肉類及肉制品中動物源性成分鑒別方法研究進展

紀藝,陳笑蕓,丁霖,汪小福,彭城,徐曉麗,徐俊鋒

浙江省農業(yè)科學院農產品質量安全與營養(yǎng)研究所， 杭州 310021

近年來，肉類摻假問題成為食品安全熱點話題之一，肉類及肉制品摻假是指用成本更低的其他肉類或植物蛋白質來部分或全部替代生肉及肉制品[1-4]。由于馬肉的價格是牛肉的三分之一，2013年，英國、法國等在內的部分歐盟國家的一些不法商販將馬肉摻入到牛肉中進行售賣[5]；由于狐貍肉本身存在異味，價格較為低廉，但經處理后，可脫去其臭味，2013年年底，我國國內媒體曝光沃爾瑪在售的“五香驢肉”被檢出狐貍肉[6]。肉類摻假不僅侵害了消費者的利益，也存在諸多食品安全隱患。因此，亟需溯源肉類及肉制品中的動物源性成分，確定肉類成分的真實性和準確性，向消費者提供肉類及肉制品的清晰、可靠的信息[7]。

如今，對動物源性成分分析的研究及相應的鑒別方法逐漸增多。傳統(tǒng)的檢驗方法主要是通過感官辨別、顯微鏡法以及比色法等鑒別不同肉類[8-9]，也可通過化學方法檢驗不同動物種類糖原結合肌內脂肪、脂肪中的亞油酸、胡蘿卜素、脂肪的折射率以及碘含量等進行綜合判斷[8]。隨著抗體技術的不斷發(fā)展，因免疫學方法可精準地確定動物源而在肉類成分鑒別中更多地出現(xiàn)[10]。其中，通過免疫測定獲得定量數(shù)據(jù)的最佳方法是微孔板ELISA，它適用于高精度定量靶標表征[11-12]。隨著實際應用對檢測技術的要求逐漸提高，基于核酸鑒定和定量動物源性成分的方法發(fā)展起來[13]，研究證明基于核酸的肉類鑒定是準確、快速且敏感的[14]。Cai等[15]開發(fā)了一種基于實時環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)的測定法，并且設計了對豬基因具有高度選擇性的引物，用于檢測肉制品中豬源成分。此方法僅需20 min，是在商業(yè)產品中使用實時LAMP測定法檢測豬源成分的首次嘗試。Ren等[16]開發(fā)了一種新的基于微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)的檢測方法，用于定量測定綿羊和山羊肉產品中雞肉的含量，并引入常數(shù)(乘法因子)以將拷貝數(shù)的比例轉換為肉的比例。可見，高效、精準的檢測方法有助于鑒別食品工業(yè)中的摻假行為?；诖?，本文對肉類及肉制品中動物源性成分檢測及鑒別的不同研究方法進行介紹，并分析個中利弊，最后對此領域的后續(xù)研發(fā)方向進行展望，以期為肉類及肉制品的安全監(jiān)控、檢測以及溯源提供一定的參考。

1 傳統(tǒng)鑒別方法

早期人們通過感官來鑒別動物肉的種類。如豬肉及其脂肪的物理特征(包括顏色、質地和氣味等)不同于其他肉類，豬肉顯示出柔軟的稠度、略帶腥味以及高比例的肌內脂肪，這些表象屬性可用于豬肉的感官識別[17]。此外，屬于物理鑒別方法的還有鏡檢法，是唯一一個被歐盟認可的檢測肉制品中動物源性成分的官方方法[17]。鏡檢法可以通過對哺乳動物、禽類和魚類等的肉質進行觀察并予以區(qū)分，但不能進一步鑒別具體的種類。此外，也可以通過不同動物種類之間的糖原含量、碘值等化學參數(shù)來區(qū)分動物源。如將豬肉和其他肉類進行區(qū)分的另一個因素是豬肉的高折射率(index of refraction，RI)(馬肉除外，馬肉RI值與豬肉相同)[18]；王新來[19]利用理化學鑒別的方法，通過測定脂肪溶解度以及糖原的定性反應成功鑒別牛、馬肉。這些傳統(tǒng)的鑒別方法雖然可以得到鑒別結果，但是在實際應用中卻存在許多限制因素：耗時長、靈敏度低，而且，肉糜類產品相對較難通過傳統(tǒng)方法進行檢驗[19-21]。

