基因組編輯技術(shù)在馬鈴薯精準(zhǔn)分子育種中的應(yīng)用及研究展望

葉明旺 李燦輝 龔明

（1. 云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心 云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點實驗室，昆明 650500；2. 云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院 云南省高校馬鈴薯生物學(xué)重點實驗室，昆明 650500）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是世界上最重要的塊莖類糧食作物，其在單位土地和時間內(nèi)所提供的糖類、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)以及維生素超過了其他任何作物［1］。除了可以鮮食之外，馬鈴薯還可以通過工業(yè)加工成許多商品，如薯片、酒精、淀粉、動物飼料等［2-3］。由于馬鈴薯栽培種絕大多數(shù)為四倍體，常規(guī)育種方法周期漫長，費時費工。盡管傳統(tǒng)育種方法已經(jīng)成功育成了許多品種，但是絕大多數(shù)馬鈴薯栽培種是高度雜合的同源四倍體，要想將有益突變集中到一個品種當(dāng)中相當(dāng)困難，通常育成一個成熟的品種需要十幾年的時間［4］。然而，隨著全球氣候變化、新病原體的出現(xiàn)以及提高馬鈴薯品質(zhì)、儲藏性、抗逆性等的需要，要求培育出具有理想農(nóng)藝性狀的馬鈴薯新品種。目前，通過多種分子輔助育種方法來進行馬鈴薯性狀的改良，進而提高產(chǎn)量、加工品質(zhì)以及儲藏品質(zhì)等方面已取得了一些進展［5］。隨著馬鈴薯的基因組測序完成［6］，以及基因組編輯技術(shù)的迅猛發(fā)展，使得馬鈴薯的育種改良進程得以加快，定向設(shè)計和精準(zhǔn)分子育種成為可能。本課題組在2018年通過CRISPR/Cas9基因組編輯體系對自交不親和的二倍體馬鈴薯S-RNase基因進行了編輯敲除，成功獲得了自交親和的二倍體馬鈴薯突變材料，為后續(xù)的二倍體馬鈴薯雜交育種體系建立奠定了重要的基礎(chǔ)［7］。本文簡要綜述了3類主流基因組編輯技術(shù)的原理，回顧了基因組編輯技術(shù)在馬鈴薯品種改良和精準(zhǔn)分子育種中的應(yīng)用，討論了基因組編輯技術(shù)對于馬鈴薯精準(zhǔn)分子育種的意義和目前存在的問題，并對基因組編輯技術(shù)在馬鈴薯精準(zhǔn)分子育種中的應(yīng)用進行了展望，旨在為該技術(shù)在以后的馬鈴薯精準(zhǔn)分子育種中的應(yīng)用提供借鑒和新思路。

1 基因組編輯技術(shù)

基因組編輯技術(shù)是通過位點特異性核酸酶（Site-specific nucleases，SSNs）對靶位點造成DNA的雙鏈斷裂（Double strand breaks，DSBs），從而引發(fā)機體的修復(fù)機制，修復(fù)機制包括兩種：非同源末端連接和同源重組修復(fù)［8］。非同源末端連接是一種高效的修復(fù)方式，能夠快速在斷口完成修復(fù)，但是重復(fù)的修復(fù)會引入錯配，導(dǎo)致斷裂位點產(chǎn)生缺失或者插入突變；這些突變使得基因的閱讀框發(fā)生了變化，進而翻譯出無功能或功能變異的蛋白，從而達到敲除該基因的目的。同源重組修復(fù)指的是斷裂位點在修復(fù)的時候直接以轉(zhuǎn)入細(xì)胞的與斷裂位點同源的外源片段作為修復(fù)模板，使得在斷口位置插入特定的基因或片段［9］。在此基礎(chǔ)上，人們可以對任何已知序列的基因進行敲除以研究其功能，同時也可以對目的基因進行定點修復(fù)，使之恢復(fù)或者替換基因功能。目前主要用于基因組編輯的有3種SSNs：鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs） 以 及 RNA 介 導(dǎo) 的 規(guī)律的成簇間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 9，CRISPR/Cas9）。

1.1 ZFNs

ZFNs是由人工合成的核酸酶，包括了兩個結(jié)構(gòu)域：一個是由多個鋅指結(jié)構(gòu)組成的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，每個鋅指結(jié)構(gòu)能結(jié)合3 bp的DNA序列［10-11］；另一個是由非特異性核酸內(nèi)切酶FokⅠ組成的DNA斷裂結(jié)構(gòu)域［12］。FokⅠ需要以二聚體的形式才能夠行使斷裂功能［13］，因此需要在靶點兩端單獨設(shè)計ZFN，使與之相連的FokⅠ核酸酶能夠在靶點聚集，增加形成二聚體的概率，完成切割DNA雙鏈并引發(fā)細(xì)胞的修復(fù)機制。

早在2001年，Bibikova等［14］就通過人工合成的ZFNs和外源質(zhì)粒注射到非洲蟾蜍的卵母細(xì)胞中，成功獲得了經(jīng)過切割修復(fù)的質(zhì)粒。隨后，Bibikova等［15］又在果蠅中實現(xiàn)了對Y（yellow）基因進行定向突變，催生了ZFNs在基因組編輯中的應(yīng)用。ZFNs已被報道應(yīng)用于一些植物基因組編輯當(dāng)中，如擬南芥［16］、玉米［17］、大豆［18］等，但未見到以馬鈴薯為材料的報道。

雖然ZFNs能夠大大提高基因的編輯效率，但是由于公開的鋅指模塊較少，構(gòu)建一個能夠識別特定靶位點的ZFNs需要通過大量的篩選獲得能夠特異結(jié)合靶位點的鋅指蛋白。此外，ZFNs對細(xì)胞的毒性也限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用［19］。

