凋亡細胞調(diào)控巨噬細胞表達IL-12家族細胞因子的水平

劉冰慧，龔志平，梅艷芳，楊 濤，馮 軍，錢雪松

(1.河北省承德市中心醫(yī)院檢驗科，河北 承德 067000；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

單核吞噬細胞系統(tǒng)負責吞噬大量的凋亡細胞，避免凋亡細胞的有害成分暴露于周圍組織環(huán)境中，形成潛在的細胞毒性成分、免疫原或者誘發(fā)炎性反應(yīng)的因子，這是機體維持免疫穩(wěn)態(tài)的重要功能。機體維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、控制炎癥的方式不僅包括快速有效地識別清除凋亡細胞，還包括吞噬細胞主動分泌多種促炎因子和抑炎因子并對細胞因子含量進行調(diào)控等方式。巨噬細胞吞噬凋亡細胞的同時其表達和分泌的細胞因子也會受到影響，如凋亡細胞正向調(diào)節(jié)巨噬細胞的白細胞介素 (interleukin，IL)-10和負向調(diào)節(jié)IL-12表達[1]。IL-12家族細胞因子包括IL-12、IL-23、IL-27及IL-35，均是由2個亞基組成的異源二聚體，其中IL-12由p35和p40亞基組成，IL-23由p19和p40亞基組成，IL-12與IL-23共用p40亞單位[2]。IL-12家族細胞因子主要由人體組織中活化的巨噬細胞等抗原提呈細胞產(chǎn)生，IL-12能誘導(dǎo)Th1細胞分化，刺激T細胞、自然殺傷細胞產(chǎn)生干擾素γ，增強自然殺傷細胞活性。IL-23的效應(yīng)是對記憶性的T細胞繁殖進行誘導(dǎo)，從而加速干擾素γ產(chǎn)生。研究在凋亡細胞過量存在的情況下，觀察巨噬細胞受刺激被激活表達IL-12家族細胞因子的變化，同時比較凋亡細胞對一些抑炎性細胞因子的影響，旨在為進一步研究其機制及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗動物和材料 SPF級C57BL/6小鼠4只，雌雄各半，6～8周齡，體重25～30 g，飼養(yǎng)于河北省實驗動物中心(不限食物與水攝入)，動物許可號為B00005887∶1。人外周白血病T 細胞(Jurkat 細胞)和小鼠巨噬細胞系RAW264.7(RAW 細胞)購自中國醫(yī)科院細胞中心。

1.2主要試劑及藥物 RNAiso Plus提取試劑、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(TaKaRa公司)，ReverAid首鏈cDNA合成試劑盒(Fermentas Inc.)，Real-Time PCR引物(上海生工合成)，DMEM(高糖)培養(yǎng)基、PBS(Gibco BRL公司)，胎牛血清(fatal bovine serun，F(xiàn)BS)(ExCell Biology公司)，胰酶、脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)(美國Sigma公司)，二甲基亞砜(天津市化學(xué)試劑廠)，青霉素、鏈霉素(華北制藥公司)，羊抗鼠IgG-HRP(北京中杉金橋生物公司)，DEPC(Promega公司),β-actin Rabbit Ab (北京賽諾博生物技術(shù)中心)，細胞培養(yǎng)板(Costoor公司)，IL-10、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)試劑盒(深圳市亞輝龍生物科技有限公司)。

1.3細胞培養(yǎng)

1.3.1細胞復(fù)蘇方法 從液氮貯存罐保存的細胞中選擇所需細胞，置在37 ℃水浴箱快速解凍。充分混合均勻后以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，應(yīng)用含量為10%的DMEM培養(yǎng)液將細胞沉淀懸起，并接種在培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%CO2環(huán)境的孵育箱中進行培養(yǎng)，第2天記錄觀察細胞存活情況和貼壁情況，并換置DMEM培養(yǎng)液。

1.3.2細胞傳代方法 當細胞量足夠覆蓋培養(yǎng)瓶90%以上面積時，倒掉培養(yǎng)液，用PBS清洗，0.25%胰酶1 mL加入培養(yǎng)瓶消化約4 min，用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，細胞腫大排列松散即可停止消化，棄掉含消化酶的培養(yǎng)液，再加入10%DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液，取1/4細胞懸液接種到另一個培養(yǎng)瓶，以3 d為1個周期進行傳代。

1.3.3收集小鼠腹腔巨噬細胞 選取C57BL/6小鼠每只經(jīng)腹腔注射1 mg 3%巰基乙酸鹽，3 d后處死小鼠并向腹腔內(nèi)注射10 mL無菌PBS灌注清洗，抽取腹腔灌洗液，用細胞培養(yǎng)液洗滌懸浮小鼠腹腔巨噬細胞，將其接種并培養(yǎng)在培養(yǎng)板里。

1.3.4制備凋亡Jurkat細胞 應(yīng)用Annexin-V-Biotin凋亡檢測試劑盒，方法嚴格按照說明書進行。促凋亡藥物使用staurosporine，用流式細胞檢測儀測定細胞凋亡情況，將數(shù)據(jù)圖像保留記載。