2 免疫學鑒別方法

免疫學方法因可精準地確定動物源而被應用于肉類成分鑒別中，如利用試管沉淀法、瓊脂凝膠免疫擴散法均能夠鑒別動物肉類源性成分[10]。李景鵬和張玉樹[22]利用對流免疫電泳、瓊脂凝膠擴散和環(huán)狀沉淀反應3種方法對馬肉、牛肉以及其混合肉(共87份樣品)進行鑒別，結果表明這3種方法均可精準地鑒別出其動物源，但是大部分方法耗時較長，且無法進行有效的定量分析。除耗時較長外，上述方法無法檢測出熱處理后的蛋白質[10,23-24]，而大部分市售的肉制品均是被高溫處理過的，因此在實際應用中受到限制。

免疫學檢測方法中另一具有代表性的是基于抗原-抗體特異性識別的酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(ELISA)，其利用酶來檢測樣品中抗體或抗原的存在，具有特異性、簡便性和敏感性等特點，近年來在動物源性成分鑒別中得到廣泛的應用[25-26]。Mandi等[27]開發(fā)了ELISA/免疫傳感器(包括直接免疫傳感器和競爭性免疫傳感器兩種形式的ELISA)用于檢測肉類摻假情況。與競爭性ELISA(在45 min內確定0.1%的摻假水平)相比，直接ELISA能夠在14 h 15 min內檢測出牛肉中0.01%的低摻假水平的豬肉。使用直接免疫傳感器，可以在2 h內檢測到0.1%的豬肉摻假；而使用競爭性免疫傳感器，僅20 min即可檢測到低水平的豬肉摻假(0.01%)。研發(fā)的免疫傳感器可有效檢測加工食品中的豬肉免疫球蛋白(IgG)，并且可以在1%～100%的研究范圍內檢測煮熟后牛肉丸中的豬肉，并已成功應用于物種(雞、羊肉、火雞)篩選測試。2種競爭性免疫測定均顯示出高靈敏度、良好的特異性、簡便性和低成本等優(yōu)點，因此適用于食品認證[28-30]。此外，多克隆抗體和單克隆抗體均可用于ELISA方法中進行源性成分鑒定。多克隆抗體具有許多優(yōu)點，如識別抗原不同表位的混合物，對抗原性質的微小變化(如聚合或輕微變性)具有更大的耐受性，因此是檢測變性蛋白質的首選，但同時也存在局限性，如親和力可變、產量受限以及需要大量純化程序以消除針對特定物種鑒定的交叉反應性[31]。

