r.min^-1下離心5 min集菌。依次用30 mL無菌H2O，轉(zhuǎn)速1 000 r.min^-1，室溫下5min集菌并棄上清。依次用20mL0.1 mol.L 1LiAc，10mL 0.1 mol.L^-1LiAc重復(fù)上一步驟，離心集菌棄上清。向離心管中依次加入1.44 mL lmol.L^-1LiAc.9.6 mL 50%PEG3350，25μg文庫質(zhì)粒DNA，300μLssDNA（10 mg.mL^-1）劇烈振蕩1 min至完全混勻。在30℃水浴中孵育30min。42℃水浴熱激25min。重復(fù)30℃水浴1h。在室溫下轉(zhuǎn)速1 453 r.min^-1離心5 min離心集菌棄上清。每個轉(zhuǎn)化用200μL無菌H20重懸菌體，溫和混勻，并涂布于相應(yīng)的缺陷型平板中，在30℃中培養(yǎng)3～4 d。

分別從表1中各轉(zhuǎn)化的平板上各隨機挑取3個單菌落，稀釋后涂板至對應(yīng)的不添加histidine、添加不同濃度（25、50 mmol.L^-1）3AT的缺陷型平板上（3AT是酵母HIS3蛋白合成的競爭性抑制劑，用于抑制His3基因的泄漏表達），30 ℃恒溫培養(yǎng)3d。記錄每塊平板上的克隆數(shù)，并計算每個轉(zhuǎn)化反應(yīng)在缺陷平板上的轉(zhuǎn)化子數(shù)量和生長率。

1.2.4用于構(gòu)建文庫的cDNA合成 用CTAB法提取干旱脅迫處理的香蕉組織，使用Oligotex mRNAKits（ Qiagen）分離純化樣本的mRNA。用Supscriptdouble stand cDNA Kit分別進行cDNA第一鏈和第二鏈的合成，加5接頭（3個讀碼框，每個讀碼框連接一份，共3份），使用1%濃度的低熔點瓊脂糖膠，電泳cDNA產(chǎn)物，切膠同收1 000 bp以上的片段，用14 μL的DEPC水溶解回收產(chǎn)物。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.2.5 酵母單雜交文庫構(gòu)建

（1） cDNA與載體的連接使用同源重組的方式，將7 μL cDNA與3μL的經(jīng)酶切處理線性化的pGADT7-Rec2（單雜交）載體，5μL的Infusion重組酶和5μL的H2O混勻。于50℃反應(yīng)1h，加入2 μL滅活的Proteinase K重組酶，78 μL無菌H2O至總體積為100 μL，加入1μ1 Glycogen（20μg.μL^-1），375 μL100% ethanol，50 μL 7.5 mol.L^-1NH40Ac，混勻并于80℃th，在4℃下，轉(zhuǎn)速6 948 r.min 1離心30 min-棄上清，加入150 μL 70%乙醇，在4℃下，轉(zhuǎn)速6 948r.min^-1離心3 min，重復(fù)此步驟一次，去盡上清，在室溫下將cDNA晾干5～1 min。用10 μL DEPC H20重懸cDNA，瞬離2s收集cDNA，置冰上。

（2）電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞 每2.5 μL的重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50 μL感受態(tài)細胞，將1 mm電轉(zhuǎn)杯（ Bio-Rad）置于80℃預(yù)冷30 min。將2.5 μL重組產(chǎn)物和50 μL感受態(tài)細胞加入電轉(zhuǎn)杯，置冰上45 mm。于電轉(zhuǎn)化儀（ Bio-Rad）上電擊，電擊后迅速向電轉(zhuǎn)杯中加入LB培養(yǎng)基1 mL，然后取人到新的15 mL離心管，補足體積到5 mL，置于37℃，824 r.min_1～868 r.min^-1離心培養(yǎng)至少t h。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物依次稀釋10、100、1 000、10 000倍，分別取10μL稀釋液涂平板，剩余培養(yǎng)物可4℃保存過夜，或者加入甘油至終濃度20%存于-80℃。

（3）構(gòu)建文庫質(zhì)量鑒定庫容量的鑒定：取轉(zhuǎn)化后菌原液10 μL稀釋1 000倍后，從中取出 10μL涂布LB平板（含氨芐抗性）.第2d計數(shù)。庫容量（ CFU.mL^-1）=平板上的克隆數(shù)/10×1000×10³，文庫總庫容量（CFU）=庫容量×文庫菌液總體積。插入片段大小鑒定：挑取平板上的單克隆，PCR擴增，電泳檢測PCR產(chǎn)物大小。

