江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗的轉(zhuǎn)錄組分析

尹明華 張藝欣 鄧雨晴 吳洪婷 陳婷 郭淑貞 楊于萱

摘要：【目的】探究江西鉛山紅芽芋對(duì)超低溫療法脫毒的轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)機(jī)制，為江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗的規(guī)?；瘧?yīng)用奠定理論依據(jù)。【方法】以江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗（VF組）和江西鉛山紅芽芋超低溫療法帶毒苗（V組）試驗(yàn)材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組比較分析?！窘Y(jié)果】VF組Clean reads為42 406 188，GC含量為54.Og%;V組Clean reads為46 818 060，GC含量為50.36%。VF組和V組表達(dá)量FPKM的對(duì)數(shù)值在0～2，表達(dá)量密度在0～0.8。VF組和V組表達(dá)的共有基因數(shù)為23 820，V組單獨(dú)表達(dá)的基因數(shù)為10 298，VF組單獨(dú)表達(dá)的基因數(shù)為4 477。VF組和V組表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)為0.287，樣本間相關(guān)性較差。VF組和V組共產(chǎn)生差異表達(dá)基因5 282個(gè)，與V組比較，VF組上調(diào)基因3 011，下調(diào)基因2 271。GO富集分析顯示，差異基因主要注釋到過氧化氫分解過程、過氧化氫代謝過程、一元羧酸生物合成過程、多糖分解代謝過程、金屬離子輸運(yùn)、細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞壁、外部封裝結(jié)構(gòu)、膜的固有成分、質(zhì)膜固有成分、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、單加氧酶活性、鐵離子結(jié)合、血紅素結(jié)合等功能。KEGG富集分析顯示，差異基因主要注釋到苯丙酸生物合成、類黃酮生物合成、二苯乙烯類和二芳基庚烷類以及姜辣素的生物合成、MAPK信號(hào)通路一植物、淀粉和蔗糖代謝、酪氨酸代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化、過氧化物酶體、α-亞麻酸代謝、苯丙氨酸代謝、氰胺酸代謝、類胡蘿卜素生物合成、異喹啉生物堿的生物合成、泛醌和其他萜類醌的生物合成、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、植物晝夜節(jié)律、果糖和甘露糖代謝、半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝等途徑。【結(jié)論】F-box家族蛋白、脫落酸受體PYR1、乙烯受體2、生長(zhǎng)素響應(yīng)因子1、BZIP轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白、過氧化物酶、過氧化氫酶1、超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、植物抗病反應(yīng)蛋白、抗病蛋白、抗病蛋白R(shí)PS2、抗病蛋白R(shí)PS5、抗病蛋白R(shí)GA2、抗病反應(yīng)蛋白、轉(zhuǎn)座子TNT的逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)Pol多蛋白、逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)Pol多聚蛋白系1、類煙草病毒增殖蛋白3、煙草病毒增殖蛋白1、轉(zhuǎn)座子RE1的逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)Pol多蛋白、蔗糖合成酶等基因是江西鉛山紅芽芋的超低溫療法脫毒的主要響應(yīng)基因。