3 基于光譜的檢測方法

光譜技術是近年來常用于檢測肉品新鮮度的方法，具有無損、快速得出結果等特點?；诠庾V的檢測方法包括近紅外光譜(near infrared spectrum instrument，NIRS)法、拉曼光譜檢測(raman spectra，RS)法和傅里葉近紅外光譜等，其中，近紅外光譜可以對肉類質量參數(shù)進行估算并用于檢測肉類是否摻假，操作簡便、檢測速度快，是一種經濟高效的方法[32]。許多研究將近紅外光譜和偏最小二乘法(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)算法結合進行肉類檢驗。如白京等[33]運用近紅外光譜法結合化學計量法對牛肉漢堡中是否摻假豬肉進行鑒別，研究表明，利用支持向量機(support vector machine，SVM)和PLS-DA算法可進行定性鑒別，且后者效果較好，而利用最小二乘回歸法(partial least squares regression regression，PLSR)算法可進行摻假比例的定量檢測，獲得了目標結果。Parastara等[34]通過將便攜手持式近紅外光譜技術與最新的分類算法相結合，開發(fā)了一種可用于鑒別雞肉真實性的方法。結果顯示，基于近紅外光譜從凍融的肉中區(qū)分出新鮮的肉，而且可以根據(jù)雞的生長條件對雞柳進行正確分類。這說明手持式NIR結合機器學習算法是一種有用、快速、無損的工具，可以識別雞肉摻假情況。通過測量NIR光譜，為消費者和食品檢驗機構展示了檢查包裝雞柳的真實性和來源的可能性[35]。Ainara等[36]通過研究結合化學計量技術的近紅外光譜的可行性，來檢測切碎的羊肉和牛肉與其他類型肉類混合的摻假行為，該研究準備了不同占比的純羊肉和純牛肉樣品以及混合牛羊肉樣品，使用不同的技術對光譜數(shù)據(jù)進行預處理，并通過主成分分析(principal component analysis，PCA)進行探索，以找出純樣品和混合樣品之間的差異。此外，對每種類型的肉混合物進行PLS-DA，最終獲得較好的分類率。這項研究顯示了將NIRS與PLS-DA結合使用來檢測碎羊肉和牛肉中摻假情況的可能性。光譜技術具有很多優(yōu)勢，如準確度高、檢測速度快等[37-39]，但是對于不同的樣品，需建立相對應的模型，并且需要一個相對龐大的數(shù)據(jù)庫，對數(shù)據(jù)進行降維及提取信息等操作較為繁瑣[40-42]。

4 基于核酸的鑒別方法

隨著實際應用中對鑒別技術的要求不斷提高，基于核酸的檢測技術正在迅速發(fā)展，包括環(huán)介導等溫擴增技術和聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)，其中PCR又可分為實時定量PCR、數(shù)字PCR技術等。以核酸為基礎來鑒別肉及肉制品是否摻假，避免了由于食品加工出現(xiàn)的檢測誤差，穩(wěn)定性較高，檢測更準確，靈敏度更高[9]。

4.1 環(huán)介導等溫擴增技術

全球食品研究越來越重視肉類現(xiàn)場真?zhèn)螜z測，所以在實際檢測中，準確并且有效地進行現(xiàn)場檢測過程至關重要。環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)由Notomi等[43]于2000年首次開發(fā)。該技術的優(yōu)點是可以在恒定溫度下以高特異性和靈敏度來快速、有效地擴增目的片段。LAMP方法中沒有DNA變性步驟，因此不需要復雜的溫度控制設備，從而使核酸擴增過程擺脫了精密儀器的束縛，可以滿足現(xiàn)場檢測的需要，花費時間短，具有鑒定物種真實性的絕佳前景[1]。Abdulmawjood等[44]開發(fā)了一種基于非洲鴕鳥線粒體DNA的細胞色素b基因的環(huán)介導等溫擴增分析方法，并與熒光定量PCR結合使用。此系統(tǒng)能夠檢測出0.01%的鴕鳥肉，對于檢測鴕鳥肉具有極好的靈敏度和特異性，并且從采樣到得到結果僅需15～20 min。Zahradnik等[45]研究用于檢測加工食品中的馬肉，針對靶向馬(Equuscaballus)的線粒體基因組設計了特異性環(huán)介導等溫擴增引物，可檢測出0.1 ng的馬DNA，并可檢測出制備的模型香腸中0.1%的馬肉。雖然LAMP技術具有高靈敏度、操作簡單、便攜且可快速檢測等優(yōu)點，但是LAMP不適用于痕量水平的定量，且原理較為復雜，存在實驗設計要求高、引物設計復雜、擴增的靶序列長度需小于300 bp等缺點[46]。