1.4分組激活巨噬細胞

1.4.1分組刺激RAW264.7細胞 解凍復(fù)蘇RAW264.7細胞在6孔板中孵育(2×106/孔)，細胞貼壁更換用無血清的DMEM培養(yǎng)過夜。棄培養(yǎng)液后重新各加入2 mL無血清DMEM，分別加入空白(Med)、LPS(1 mg/L)、apo(1×106/孔)和LPS(1 mg/L)+apo作用RAW264.7細胞6 h，PBS洗滌細胞3次后，收集細胞提取RNA。24 h后收集上清液用于ELISA檢測。

1.4.2分組刺激小鼠腹腔巨噬細胞 培養(yǎng)后的小鼠腹腔巨噬細胞大約為1×106/mL，將細胞培養(yǎng)液換成無血清DMEM，分別以LPS(1 mg/L)、apo和LPS+apo作用小鼠腹腔巨噬細胞6 h后，用PBS洗滌細胞3次后，收集細胞提取RNA。

1.5SYBR Green熒光染料法Real-time PCR檢測細胞因子mRNA表達 用Trizol 試劑提取各組細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)美國生物技術(shù)信息中心發(fā)布的小鼠IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19基因序列，借助primer 5.0，自基因序列的外顯子中分別設(shè)計2條引物以檢測各細胞因子mRNA表達水平。mouse p19 cDNA：sense,5′-TGCACCAGC-GGGACATATGAATCT-3′；antisense,5-TGTT-GTCCTTGAGTCCTTGTGGGT-3。mouse p35 cDNA：sense,5-ACCTGCTGAAGACCACAGAT-GACA-3；antisense,5-TAGCCAGGCAACTCTCG-TTCTTGT-3。mouse p40 cDNA：sense,5-ACCT-GTGACACGCCTGAAGAAGAT-3；antisense,5-TCTTGTGGAGCAGCAGATGTGAGT-3。以cDNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。用 2-△△Ct法分析所得real-time PCR數(shù)據(jù)。

1.6IL-10、PGE2和TGF-β濃度檢測 取Med、LPS、LPS+apo組細胞上清液，根據(jù)ELISA法檢測IL-10、PGE2、TGF-β濃度，嚴格按試劑盒說明書操作。繪制校準品OD值與標示濃度的關(guān)系曲線，由樣本OD值計算對應(yīng)的IL-10、PGE2和TGF-β濃度。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.1統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較分別采用F檢驗和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1LPS和凋亡細胞對RAW細胞或小鼠腹腔巨噬細胞表達IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19 mRNA的影響 RAW細胞和小鼠腹腔巨噬細胞表達IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19 mRNA的水平，單獨apo刺激組只表現(xiàn)出基礎(chǔ)表達量，LPS刺激組明顯升高且高于LPS+apo組(P<0.05)，見表1，2。

活化后2種細胞表達IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19 mRNA的變化趨勢相似。

組別L-12p35IL-12p40IL-23p19Med組0.97±0.131.11±0.071.03±0.16apo組1.21±0.221.27±0.111.20±0.33LPS組22.22±5.75?#315.61±38.39?#61.35±7.22?#LPS+apo組14.68±2.05?#△182.28±16.66?#△28.19±7.54?#△F值21.965114.67379.853P值0.0000.0000.000

*P值<0.05與Med組比較 #P值<0.05與apo組比較 △P值<0.05與LPS組比較(SNK-q檢驗)

組別L-12p35IL-12p40IL-23p19Med組0.96±0.061.01±0.101.47±0.27apo組1.14±0.121.38±0.061.92±0.20LPS組114.15±7.21?#1 842.41±106.82?#15.57±2.23?#LPS+apo組59.21±8.48?#△871.43±73.27?#△7.53±1.10?#△F值21.965114.67375.289P值0.0010.0000.000

*P值<0.05與Med組比較 #P值<0.05與apo組比較 △P值<0.05與LPS組比較(SNK-q檢驗)

2.2LPS和apo對RAW細胞分泌IL-10、PGE2、TGF-β濃度的影響 LPS組IL-10、PGE2、TGF-β濃度高于Med組，LPS+apo組TGF-β濃度高于Med組和LPS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；LPS組和LPS+apo組IL-10、PGE2濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

組別IL-10PGE2TGF-βMed組52.59±10.2443.42±8.4619.55±4.15LPS組275.77±10.66?1 442.39±145.55?73.24±9.90?LPS+apo組278.20±9.28?1 485.07±201.05?179.23±15.45?#F值100.617.98642.116P值0.0000.0050.001

*P值<0.05與Med組比較 #P值<0.05與LPS組比較(SNK-q檢驗)