關(guān)鍵詞：江西鉛山紅芽芋;超低溫療法脫毒苗;超低溫療法帶毒苗;轉(zhuǎn)錄組分析

中圖分類號(hào)：S 532

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-0384（ 2020） 10-1050-13

O 引言

【研究意義】江西鉛山紅芽芋（ColocasiaesculentaL.Schott Var. Cormosus CV. Hongyayu）， 屬天南星科（ Araceae）芋屬（Colocasia）多年生宿根性草本植物，多作為一年收獲的糧菜兼用作物，屬江西省上饒市鉛山縣特產(chǎn)，2013年4月15日被核準(zhǔn)為國(guó)家地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品（登記證書編號(hào)：AGI01110）[1]。鉛山紅芽芋藥食兼優(yōu)。食用，粉而不粘，細(xì)致松滑，糯香可口，淀粉顆粒細(xì)小易吸收，品質(zhì)風(fēng)味居芋類之首[2];藥用，含天然多糖，補(bǔ)脾益腸止瀉;富微量元素，增強(qiáng)人體免疫;氟含量較高，潔齒防齲護(hù)齒;具膳食纖維，潤(rùn)腸通便止秘[3]。江西鉛山紅芽芋多采用無性繁殖，易積累病毒（如芋花葉病毒、黃瓜花葉病毒等），導(dǎo)致種性退化、早衰嚴(yán)重、抗性不足、產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣，影響紅芽芋種質(zhì)保存和新品種選育，更影響紅芽芋商品性和生產(chǎn)效益，給芋農(nóng)帶來極大損失[4-6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】基于超低溫保存（Cryopreservation）的超低溫療法（Cryotherapy）是新興植物脫毒技術(shù)[7]，可同步實(shí)現(xiàn)種質(zhì)資源“快速脫毒”和“長(zhǎng)期保存”雙重目標(biāo)[8-12]。超低溫療法已成為國(guó)內(nèi)外植物脫毒的研究前沿和學(xué)術(shù)熱點(diǎn)?！俺蜏丿煼摱尽钡某晒?shí)現(xiàn)主要依賴于“超低溫保存技術(shù)體系”的建立，理論上只要能利用“超低溫”保存種質(zhì)的植物均可實(shí)現(xiàn)“超低溫療法脫毒”，應(yīng)用前景廣闊。目前，國(guó)內(nèi)外的種質(zhì)資源超低溫保存專家開始關(guān)注“超低溫療法脫毒”在其他植物（馬鈴薯、蘋果等）上的適用性和廣譜性，取得了一系列研究成果[13-14]。病毒侵染對(duì)植物來說是一種生物脅迫[15]。從植物轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)著手，獲得轉(zhuǎn)錄組與生物脅迫之間的關(guān)系，是研究植物抗逆性的重要手段[16]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA—Seq）隨著第2代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展已成為植物分子生物學(xué)研究的重要手段，一般用于功能基因挖掘、分子標(biāo)記開發(fā)、代謝通路和調(diào)控機(jī)制研究等方面[17-18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】超低溫療法脫毒是感染病毒的一個(gè)逆向過程，是解除病毒這種生物脅迫的過程。超低溫療法脫毒后植物在轉(zhuǎn)錄組水平上的分子響應(yīng)機(jī)制還有待深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)以江西鉛山紅芽芋為研究對(duì)象，通過超低溫療法對(duì)其進(jìn)行脫毒，然后采用RNA.Seq技術(shù)，對(duì)超低溫療法脫毒苗和超低溫療法帶毒苗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選差異表達(dá)顯著的基因進(jìn)行序列分析、比較和功能聚類，初步了解江西鉛山紅芽芋“超低溫療法脫毒”的響應(yīng)機(jī)制，為江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗的規(guī)模化應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗（VF組）和江西鉛山紅芽芋超低溫療法帶毒苗（V組）由上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院上饒市藥食同源植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備。材料獲得方法：切取江西鉛山紅芽芋1 cm左右的莖尖，進(jìn)行超低溫保存，最后對(duì)其再生苗進(jìn)行病毒RT.PCR檢測(cè)，獲得江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗（VF組）和江西鉛山紅芽芋超低溫療法帶毒苗（V組）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取 參照說明書用Trizol試劑提取江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗（VF組）和江西鉛山紅芽芋超低溫療法帶毒苗（V組）總RNA。所提RNA的質(zhì)量由Nanodrop 2000和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，Agilent 2100測(cè)定RIN值。單次建庫若RNA總量5 μg，濃度≥200 ng.μL^-1，OD260/280為1.8～ 2.2即為可用。

1.2.2 Illumina Hiseq測(cè)序RNA測(cè)序送由上海美吉生物科技股份有限公司完成。

1.2.3數(shù)據(jù)分析 使用Trinity軟件對(duì)clean reads進(jìn)行de novo拼接，形成Unigene序列。利用Trinity軟件組裝得到轉(zhuǎn)錄本與參考蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫NR進(jìn)行BLAST比對(duì)。使用軟件Trans Decode對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行CDS預(yù)測(cè)。再將序列注釋到Swiss-Protein、 KEGG和GO數(shù)據(jù)庫中獲得基因功能信息。根據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（False discovery rate， FDR≤0.001）和表達(dá)量倍數(shù)變化（ IFold changel> 1.5）的閾值篩選出2個(gè)樣本間差異表達(dá)的基因（ Degs）。對(duì)顯著性差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG Pathway顯著性富集分析。