4.2 聚合酶鏈式反應

由于具有物種之間豐富的多態(tài)性以及與其他生物分子相比的高穩(wěn)定性，DNA是源性成分鑒定的理想目標，聚合酶鏈式反應是檢測肉類是否摻假的應用最廣泛的方法之一[47-49]。Druml等[50]提供了一個單一的實時PCR分析方法，可測定肉制品中鹿的含量[小鹿(Damadama)、馬鹿(Cervuselaphus)和梅花鹿(Cervusnippon)的總和]，從而檢測食品摻假。同時對豬肉中含有等量小鹿、馬鹿和梅花鹿的肉混合物以及野味香腸的分析表明，定量方法非常準確(系統(tǒng)誤差通常<25%)?；谂Ｌ禺愋院图棺祫游锿ㄓ靡铮琇i等[51]開發(fā)了一種新穎、高效、可靠的雙向SYBR Green實時定量PCR(qPCR)方法，用于牛肉產品摻假檢測。通過分析雙鏈PCR產物的熔解曲線峰的數(shù)目、位置，對樣品中的牛源性成分進行鑒定，并初步篩選牛肉產品中的非牛源性成分；同時，可根據(jù)峰的面積比對牛肉的百分比進行半定量。該方法不僅可以有效地鑒定樣品中是否含有牛DNA，而且還可以初步篩選出非牛和半定量牛在總肉成分中的百分比。從DNA序列、DNA擴增產物的熱力學特性以及DNA的熒光信號中可以獲得許多信息，隨后使用該研究中的分析方法可以實現(xiàn)對樣品中物種組成的鑒定和定量。但是聚合酶鏈式反應耗時較長、成本較高，且需建立標準曲線確定樣品的拷貝數(shù)，還要克服潛在的問題(如擴增效率的差異等)[16]。

此外，用于檢測不同動物源性成分DNA的方法還有數(shù)字PCR(dPCR)，即通過對單個模板分子進行計數(shù)，在使用熒光靶標特異性水解探針進行PCR擴增后，可以檢測其陽性擴增。與定量PCR相比，dPCR的優(yōu)勢在于其具有更高的靈敏度和精確度。此外，無需進行標準曲線的繪制，即可提供絕對的核酸濃度測量拷貝數(shù)值[52-53]。定量PCR的精度受到限制，因為它無法精準地區(qū)分小于2倍的差異，并且微量濃度(<1%)的定量通常不準確。相比之下，數(shù)字PCR可以檢測到≤30%的基因表達差異[54]。數(shù)字PCR比熒光定量PCR更能耐受抑制劑[53]，并且由于在不同的反應中進行分配，它對許多可能影響PCR的因素(如交叉反應DNA模板和引物二聚體)具有較強的抵抗力[55]。使用微滴式數(shù)字PCR，可以檢測低濃度模板，具有絕對定量的特點，可精確定量肉類和加工肉制品中的不同種類[56]。但是數(shù)字PCR成本較高，許多實驗室尚不具備數(shù)字PCR相關儀器，這也是限制數(shù)字PCR在各個領域應用的原因之一[57]。

5 展望

隨著經濟的發(fā)展，人們的生活水平日益提高，更多追求的是生活品質，尤其是食品質量安全，如何快速檢測肉類及肉制品的源性成分，以便隨處可檢測、隨時可監(jiān)測，是我們現(xiàn)在并著眼于未來所需要解決的問題。蛋白質在暴露于高溫、高壓、強酸度、高堿度、重金屬鹽和其他條件下時容易變性，所以基于蛋白質的檢測技術不能準確地處理深加工食品。基于蛋白質的檢測方法中，對于未來亟待改進的方面包括：建立相應的各個產品模型的數(shù)據(jù)庫，便于快速在線分析；開發(fā)有效的算法，高效提取特征數(shù)據(jù)；與其他鑒別手段聯(lián)用，同時達到鑒別準確率高、速度快、檢出限低、無損等優(yōu)勢?；诜肿铀降臋z測技術，一方面，進一步研究成本更為低廉、更高效、更靈敏且快速的檢測方法；另一方面，由于系統(tǒng)逐漸完善、體系逐步優(yōu)化，有待開發(fā)一系列能夠對肉類成分進行快速、準確、靈敏檢測的試紙條或試劑盒，以滿足大多數(shù)實驗室的研究，為保障食品安全、有效溯源肉類成分提供充足、有效的參考依據(jù)。