3 討 論

細胞凋亡是多細胞生物為維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定由基因調(diào)控的細胞主動死亡過程。當細胞生長到逐漸老化、發(fā)育特征異常、有害成分暴露等情況時，其會發(fā)出凋亡信號激活吞噬細胞系統(tǒng)，最終被吞噬、消化、吸收。此過程對于維持機體穩(wěn)態(tài)、避免炎癥反應(yīng)發(fā)生和組織過度增生至關(guān)重要。細胞凋亡過程及吞噬細胞吞噬消化凋亡細胞的過程中出現(xiàn)任何異常，均會與某些疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的皮膚經(jīng)紫外線照射后，會出現(xiàn)凋亡細胞大量堆積，其淋巴結(jié)和血液中的凋亡細胞也逐漸增多[3-4]；急性髓系白血病患者和慢性粒性細胞白血病患者體內(nèi)的腫瘤細胞異常高表達“Don′t eat me”信號躲避吞噬細胞的識別[5]。研究細胞凋亡清除機制、凋亡細胞清除障礙導(dǎo)致疾病發(fā)生發(fā)展的機制，可以為開發(fā)新的疾病治療途徑和藥物提供分子學(xué)理論基礎(chǔ)。

細胞凋亡時發(fā)出“Eat me”信號可被吞噬細胞識別，這種信號主要以細胞膜結(jié)構(gòu)或成分改變表現(xiàn)的，包括細胞膜內(nèi)層磷脂酰絲氨酸翻轉(zhuǎn)暴露于細胞膜外層[6-7]、細胞間黏附分子3(intercellular adhesion molecule-3，ICAM-3)[8-9]和ICAM-1[10-11]異常表達以及鈣網(wǎng)蛋白暴露與重新分布[12-13]等形式，其中磷脂酰絲氨酸外翻被認為是最明確的“Eat me”信號。巨噬細胞快讀準確識別凋亡細胞發(fā)出的“Eat me”，通過巨噬細胞吞噬受體結(jié)合凋亡細胞相關(guān)配體的方式開啟吞噬過程[14-15]。實驗以凋亡細胞作為影響因素，某些疾病的某些時期機體組織中凋亡細胞逐漸增多，巨噬細胞被活化、識別、吞噬、分解凋亡細胞的過程中，表達和分泌的細胞因子發(fā)生變化，其中包括代表促炎因子IL-12家族的IL-12、IL-23，通過檢測p35、p40和p19亞基分析IL-12、IL-23表達量的變化，還有代表抑炎因子的IL-10、PGE2和TGF-β的變化。促炎/抑炎因子表達失衡是很多疾病發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)。

本研究使用小鼠腹腔巨噬細胞和RAW264.7細胞，腹腔巨噬細胞更接近人類原代細胞，更能代表人體內(nèi)的情況。刺激因子使用LPS，LPS是存在于革蘭陰性菌細胞壁的內(nèi)毒素成分，可以通過刺激巨噬細胞等炎癥效應(yīng)細胞產(chǎn)生炎性因子或者直接導(dǎo)致靶細胞損傷，激活全身炎癥反應(yīng)。結(jié)果顯示凋亡細胞抑制了LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞表達IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19 mRNA水平，凋亡細胞對IL-10和PGE2無影響，但促進TGF-β分泌。說明炎癥發(fā)生時體內(nèi)產(chǎn)生大量凋亡細胞，凋亡細胞反過來可以適當抑制一些促炎因子的表達，促進部分抑炎因子分泌，起到了維持促炎/抑炎因子平衡的作用。并且發(fā)現(xiàn)，不同刺激因素作用于2種巨噬細胞，細胞因子表達變化情況無明顯差異，故在后續(xù)研究過程中，能夠使用更加易得的RAW264.7細胞。

吞噬細胞包括了組織中可以在一定范圍內(nèi)移動的巨噬細胞和循環(huán)系統(tǒng)中招募的吞噬細胞。機體各組織新陳代謝產(chǎn)生的凋亡細胞釋放“Eat me”趨化因子吸引鄰近巨噬細胞，吞噬可能是巨噬細胞吞噬整個凋亡細胞后胞內(nèi)分解消化，也可能先將凋亡細胞分解為小碎片再吞噬[16-17]。但吞噬作用均不會影響周圍的正常組織細胞，可能是因為正常數(shù)量的凋亡細胞誘導(dǎo)吞噬分解，不啟動免疫反應(yīng)，但在某些病理狀態(tài)下，如炎癥、腫瘤、自身免疫病等大量凋亡細胞產(chǎn)生時，會負向調(diào)節(jié)IL-12家族等促炎因子，并促進TGF-β等抑炎因子分泌，發(fā)揮了維持細胞因子平衡的作用。婦科腫瘤患者腫瘤細胞生長迅速，凋亡的腫瘤細胞增多，血清中TGF-β含量明顯高于非腫瘤患者，而化療后隨著腫瘤細胞減少，血清TGF-β減低[18]。當然，這種作用力度有多大？這種調(diào)節(jié)作用是如何作用于巨噬細胞的？影響了哪些細胞傳導(dǎo)通路？均需要進一步研究。細化作用機制、明確作用途徑可以為很多疾病的基因靶向治療提供分子基礎(chǔ)。