1.2.4差異基因的qRT-PCR驗(yàn)證 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組試驗(yàn)結(jié)果，采用Primer BLAST在線工具對(duì)相關(guān)差異表達(dá)基因TRINITY- DN22900_cO_gl（ F-box family protein）、TRINITY_DN22529_cO_gl（ Abscisic acid receptorPYRl）、 TRINITY_ DN2690_cO_gl（ Ethylene receptor2）. TRINITY___ DN3279- cO_gl（ Auxin response factor1）、TRINITY DN7214_cl_gl（ BZIP transcriptionfactor family protein）.TRINITY_DN768l_cO_g2（ Peroxidase）、TRINITY_ DN298一cO_g2（ Catalase l）、TRINITY__ N7108_cO_gl（ Superoxide dismutase [Cu-Zn]）、TRINITY—DN22649_cO_gl（ Plant?diseaseresistance response protein）. TRINITY_DN15482_c0_gl（ Disease resistance protein）、TRINITY- DN14303_cO_g2（ Disease resistance protein RPS2）、 TRINITY_DN17886_cO_g2（ Disease resistance protein RPS5）、TRINITY DN8674_cO_g5（ Disease resistance proteinRGA2）、 TRINITY- DN183_cl_gl（ Disease resistanceresponse?protein）、TRINITY_DN4074_cl_gl（ Retrovirus-related Pol polyprotein from transposonTNT）、 TRINITY_ DN10839_cO_gl（ Retrovirus-relatedPol polyprotein LINE-I）、 TRINITY_ DN7938_cO_g1（ Tobamovirus multiplication protein 3-like）、TRINITY_DN214l_c0_g2（ Tobamovirus multiplication protein l）.TRINITY DN27902_cO_gl（ Retrovirus-related?Polpolyprotein from transposon REl）、 TRINITY__ DN840l_cO_gl（ Sucrose synthase）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表1），每個(gè)樣品以GAPDH為內(nèi)參，3個(gè)技術(shù)重復(fù)，采用1.2.1的方法提取2種材料的總RNA，按照Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect RealTime）試劑盒說明書合成cDNA的第1條鏈，在熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)出分析

堿基質(zhì)量值（Quality Score或Q-score）是堿基識(shí)別（ Base Calling））出錯(cuò)概率映射。堿基質(zhì)量值越高表明堿基識(shí)別越可靠。通常Quality scores大于20即滿足分析對(duì)測(cè)序質(zhì)量的要求。經(jīng)過測(cè)序質(zhì)量控制，江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗（VF組）和江西鉛山紅芽芋超低溫療法帶毒苗（V組）的文庫構(gòu)建質(zhì)量和測(cè)序質(zhì)量較好，可用于后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組分析（表2）。

2.2 江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗測(cè)序數(shù)據(jù)與組裝結(jié)果

將每個(gè)樣本的clean reads與Trinity組裝獲得的參考序列進(jìn)行比對(duì)，獲得每個(gè)樣本的mapping結(jié)果，也是后續(xù)進(jìn)行各樣本基因和轉(zhuǎn)錄本定量的基礎(chǔ)。一般能定位到組裝轉(zhuǎn)錄本上的clean reads所占百分比大于70%即為比對(duì)結(jié)果較好。由表3可知，測(cè)序數(shù)據(jù)與組裝結(jié)果比對(duì)結(jié)果較好，可以進(jìn)行后續(xù)VF組和V組樣本基因和轉(zhuǎn)錄本定量等工作。

2.3 江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗表達(dá)量分析

TPM（ Transcripts Per Millionreads）：即每百萬讀段中來自某轉(zhuǎn)錄本的讀段數(shù)。TPM和FPKM -樣，都對(duì)基因長(zhǎng)度和測(cè)序深度進(jìn)行了均一化。但不同的是，F(xiàn)PKM是先對(duì)測(cè)序深度進(jìn)行均一化，然后對(duì)基因長(zhǎng)度進(jìn)行均一化;而TPM是先對(duì)基因長(zhǎng)度進(jìn)行均一化，然后再對(duì)測(cè)序深度進(jìn)行均一化。TPM的均一化過程使得不同樣本中的總表達(dá)量一致，這樣可以更直觀地進(jìn)行表達(dá)量的比較。由圖1-A，VF組和V組表達(dá)量FPKM的對(duì)數(shù)值在0～2。由圖1-B展示的VF組和V組樣本unigene/transcript的表達(dá)量密度分布情況可知，VF組和V組表達(dá)量密度在0～0.8。

2.4 江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗表達(dá)量樣本間Venn分析

從圖2可知，VF組和V組表達(dá)的共有基因數(shù)為23 820，V組單獨(dú)表達(dá)的基因數(shù)為10 298，VF組單獨(dú)表達(dá)的基因數(shù)為4 477。VF組單獨(dú)表達(dá)的基因數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于V組單獨(dú)表達(dá)的基因數(shù)。

2.5 江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗表達(dá)量樣本間相關(guān)性分析

由圖3可知，VF組和V組表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)為0.287，表明基因在VF組和V組2個(gè)樣本間的表達(dá)量相似度較低，即樣本間相關(guān)性不大。

2.6 江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗差異表達(dá)分析

VF組和V組共產(chǎn)生差異表達(dá)基因（Differentiallyexpressed gene，DEG）5 282個(gè)，與V組比較，VF組上調(diào)基因3 011，下調(diào)基因2271（圖4）。從表4可知，VF組和V組前10個(gè)差異表達(dá)基因大多為假設(shè)蛋白和外殼蛋白。

