雄激素對再生障礙性貧血患者端粒長度影響的研究

張慧敏，袁麗倩，史奎竹，高習(xí)華，謝清清，陶朝欣

(河北省石家莊平安醫(yī)院血液科，河北 石家莊 050021)

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)是一種以全血細(xì)胞減少和骨髓發(fā)育不良為特征的骨髓衰竭綜合征，T淋巴細(xì)胞異?；罨瞧渲饕l(fā)病機(jī)制。近年發(fā)現(xiàn)，遺傳易感性在AA發(fā)病中占有重要地位，特別是端粒長度縮短和端粒酶基因突變[1]。免疫抑制治療雖已明顯提高AA緩解率，但臨床上仍有1/3的患者治療無效，其中部分應(yīng)用雄激素有效，這些患者可能存在端粒異常。端粒是位于真核細(xì)胞線性染色體末端的TTAGGG高度重復(fù)序列，長5～20 kb，主要功能是維持染色體完整和穩(wěn)定[2]。端粒隨細(xì)胞分裂而逐漸縮短，當(dāng)縮短到一定程度就會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，故被稱為細(xì)胞的“有絲分裂鐘”。AA患者端?？s短，縮短程度與病情嚴(yán)重程度相關(guān)，也與復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)、克隆演變及低生存率相關(guān)[3]，AA可能被視為一種獲得性端粒疾病。早在20世紀(jì)50～60年代，雄激素便用于AA的治療，且療效可靠，但其作用機(jī)制一直不十分明確。Calado等[4]研究顯示，雄激素可能通過增加端粒酶基因表達(dá)及端粒酶活性使端粒延長。本研究旨在探討雄激素對AA患者端粒長度的影響以及端粒在AA發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月—2016年6月河北省石家莊平安醫(yī)院血液科收治的成人初診非重型AA患者30例，均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》中AA診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。按隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為環(huán)孢素A(cyclosporin A,CsA)組和CsA+雄激素組各15例。CsA組男性8例，女性7例，年齡25～69歲，平均(40.5±11.3)歲；CsA+雄激素組男性7例，女性8例，年齡24～67歲，平均(41.6±15.2)歲。另選取同期體檢健康成人15例為對照組，男性8例，女性7例，年齡25～68歲，平均(42.3±12.5)歲。3組性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2治療方案 CsA+雄激素組：環(huán)孢素膠囊(強(qiáng)盛)3～5 mg·kg-1·d-1，分2次口服；定期監(jiān)測血藥濃度，使CsA濃度維持在150～250 μg/L；司坦唑醇片(康力龍)0.1～0.3 mg·kg-1·d-1，分3次口服。 CsA組：單用環(huán)孢素膠囊，劑量與濃度同CsA+雄激素組。治療期間定期復(fù)查血常規(guī)、肝腎功能及腹部彩色超聲。對有感染者應(yīng)用抗生素治療，嚴(yán)重貧血或出血者酌情輸注紅細(xì)胞或血小板治療。

1.3結(jié)局指標(biāo) 主要療效終點(diǎn)：基線及治療后3，6，9，12個(gè)月外周血白細(xì)胞端粒長度。次要療效終點(diǎn)：基線及治療后3，6，9，12個(gè)月血常規(guī)(白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血小板數(shù)目)。血液學(xué)改善定義為：與基線相比，血紅蛋白水平增加≥1.5 g/L或不再需要輸血或輸血次數(shù)減少>50%，血小板計(jì)數(shù)增加≥20×109/L或中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加≥0.5×109/L。主要安全終點(diǎn)：司坦唑醇不良反應(yīng)(女性男性化、粉刺、肝毒性)。

1.4端粒長度檢測 應(yīng)用儀器及試劑：微型離心機(jī)(mini-6K)；定量PCR儀Cobas z 480(Roche)(51052)；移液槍(eppendorf)；酶標(biāo)儀(美國biotek)；-80 ℃冰箱(Haier)；核酸提取儀(MagCore)；核酸提取試劑盒(MagCore Genomic DNA Whole Blood Kit)；SYBR Select Master Mix(applied biosysrems by Thermo Fisher Scientific)；Taq酶(TAKARA)；ddH2O(TAKARA)。

抽取外周血2 mL，EDTA抗凝。應(yīng)用核酸提取儀以及核酸提取試劑盒按照說明書步驟提取樣本基因組DNA，并進(jìn)行純度及濃度測定。純度：OD260/280在1.6～1.9之間，并將DNA調(diào)整終濃度至20 ng/μL，留樣本備用。所有DNA樣本放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)錂z。