2 結(jié)果與分析

2.1基因啟動子的克隆

如圖1所示，根據(jù)香蕉A基因組網(wǎng)站（http：//banana-genome.cirad.fr）設(shè)計啟動子的引物進行擴增，擴增長度為1 362 bp。

2.2 基因啟動子的序列分析

通過plantcare和PLACE（ www.dna.affrc.go.jp）分析其順式作用元件，結(jié)果顯示了1 362 bp的啟動子序列中共有72個順式作用元件，包括了TATA-box和CAAT-box核心元件，ABA響應(yīng)元件ABRE、MYB元件、MYC元件、ERE元件、MejA響應(yīng)元件，BOX II、G-box、GTl-motif、I-BOX等光響應(yīng)元件，以及分生組織響應(yīng)元件等（表2）。

2.3誘餌載體的構(gòu)建

取轉(zhuǎn)化了誘餌載體的大腸桿菌菌液進行PCR擴增，將產(chǎn)物用l%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定。并對擴增得到陽性條帶的克隆質(zhì)粒抽提和測序。測序結(jié)果正確，同時其菌落PCR結(jié)果如圖2，條帶正確，說明MaAQP1啟動子片段連接到了表達載體pHIS2上。

2.4 誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母菌株及自激活檢測分別從3個不同轉(zhuǎn)化反應(yīng)的平板上各隨機挑取3個單菌落，稀釋后涂板至相應(yīng)的不添加Histidine（組氨酸），添加不同濃度（ 25、50 mmol.L^-1）的3AT（ 3-ami，2，4-triazole）缺陷型平板上，在30℃下培養(yǎng)3d，結(jié)果如表3和圖3所示。陽性對照隨著3AT濃度增加，生長率會降低，與陰性對照有明顯差別。陰性對照由于HIS3報告基因未被激活，在添加3AT的平板上生長明顯減少，隨著3AT濃度升高，轉(zhuǎn)化子數(shù)量減少。自激活檢測結(jié)果顯示，在不添加3AT時，平板上的生長菌落3 424個，在分別添加了25 mmol.L^-1和50 mmol.L^-13AT的平板上，轉(zhuǎn)化子的生長明顯受到抑制，其生長比例與陰性對照的生長比例基本一致，表明其未激活HIS3報告基因。當(dāng)添加25 mmol.L^-13AT時，其生長受到抑制，菌落個數(shù)為408個，與對照的生長比例為11.9%，而當(dāng)添加了50 mmol，L^-13AT時，其菌落個數(shù)為68個，與對照的生長比例為1.9%。因此，后續(xù)試驗可以用50 mmol.L^-13AT進行。

2.5 cDNA文庫的構(gòu)建

將提取的干旱脅迫處理的香蕉總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖4中顯示，總RNA的28SrRNA和18S rRNA條帶清晰，條帶28S亮度約為18S的2倍，說明總RNA質(zhì)量較好，并無發(fā)生降解和污染。將RNA進行mRNA分離純化，如圖5所示，mRNA條帶呈彌散狀分布，分布均勻，mRNA總量為4.5 μg，可以滿足建庫需要。

使用同源重組的方法，將線性化的香蕉cDNA與經(jīng)酶切處理線性化的pGADT7-Rec2（單雜交）載體混合共轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)中，取原液稀釋后涂布于LB平板上（含氨芐抗性），第2d計數(shù)，如圖6所示，插入片段集中在500～2 000 bp，平均插入片段大于1 200 bp，陽性率為l00%。在10 μL菌液稀釋100倍后，取10 μL涂板，共生長了約250個克隆，其庫容量為2.5×10⁶CFU.mL^-1，共計5 mL的轉(zhuǎn)化后原始菌液，則總庫容量為1.25×10⁷CFU。

3 討論與結(jié)論

香蕉是大水大肥作物，干旱脅迫嚴重影響其生長發(fā)育及品質(zhì)。目前的研究表明，水通道蛋白基因（AQP）作為膜蛋白能夠增加植物的水分運輸能力，提高植物的耐旱性。在擬南芥中，將AtPIPI：2和AtPIP2; 2沉默會降低擬南芥抵御干旱的耐受性[13-14]。在水稻中過表達OsPIP1、OsPIP2和OsPIPl;3能夠增強植物對干旱脅迫的耐受性[15-16]。在煙草中過表達TaAQP7和TaAQP8可以提高植物對干旱的耐受性[3，9]。因此，研究AQP響應(yīng)干旱脅迫的作用機制，對于進一步通過生物技術(shù)提高香蕉的耐旱能力具有重要的理論意義。本研究通過克隆干旱脅迫下的香蕉cDNA，構(gòu)建用于酵母單雜交的cDNA文庫，通過克隆香蕉水通道蛋白基因MaAQP1啟動子，構(gòu)建酵母誘餌表達載體，為下一步利用酵母單雜交篩選與香蕉MaAQP1互作的轉(zhuǎn)錄因子奠定了基礎(chǔ)。