2.7 江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗差異表達(dá)基因GO富集分析

從圖5和表5可知，通過富集，過氧化氫分解過程、過氧化氫代謝過程、一元羧酸生物合成過程、多糖分解代謝過程、金屬離子輸運(yùn)、細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞壁、外部封裝結(jié)構(gòu)、膜的固有成分、質(zhì)膜固有成分、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、單加氧酶活性、鐵離子結(jié)合、血紅素結(jié)合等GO term富集顯著。這可能是江西鉛山紅芽芋響應(yīng)超低溫療法脫毒的主要功能變化。

2.8 江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗差異表達(dá)基因KEGG注釋

從圖6和表6可知，VF組和V組差異表達(dá)基因富集的KEGG通路主要有苯丙酸生物合成、類黃酮生物合成、二苯乙烯類和二芳基庚烷類以及姜辣素的生物合成、MAPK信號(hào)通路.植物、淀粉和蔗糖代謝、酪氨酸代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化、過氧化物酶體、α-亞麻酸代謝、苯丙氨酸代謝、氰胺酸代謝、類胡蘿卜素生物合成、異喹啉生物堿的生物合成、泛醌和其他萜類醌的生物合成、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、植物晝夜節(jié)律、果糖和甘露糖代謝、半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝等。其中植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（基因數(shù)92）、苯丙酸生物合成（基因數(shù)78）、MAPK信號(hào)通路.植物（基因數(shù)71）、淀粉和蔗糖代謝（基因數(shù)63）、氨基糖和核苷酸糖代謝（基因數(shù)50）、過氧化物酶體（基因數(shù)39）以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（基因數(shù)32）注釋的基因數(shù)均超過30，這可能是江西鉛山紅芽芋響應(yīng)超低溫療法脫毒的主要機(jī)制。

2.9 江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗相關(guān)差異表達(dá)基因的qRT-PCR分析驗(yàn)證

從RNA-seq數(shù)據(jù)中挑選20個(gè)在KEGG通路注釋數(shù)量較多的差異表達(dá)基因TRINITY DN22900一c0一gl（ F-box family protein）、TRINITY DN22529_cO_gl（ abscisic acid receptor PYRl）、 TRINITY DN2690-cO_gl（ ethylene receptor 2）、 TRINITY DN3279__ c0_gl（ auxin response factor l）、TRINITY DN7214一cl一gl（ BZIP transcription factor familyprotein）、TRINITYDN7681 _cO_g2 （ Peroxidase ） 、TRINITY DN298_cO_g2 （ catalase l ） 、TRINITY DN7108_cO_gl （ superoxidedismutase [Cu-Zn] ） 、 TRINITY DN22649_cO_gl （ Plantdisease?resistance?response?protein） 、TRINITYDN15482_cO_gl （ disease resistance protein ） 、 TRINITY_DN14303_cO_g2 （ Disease resistance protein RPS2 ） 、TRINITY DN17886_cO_g2 （ Disease resistance proteinRPS5 ） 、TRrNITY DN8674_cO_g5 （ disease resistanceprotein?RGA2 ） 、 TRINITY DN183_cl_gl （ Diseaseresistance response protein）、TRINITY_DN4074_cl_gl（ Retrovirus-related P01 polyprotein from transposonTNT）、 TRrNITY_ DN10839_cO_gl（ Retrovirus-relatedPol polyprotein LINE-1）、 TRINITY—DN7938_cO_gl（ tobamovirus multiplication protein 3-like）、TRINITY_DN214l_cO_g2（ tobamovirus multiplication protein l）、TRINITY_ DN27902_cO_gl（ Retrovirus-related?Polpolyprotein from transposon REl）、TRINITY DN8401_cO_gl（ sucrose synthase），并利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證（表7），結(jié)果顯示，20個(gè)基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)均與RNA-seq結(jié)果一致，說明本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)可信度高。qRT-PCR也進(jìn)一步驗(yàn)證了F-box家族蛋白、脫落酸受體PYR1、乙烯受體2、生長(zhǎng)素響應(yīng)因子1、BZIP轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白、過氧化物酶、過氧化氫酶1、超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、植物抗病反應(yīng)蛋白、抗病蛋白、抗病蛋白R(shí)PS2、抗病蛋白R(shí)PS5、抗病蛋白R(shí)GA2、抗病反應(yīng)蛋白、轉(zhuǎn)座子TNT的逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)Pol多蛋白、逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)Pol多聚蛋白系1、類煙草病毒增殖蛋白3、煙草病毒增殖蛋白1、轉(zhuǎn)座子REI的逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)Pol多蛋白、蔗糖合成酶等基因是江西鉛山紅芽芋的超低溫療法脫毒的主要響應(yīng)基因。