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定相對端粒長度。分別檢測樣品端粒(Tel)與內(nèi)參 36B4 基因 PCR 擴(kuò)增的 Ct 值(熒光起始的循環(huán)數(shù))。引物Tel：Forward，5′-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTT-GGGTTTGGGTTTGGGTT-3′；Reverse，5′-GGC-TTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT3′。引物36B4：Forward，5′-CAGCAAGT-GGGAAGGTGTAATCC-3′；Reverse,5′-CCCA-TTCTATCATCAACGGGTACAA-3′。PCR反應(yīng)：按以下反應(yīng)體系進(jìn)行，2×Vazyme LAmp Master Mix 2 μL，ddH2O 3.7 μL，上下游引物各0.15 μL，DNA模板1 μL。端粒Tel基因的反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min(95℃ 5 s，63 ℃ 5 s，72 ℃ 20 s共40循環(huán))，72 ℃ 10 min，18 ℃ 10 min。內(nèi)參36B4基因的反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min(95 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 40 s共40循環(huán))，72 ℃ 10 min，18 ℃ 10 min。數(shù)據(jù)處理：應(yīng)用熒光定量 PCR儀配套軟件，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次PCR反應(yīng)均進(jìn)行1個(gè)不加模板DNA，1個(gè)不加引物(陰性對照)的反應(yīng)體系，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)>0.98。

分別確定樣品端粒及內(nèi)參36B4基因PCR擴(kuò)增的Ct值，在定量PCR中端粒(T)重復(fù)拷貝的比率與單拷貝36B4基因(S)的比率即T/S是確定的，T/S比率與端粒長度成正比例關(guān)系，端粒長度可以根據(jù)T/S測定?！鰿t = CtTel-Ct36B4，相對T/S比率= 2-(△Ct1-△Ct2)=2-△△Ct，△Ct1為每個(gè)樣品T/S比率，△Ct2為參考DNA的T/S比率，根據(jù)此公式可計(jì)算出每個(gè)樣本的相對T/S值，該值與樣品DNA的相對端粒長度對應(yīng)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較分別采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)和重復(fù)測量的方差分析；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1端粒長度相對T/S比率比較 AA患者基線端粒長度相對T/S比率為0.765±0.271，低于對照組的0.978±0.344(t=2.270，P=0.028)。治療后,CsA組端粒長度相對T/S比率波動降低，CsA+雄激素組端粒長度相對T/S比率逐漸升高，CsA+雄激素組端粒長度相對T/S比率高于CsA組，其組間、時(shí)點(diǎn)間、組間·時(shí)點(diǎn)間交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

組別基線3個(gè)月6個(gè)月9個(gè)月12個(gè)月CsA組0.765±0.2710.711±0.3250.673±0.2130.731±0.3010.655±0.225CsA+雄激素組0.757±0.2680.761±0.3030.846±0.2270.908±0.2100.973±0.432組間F值=173.258 P值=0.000時(shí)點(diǎn)間F值=5.194 P值=0.032組間·時(shí)點(diǎn)間F值=2.529 P值=0.017

2.22組血液學(xué)改善率比較 治療后12個(gè)月時(shí)CsA+雄激素組血液學(xué)改善率高于CsA組(P<0.05)，而治療后3，6，9個(gè)月時(shí)2組血液學(xué)改善率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 CsA組與CsA+雄激素組血液學(xué)改善率比較Table 2 Comparision of the ratio of hematological improvement between CsA group and CsA+androgen group (n=15，例數(shù)，%)

3 討 論

端粒是位于線性染色體末端富含G的高度串聯(lián)重復(fù)序列，端粒相關(guān)蛋白Shelterin復(fù)合體(TRF1、TRF2、TIN2、RAP1、POT1、TPP1)覆蓋在端粒上保護(hù)其不受破壞。端粒DNA包括雙鏈和3′單鏈，3′單鏈可插入雙鏈部分形成特有的T-環(huán)，端粒由于富含G堿基，還可形成G聚體結(jié)構(gòu)[6]。端粒的作用是維持染色體完整和穩(wěn)定。端粒長度隨細(xì)胞分裂逐漸縮短，當(dāng)細(xì)胞分裂超過Hayflick極限時(shí)，染色體極不穩(wěn)定，導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。端粒長度的維持主要依靠端粒酶。端粒酶是一種核糖蛋白，主要包括端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)、端粒酶核糖核酸(telomerase RNA，TERC)和端粒酶相關(guān)蛋白(telomerase protein，TP)3個(gè)部分。端粒酶以TERC為模板，TERT為催化亞單位，以逆轉(zhuǎn)錄方式來延長細(xì)胞分裂時(shí)丟失的端粒。DNA修復(fù)蛋白Ku蛋白可以招募端粒酶參與端粒DNA修復(fù)，防止染色體異常融合[7]。Ku蛋白、減數(shù)分裂重組蛋白11、多聚酶1等DNA修復(fù)蛋白與Shelterin復(fù)合體一起調(diào)控端粒長度及結(jié)構(gòu)。慢性炎癥[8]、超重[9]、吸煙、飲酒等均能使端?？s短。系統(tǒng)性紅斑狼瘡[10]、冠心病[11]等多種疾病均存在端?？s短。端粒酶與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，TERT基因多態(tài)性是增加腫瘤易感性的危險(xiǎn)因素[12]，TERT表達(dá)水平增高對腫瘤的診斷具有重要意義[13]。