啟動子在時間和空間意義上對于啟動基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)基因表達都很重要。靶向基因及其啟動子的遺傳修飾可用于增強作物生長性能[17]。順式元件與轉(zhuǎn)錄因子（ TFs）之間的相互作用在轉(zhuǎn)錄的協(xié)調(diào)調(diào)控中對激活或抑制靶基因的表達起關(guān)鍵作用[18-19]。目前，可用于作物遺傳改良的啟動子很少。植物中最常見的啟動子類型是35 s啟動子CaMV35S，它可以在標記植物中驅(qū)動高水平的基因表達，而玉米泛素啟動子則在單子葉植物中驅(qū)動基因表達。這些啟動子能夠在幾乎所有組織和發(fā)育階段的標志物或單子葉植物中驅(qū)動高水平的基因表達[20-22]。在特定條件下或某些組織中，誘導(dǎo)型或組織特異性啟動子調(diào)節(jié)靶基因的表達。迄今為止，已經(jīng)報道了一些植物的組織特異性和脅迫誘導(dǎo)型啟動子。例如，擬南芥中的rd29A和rd29B啟動子對高鹽度和干旱有反應(yīng)[23]。在小麥中，Dreb2啟動子響應(yīng)干旱脅迫[24]。來自芥菜植物的BjSOS2基因啟動子在高鹽，干旱和非生物脅迫以及其他形式的脅迫下起作用[25]。硬粒小麥基因TdPIP2; I水稻及其啟動子區(qū)域響應(yīng)非生物脅迫[26]。本研究通過PlantCARE應(yīng)用程序分析了MaAQP1啟動子的順式作用元件，元件包含了多個TATA-box和CAAT-box核心元件，以及與ABA和MejA響應(yīng)，MYB，MYC和光響應(yīng)相關(guān)元件。TATA盒是在轉(zhuǎn)錄起始位點表達基因的核心啟動子元件。CAAT-box是具有增強子活性的啟動子中常見的順式作用元件。但是，在MaAQP1啟動子中未發(fā)現(xiàn)與干旱脅迫相關(guān)的反應(yīng)元件。本研究發(fā)現(xiàn)ABRE是脫落酸（ABA）的順式作用元件。研究表明ABA是一種重要的植物激素，參與許多重要的生物過程和反應(yīng)，包括非生物脅迫。啟動子的克隆及元件分析為下一步運用酵母單雜交鑒定直接調(diào)節(jié)MaAQP1啟動子的轉(zhuǎn)錄因子，以及靶向轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)MaAQP1表達的分子機制奠定了基礎(chǔ)。

酵母單雜交cDNA文庫的構(gòu)建是酵母單雜交試驗進行的基礎(chǔ)，文庫的質(zhì)量好壞直接影響篩庫過程。而cDNA文庫的質(zhì)量又是由轉(zhuǎn)錄成cDNA的mRNA決定的，因此必須對其質(zhì)量進行嚴格的把關(guān)。本研究利用CTAB法提取香蕉組織RNA，RNA條帶清晰無降解，進一步利用試劑盒分離純化mRNA，合成香蕉cDNA，構(gòu)建的cDNA文庫，符合進一步試驗的要求。另外，庫容量以及插入片段的大小也直接影響到后期利用cDNA文庫進行互作基因篩選的效率及結(jié)果，相關(guān)的研究表明，構(gòu)建的木薯cDNA文庫庫容為1.5×10⁶CFU，插入片段大小為250～3 000 bp，能夠為進一步的酵母單雜交篩選奠定良好的基礎(chǔ)[27]。在本研究中，構(gòu)建的文庫庫容為1.25×10⁷CFU，插入片段平均在1 200 bp左右，完全滿足試驗的要求。

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（責(zé)任編輯：張梅）

作者簡介：許奕（1985-），女，碩士，研究方向：作物遺傳育種（E-mail： lukydog163@163.com）

通信作者：李敬陽（1976-），男，碩士，副研究員，研究方向：作物遺傳育種（E-mail： jingyanglee@163.com）