3 討論與結(jié)論

與常規(guī)莖尖培養(yǎng)脫毒法相比，莖尖超低溫療法脫毒率顯著提高，且脫毒率不受莖尖大小影響，操作簡(jiǎn)便，試驗(yàn)周期短、成本低，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)種質(zhì)保存和病毒脫除雙重目[20-22]。目前，超低療法脫毒苗的轉(zhuǎn)錄組分析一般專注于超低溫保存程序本身。百子蓮胚性愈傷組織超低溫保存前脫水和恢復(fù)培養(yǎng)材料的轉(zhuǎn)錄組分析表明，差異表達(dá)基因主要參與到外源刺激響應(yīng)（517個(gè)）、脅迫響應(yīng)（302個(gè)）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（207個(gè)）等，逆境響應(yīng)主要表現(xiàn)在細(xì)胞膜質(zhì)結(jié)構(gòu)、還原性物質(zhì)和植物激素的變化、細(xì)胞結(jié)構(gòu)修復(fù)及發(fā)育相關(guān)物質(zhì)合成代謝等方面[23]。冷凍脅迫下MLP2-1擬南芥與野生型擬南芥植株差異表達(dá)基因的KEGG代謝通路富集在植物激素與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝通路[24]。本試驗(yàn)結(jié)果專注于超低溫保存后脫毒苗的內(nèi)在分子響應(yīng)機(jī)制，與上述結(jié)果的出發(fā)點(diǎn)不同。在本試驗(yàn)中，江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗（VF組）和江西鉛山紅芽芋超低溫療法帶毒苗（V組）差異表達(dá)基因富集的KEGG通路主要有植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（基因數(shù)92）、苯丙酸生物合成（基因數(shù)78）、MAPK信號(hào)通路一植物（基因數(shù)71）、淀粉和蔗糖代謝（基因數(shù)63）、氨基糖和核苷酸糖代謝（基因數(shù)50）、過氧化物酶體（基因數(shù)39）以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（基因數(shù)32）等通路，這可能是江西鉛山紅芽芋響應(yīng)超低溫療法脫毒的主要機(jī)制。

植物激素對(duì)于江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒后的生長(zhǎng)發(fā)育起著重要作用。植物激素的作用在于形成植物激素信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，響應(yīng)內(nèi)外因素誘導(dǎo)植物激素基因表達(dá)[25]，激素受體或組件因互作或串話產(chǎn)生協(xié)同或拮抗作用從而使植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑形成網(wǎng)絡(luò)化[26]，最終綜合產(chǎn)生效應(yīng)，使江西鉛山紅芽芋經(jīng)過超低溫療法脫毒恢復(fù)種性。苯丙氨酸類代謝能合成次生酚類物質(zhì)和抗菌作用產(chǎn)物（如木質(zhì)素、綠原酸和植保素等）[27]，阻止病原菌生長(zhǎng)繁殖，苯丙氨酸解氨酶（ PAI）是苯丙氨酸類代謝的定速酶[28]。江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒后，會(huì)通過提高PAL的活性，促使木質(zhì)素和綠原酸的積累和植保素的合成，以增強(qiáng)江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗的抗病性。MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）信號(hào)通路主要參與各種植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和各種內(nèi)外因素的應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)控生物非生物脅迫、激素、細(xì)胞分裂及植物生長(zhǎng)發(fā)育[29]。研究表明。MAPK信號(hào)通路與植物激素信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)可能存在交叉調(diào)控[30-31]。江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗可增強(qiáng)感知和傳遞刺激信號(hào)的能力，通過MAPK級(jí)聯(lián)通路將信號(hào)傳遞給細(xì)胞，啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，對(duì)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大，最終導(dǎo)致植株內(nèi)部的生理生化變化。江西鉛山紅芽芋球莖的生長(zhǎng)發(fā)育（包括形態(tài)建成和貯藏物質(zhì)的積累）是通過光合作用蔗糖的不斷合成來完成的[32]。蔗糖和淀粉是變態(tài)器官（如球莖）糖類的主要積累形式，可調(diào)節(jié)和平衡碳水化合物的形態(tài)[33]。超低溫療法脫毒可能促使江西鉛山紅芽芋“淀粉一蔗糖”代謝酶（蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶、酸性轉(zhuǎn)化酶、中性轉(zhuǎn)化酶、Q酶）的活性升高，進(jìn)而對(duì)江西鉛山紅芽芋球莖的發(fā)育及其品質(zhì)起到調(diào)控作用。氨基糖最常見的形式是葡糖胺和半乳糖胺，氨基糖代謝與植物生長(zhǎng)發(fā)育及與環(huán)境適應(yīng)性密切相關(guān)。核苷酸糖是糖類合成或相互轉(zhuǎn)換時(shí)的活化形式。超低溫療法脫毒可能促使江西鉛山紅芽芋氨基糖和核苷酸糖各類代謝酶的活性升高，對(duì)江西鉛山紅芽芋球莖的形態(tài)建成及質(zhì)量起到調(diào)控作用。過氧化物酶體是過氧化氫產(chǎn)生的細(xì)胞器[34]，是活性氧類（ ROS）的重要來源[35]。研究表明，ROS作為植物激素信號(hào)的第二信使，調(diào)節(jié)植物發(fā)育過程和應(yīng)答反應(yīng)[36]。過氧化物酶體可能在江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗中調(diào)控ROS，感知環(huán)境變化，平衡氧化還原反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞各類代謝途徑，參與體內(nèi)不同的重要生理反應(yīng)。氨基酸是植物新陳代謝關(guān)鍵的參與者[37]。甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝可提供一碳單位，合成其他氨基酸、核苷酸、脂質(zhì)以及合成還原性物質(zhì)，調(diào)控核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的合成[38]，使江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗細(xì)胞內(nèi)氧化還原處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，對(duì)維持江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗的生物代謝及其表觀遺傳穩(wěn)定十分重要。本研究表明，F(xiàn)-box家族蛋白、脫落酸受體PYR1、乙烯受體2、生長(zhǎng)素響應(yīng)因子1、BZIP轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白、過氧化物酶、過氧化氫酶1、超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、植物抗病反應(yīng)蛋白、抗病蛋白、抗病蛋白R(shí)PS2、抗病蛋白R(shí)PS5、抗病蛋白R(shí)GA2、抗病反應(yīng)蛋白、轉(zhuǎn)座子TNT的逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)Pol多蛋白、逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)Pol多聚蛋白系1、類煙草病毒增殖蛋白3、煙草病毒增殖蛋白1、轉(zhuǎn)座子RE1的逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)Pol多蛋白、蔗糖合成酶等基因是江西鉛山紅芽芋的超低溫療法脫毒的主要響應(yīng)基因。