正常的端粒長度和端粒酶活性對于維持干細(xì)胞自我更新和增殖分化能力具有重要意義。端粒缺陷可影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[14]、造血干細(xì)胞等的活性，是干細(xì)胞儲備凋亡性損耗的核心。端粒(缺陷)綜合征可以表現(xiàn)為骨髓衰竭、肺纖維化和肝硬化等，其中由端粒相關(guān)基因突變導(dǎo)致的先天性角化不良是最具代表性的端粒(缺陷)綜合征之一。AA是最常見的獲得性骨髓衰竭性疾病，細(xì)胞免疫異常是其主要發(fā)病機(jī)制，端粒異常在AA發(fā)病中也發(fā)揮重要作用。約1/3的獲得性AA患者端粒長度短于同年齡正常人，這部分患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)大，且轉(zhuǎn)化為骨髓增生異常綜合征或白血病的概率大，總生存率低[3]。免疫抑制治療是治療AA的主要方法，免疫抑制治療無效的患者部分應(yīng)用雄激素治療有效。雄激素治療AA療效確切，但機(jī)制一直不很明確。Calado等[4]發(fā)現(xiàn)雄激素在體內(nèi)通過芳香化酶轉(zhuǎn)化為雌激素，通過雌激素受體α途徑與端粒酶TERT上的雌激素受體成分結(jié)合，上調(diào)外周血或骨髓淋巴細(xì)胞和CD34+細(xì)胞TERT基因表達(dá)及端粒酶活性，使造血細(xì)胞恢復(fù)增殖。同年齡成年女性較同年齡男性的端粒長度長，或是因?yàn)樾约に胤置诘牟町愃?。雄激素可以使端粒功能缺陷的小鼠模型端粒延長、血液學(xué)改善。Townsley等[15]應(yīng)用雄激素治療AA、骨髓增生異常綜合征患者27例，24個(gè)月時(shí)83%患者出現(xiàn)血液學(xué)反應(yīng)，92%患者外周血白細(xì)胞端粒長度平均延長386 bp。這些均提示端?？s短的AA患者選擇雄激素治療可能更為有效。

本研究結(jié)果顯示，AA患者基線端粒長度相對T/S比率明顯低于對照組。端粒長度檢測方法主要有Southern印記雜交、定量聚合酶鏈反應(yīng)、原位雜交熒光定量、流式-熒光原位雜交等?？偨Y(jié)既往關(guān)于骨髓衰竭綜合征患者端粒長度的文獻(xiàn)，檢測標(biāo)本多為外周血白細(xì)胞或粒細(xì)胞，標(biāo)本選取的不同，直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不同細(xì)胞端粒長度不同，且檢測方法及實(shí)驗(yàn)室條件不同結(jié)果亦有誤差，這一點(diǎn)在科研中具有重要意義。關(guān)于外周血中不同白細(xì)胞亞群端粒長度的情況，國內(nèi)還沒有相關(guān)研究；采用Flow-FISH方法檢測發(fā)現(xiàn)，AA患者外周血粒細(xì)胞端粒長度短于同齡正常人，但淋巴細(xì)胞端粒長度沒有明顯變化。雖然各種檢測方法不同，結(jié)果也不盡相同，但可以確定AA發(fā)病機(jī)制與端粒長度有關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，CsA組治療后端粒長度相對T/S比率波動降低，CsA+雄激素組端粒長度相對T/S比率逐漸升高，表明隨著雄激素的應(yīng)用，端粒不但損耗減慢甚至得以延長；CsA+雄激素組端粒長度相對T/S比率高于CsA組，其組間、時(shí)點(diǎn)間、組間·時(shí)點(diǎn)間交互作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明CsA治療AA并不改善端粒長度，CsA的作用位點(diǎn)可能不在端粒，故單純CsA治療后端粒延長不明顯，而雄激素可以顯著延長端粒長度。

本研究結(jié)果顯示，雄激素與CsA聯(lián)合應(yīng)用使AA患者血液學(xué)改善率高于單用CsA，血液學(xué)改善與雄激素延長端粒相一致，表明雄激素在治療AA伴端粒功能障礙方面是有效的，可以獲得有臨床意義的血液學(xué)改善。雄激素應(yīng)用于AA治療無嚴(yán)重的不良反應(yīng)，端粒長度可以作為AA患者治療選擇的指標(biāo)之一。本研究結(jié)果對于類似中國這樣的發(fā)展中國家在臨床中廣泛應(yīng)用雄激素治療血液疾病可能有更廣泛的意義，將來雄激素治療有望進(jìn)一步應(yīng)用于治療、預(yù)防與短端粒和復(fù)制障礙有關(guān)的其他疾病。