參考文獻(xiàn)：

[1] 余志平，林海紅，余俊紅，等，鉛山紅芽芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展概況[J].長(zhǎng)江蔬菜.2016 （20）：34-36.

YU Z P，LIN H H，YU J H，et al.Development of red bud taroindustry in Yanshan [J]. Journal of Changjiang Vegetables，2016 （20）： 34-36. （in Chinese）

[2] 姜紹通，程元珍，鄭志，等，紅芽芋營(yíng)養(yǎng)成分分析及評(píng)價(jià)[J].食品科學(xué)，2012， 33（ ll）： 269-272.

JIANG S T，CHENG Y Z，ZHENG Z， et al. Analysis and evaluation ofnutritional components of red bud taro （Colocasia esulenlaL.Schott） EJl. Food Science， 2012， 33 （11）： 269-272. （in Chinese）

[3] 山娜，楊文俊，李斌，舉全縣之力，打造鉛山紅芽芋支柱產(chǎn)業(yè)[J].長(zhǎng)江蔬菜，2016 （4）：9-10.

SHAN N，YANG W J，LI B.Take the efforts of the whole county tobuild the pillar industry of red bud taro EJl. Journal of ChangiangVegetables， 2016 （4）：9-10. （in Chinese）

[4]李火金.鉛山紅芽芋莖尖脫毒組培繁育及高產(chǎn)栽培[J].中國(guó)蔬菜，2012 （2）：45-46.

LI H J.Virus free tissue culture and high yield cultivation of the shoottips of the red bud taro EJl China Vegetables， 2012（2）：45-46. （inChinese）

[5]江芹，廖華俊，董玲，等.紅芽芋的叢生芽誘導(dǎo)和再生體系建立[J].分子植物育種，2015， 13 （3）：675-679.

JIANG Q，LIAO H J，DONG L， et al. Induction of multiple shoot andestablishment of regeneration system in Clocasia escalenta schott EJl.Molecular Plant Breeding， 2015， 13（3）：675-679.（ in Chinese）

[6] 鄧接樓，曹吳瑋，李玲，等.脫毒紅芽芋試管芋盆栽種植的農(nóng)藝性狀分析[J].分子植物育種，2019. 17（ 22）：7500-7506.

DENG J L，CAO H W. LI L，et aL Analysis on agronomic traits ofvirus-free test-tube taro planted in pots EJl.Molecular Plant Breeding，2019. 17 （22）： 7500-7506. （in Chinese）

[7] 胡國(guó)君，董雅鳳，張尊平，等.植物類病毒脫除技術(shù)進(jìn)展[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2017， 44 （2）：177-184.

HU G J，DONG Y F，ZHANG Z P，et al.Progress in plant viroidelimination techniques [J].ActaPhytophyZacicaSinica， 2017，44 （2）： 177-184. （in Chinese）

[8]YANG X X，POPOVA E， SHUKLA M R，et al. Root cryopreservationto biobank medicinal plants：A case study for Hypericum perforatumL[J]。In Vitro Cellular&Developmental BioZogy-Plant， 2019，55 （4）：392-402.

[9] KULUS D，REWERS M， SEROCKA M， et al.Cryopreservation byencapsulation-dehydration affects the vegetative growth ofChrvsanthemum but does not disturb its chimeric structure EJl.PlantCell. Tissue and Organ Culture （PCTOC）， 2019， 138（1）：153-166.

[10] 11 W B，HARTUNG J S，LEVY L Quantitative real-time PCR fordetection and identification of Candidatus Liberibacter speciesassociated with Citrus huanglongbing [J] Journal of Microbiological Methods， 2006. 66（1）：104-115.

[11] WANG Q C，VALKONEN J P T.Cryotherapy of shoot tips： Novelpathogen eradication method [J]. Trends in Plant Science， 2009.14 （3）：119-122.

[12] HELLIOT B， PANIS B，POUMAY Y，et al.Cryopreservation for theelimination of cucumber mosaic and banana streak viruses from banana （Musaspp） [J].Plant?Cell Reports， 2002. 20 （12）：1117-1122.

[13]李涵，陸琳，瞿素萍，等，雜交蘭種苗超低溫脫毒技術(shù)研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)。2018. 20 （1）：147-153.

LI H，LU L， QU S P，et aL Study of hybrid orchid seedlings on viruselimination using cryopreservation technology [J]. Journal ofAgricultural Science and Technology， 2018， 20（1）：147-153. （inChinese）

[14]李艷林，渠慎春，欒雨婷，等，蘋果莖尖超低溫脫毒體系的建立[J].分子植物育種，2019， 17 （9）：2982-2995.

LI Y L，QU S C，LUAN Y T，et al. Establishment of cryopreservationdetoxification system of apple shoot-tips [J]. Molecular PlantBreeding， 2019， 17 （9）：2982-2995. （in Chinese）

[15]周金鑫，胡新文，張海文，等.ABA在生物脅迫應(yīng)答中的調(diào)控作用[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2008. 16 （1）：169-174.

ZHOU JX，HUX W. ZHANGH W， et al. Regulatory role of ABA inplant response to biotic stresses [J]. Journal of AgriculturalBiotechnology， 2008， 16 （1）：169-174. （in Chinese）

[16] XANTHOPOULOU A， GANOPOULOS I， PSOMOPOULOS F， et al.De novo comparative transcriptome analysis of genes involved in fruitmorphology of pumpkin cultivars with extreme size difference anddevelopment of EST-SSR markers EJl. Gene， 2017， 622： 5066.

[17] UNAMBA C I N，NAG A，SHARMA R K.Next generationsequencing technologies： The doorway to the unexplored genomics ofnon-model plants [J].FrontiersmPlant Science， 2015，6：1074.

[18] COSTA v，ANGELINI C，DE FEIS I，et al.Uncovering thecomplexity of transcriptomes with RNA-seq EJl. Journal ofBiomedicine and Biotechnology， 20 10， 2010：1一19.

[19] WANG Z，GERSTEIN M. SNYDER M. RNA-Seq：a revolutionarytool for transcriptomics [J]. Nature Reviews Genetics， 2009. 10（1）：57-63.

[20] VIEIRA R L，SILVA A L，ZAFFARIG R，et aL Efficient eliminationof virus complex from garlic （Allium sativum L.） by cryotherapy ofshoot tips EJl.Acta PhysioZogiae Plantarum. 2014. 37（1）：1-11.

[21] WANG B，WANG R R，CUI Z H，et aL Potential applications ofcryogenic technologies to plant genetic improvement and pathogeneradication EJl.Biotechnology Advances. 2014， 32（3）：583-595.

[22] WANG Q C，PANIS B， ENGELMANN F， et al. Cryotherapy of shoottips：A technique for pathogen eradication to produce healthy plantingmaterials and prepare healthy plant genetic resources forcryopreservation [J]. Annals of Applied Biology， 2009， 154 （3）：351-363.

[23]何廣深，百子蓮胚性愈傷組織超低溫保存中鈣離子的分布變化及逆境應(yīng)答機(jī)制初探[D].上海：上海交通大學(xué)，2014.

HE G S.Distribution change of Ca24- and stress response mechanismresearch of Agapanthus praecox embryogenic callus duringcryopreservation [D]. Shanghai： Shanghai Jiaotong University，2014.（in Chinese）

[24]滕進(jìn)婧，李夢(mèng)蕓，郭純，等，冷凍脅迫轉(zhuǎn)金柑MLP2-I基因擬南芥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和代謝通路[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2018， 44 （4）：376-381.

TENG J J，LI M Y，GUO C，et al.Transcriptome sequencing andmetabolic pathway analysis of transgenic MLP2-1 gene in Arabidopsisunder cold stress EJl. Journal of Hunan Agricultural University（Natural Sciences Edition）. 2018，44（4）：376-381.（in Chinese）

[25]蘇謙，安冬，王庫.植物激素的受體和誘導(dǎo)基因[J].植物生理學(xué)通訊，2008， 44 （6）： 1202-1208.

SU Q，AN D，WANG K.Phytohormone receptors and induced genesin plants [J]. Plant Physiology Communications. 2008，44 （6）：1202-1208. （in Chinese）

[26] OHRI P，BHARDWAJ R，BALI S G，et al_The common molecularplayers in plant hormone crosstalk and signaling [J]. Current Protein&Peptide Science， 2015， 16（5）：369-388.

[27]楊家書，吳畏，吳友三，等.植物苯丙酸類代謝與小麥對(duì)白粉病抗性的關(guān)系[J].植物病理學(xué)報(bào)，1986， 16 （3）：169-174.

YANG J S，wu w. WU Y S，et al.Relation of metabolism of plantphenylalanine and resistance of wheat to powdery mildew [J].ActaPhytopathologica Sinica， 1986， 16（3）：169-1 74.（ in Chinese）

[28]陳建中。盛炳成，劉克均，苯丙酸類代謝與蘋果對(duì)輪紋病抗性的關(guān)系[J].果樹科學(xué)，1986， 16 （3）：169-174.

CHEN J Z，SHENG B C，LIU K J，et al_The relation betweenmetabolism of phenylalanine and resistance to Physalospora piricolaNose in apple trees [J].Acta Phytopathologica Sinica， 1986.1 6（3）：169-174. （in Chinese）

[29] DUAN PG，RAOYC，ZENGDL，et al.SMALL GRAIN l， whichencodes a mitogen-activated protein kinase kinase 4， influences grainsize in rice [J].The Plant Journal. 2014. 77 （4）：547-557.

[30] LIU S Y，HUA L， DONG S J，et al.OsMAPK6，a mitogen-activatedprotein kinase， influences rice grain size and biomass production [J].The Plant Journal， 2015， 84 （4）： 672681.

[31] 11YB，F(xiàn)ANCC，xrNGYz，et al_ Natural variation in GS5 plays animportant role in regulating grain size and yield in rice[J]. NatureGenetics， 2011， 43 （12）： 1266.

[32]苑智華，何秀麗，徐哲，等.唐菖蒲球莖形成期蔗糖和淀粉代謝及其相關(guān)酶活性[J].林業(yè)科學(xué)，2008.44 （8）：47-51.

YUAN Z H，HE X L，XU Z， et al.Metabolism and related enzymesactivities of sucrose and starch in the stages of bulb formation ofGladiolus?hybridus [J]. Scientia?Silvae?Sinicae. 2008. 44 （8）：47-51. （in Chinese）

[33]孫紅梅，何玲，王微微，等.IBA與GA3調(diào)控百合鱗片扦插繁殖的“淀粉一蔗糖”代謝機(jī)制[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011， 44 （4）：798-806.

SUN H M， HE L， WANG W W， et al.Mechanism of starch-sucrosemetabolism regulated by IBA as well as GA3 during scale cuttingpropagation in Lilium [J].Scientia Agricultura Sinica， 2011，44（4）：798-806. （in Chinese）

[34] HUJ P，BAKER A， BARTEL B， et al. Plant peroxisomes： Biogenesisand function [J].The Plant Cell， 2012. 24 （6）：2279-2303.

[35] SANDALIO L M. RODRfGUEZ-SERRANO M. ROMERO-PUERTAS M C，et al.Role of peroxisomes as a source of reactiveoxygen species （ROS） signaling molecules[C]//Peroxisomes and TheirKey Role in Cellular Signaling and Metabolism， 2013：231 -225.

[36] MITTLER R，VANDERAUWERA S，SUZUKI N， et al.ROSsignaling： The new wave？ [J]. Trends in Plant Science. 2011，16 （6）：300-309.

[37]于妍，宋萬坤，劉春燕，等.植物天冬氨酸代謝途徑關(guān)鍵酶基因研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2008（ S1）：7-11. 17.

YU Y，SONG W K，LIU C Y，et al.Research development of keyenzymes gene on aspartic acid metabolic pathway in plants [J].Biotechnology Bulletin， 2008（ S1）：7-11，17. （in Chinese）

[38]馬瑞肖，張慧杰，李馨慧，等，絲氨酸/甘氨酸代謝在腫瘤中的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2020. 28 （6）：1021-1024.

MA R X，ZHANG H J，LI X H，et aL The progress of serinelGlycinemetabolism in tumor [J]. Journal of Modern Oncology，2020，28 （6）： 1021-1024. （in Chinese）

（責(zé)任編輯：張梅）

作者簡(jiǎn)介：尹明華（1973-），女，碩士，副教授，主要從事植物生物技術(shù)方面研究（E-mail： yinminghua04@163.com）