1.2 TALENs

人工改造的TALENs和ZFNs原理相似，其斷裂結(jié)構(gòu)域同樣由非特異性核酸內(nèi)切酶FokⅠ組成；其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是黃單胞菌入侵植物時所分泌的轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物［20］（Transcription activator-like effector，TALEs）。TALEs能夠進入細(xì)胞核，結(jié)合特定的DNA序列，激活部分基因的表達，增加植物對病毒的敏感性，也有可能引發(fā)植物防御機制。TALEs是由多個33-35個氨基酸組成的串聯(lián)重復(fù)序列組成，每個重復(fù)大部分氨基酸的序列是不變的，只有在12/13位的氨基酸（重復(fù)可變雙殘基，Repeat-variable diresidues，RVDs）是可變的。含有不同RVDs的重復(fù)序列能夠一對一的識別不同的堿基，利用特定的TALEs模塊組合，能夠?qū)崿F(xiàn)識別任何DNA序列的目的。連接在TALEs上的核酸酶FokⅠ在局部形成二聚體，就能在靶位點進行精確DSBs，實現(xiàn)基因組編輯的目的［21-22］。相對ZFNs來說，TALENs省去了大規(guī)模篩選鋅指結(jié)構(gòu)的程序，加大了靶向任何序列的能力，但是實現(xiàn)TALENs模塊的組裝比較費時費力，影響了該技術(shù)的大規(guī)模推廣。

自2010年以來，TALENs在酵母中完成了對外源質(zhì)粒的DSBs以及同源重組修復(fù)后，該技術(shù)已經(jīng)在一些農(nóng)作物上進行了應(yīng)用，如煙草［23］、大豆［24］等。TALENs在馬鈴薯中也有幾個成功的例子，2015年，Nicolia等［25］建立了馬鈴薯原生質(zhì)體的基因組編輯體系，其編輯效率達到了10%。同樣，TALENs介導(dǎo)的同源重組修復(fù)在馬鈴薯中也成功實現(xiàn)，Butler等［26］2016年通過雙生病毒提供了大量的修復(fù)模板，成功提高了在馬鈴薯中的同源重組效率。

1.3 CRISPR/Cas9

早在1987年，日本科學(xué)家Ishino等［27］在研究大腸桿菌的iap基因的時候，在其側(cè)翼發(fā)現(xiàn)了一連串由29個堿基組成的串聯(lián)重復(fù)序列，其間由32個特異堿基間隔開。在之后的研究中發(fā)現(xiàn)，這類結(jié)構(gòu)存在于許多的原核生物中［28］。這種結(jié)構(gòu)在2002年被正式命名為CRISPR，其間的間隔特異序列被稱之為Spacer。2005年，Bolotin［29］通過比較嗜熱鏈球菌的CRISPR序列和噬菌體的基因組時發(fā)現(xiàn)，噬菌體的序列與Spacer的序列是部分匹配的，同時證實了CRISPR系統(tǒng)與嗜熱鏈球菌抵抗病毒相關(guān)。科學(xué)家們在對CRISPR的進一步研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌可以掃描噬菌體中在序列3’端含有NGG也就是PAM序列的DNA序列并進行切割，然后整合到細(xì)菌自身的CRISPR序列當(dāng)中，形成新的Spacer；當(dāng)噬菌體再次入侵的時候，CRISPR序列轉(zhuǎn)錄成CRISPR RNA，經(jīng)加工成熟后與Cas蛋白結(jié)合，引導(dǎo)Cas蛋白切割與之匹配的噬菌體DNA序列，達到防御的目的。

CRISPR根據(jù)基因的保守性和組織排列特異性分為3種類型：I型和III型需要6到7種蛋白質(zhì)才能發(fā)揮作用，目前通常用的是II型的CRISPR，只需要一種Cas9蛋白就能發(fā)揮作用［30］。2012年，Jinek等［31］首先構(gòu)建了CRISPR/Cas9載體，完成了環(huán)狀DNA以及線性化DNA的體外切割。該系統(tǒng)主要含有兩部分：Cas9蛋白以及導(dǎo)向靶基因的單鏈引導(dǎo)RNA（Single guide RNA，sgRNA）。因為潛在的靶點很多，以及載體構(gòu)建方便，CRISPR/Cas9系統(tǒng)開始大規(guī)模應(yīng)用于各種生物的研究。

目前，CRIPSR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于多種植物基因組編輯上［32］。在馬鈴薯中，Butler 等［33］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)分別對二倍體和四倍體馬鈴薯的乙酰乳酸合成酶基因（Acetolactate synthase1，StALS1）進行了敲除，其中突變效率最高達到了60%。Hiroaki等［34］利用水稻的OsMac3的翻譯增強子插入到啟動子和Cas9基因之間，能夠明顯增加馬鈴薯等位基因的突變效率。Nadakuduti等［35］還對比了CRISPR/Cas9和TALENs在馬鈴薯原生質(zhì)體中的突變效率，研究表明Cas9的編輯效率（27.4%）明顯高于TALENs的編輯效率（12.6%）。另外，Veillet等［36］通過胞嘧啶單堿基核苷酸編輯使StALS1突變，使馬鈴薯獲得了除草劑抗性，結(jié)合農(nóng)桿菌侵染方法，從而獲得不含外源DNA片段的基因組編輯植株。

2 基因組編輯在馬鈴薯品種改良和精準(zhǔn)分子育種中的應(yīng)用

2.1 降低馬鈴薯塊莖中糖苷生物堿含量

糖苷生物堿（Steroidal glycoalkaloids，SGAs）是一種存在于馬鈴薯中的有毒物質(zhì)［37］，是影響馬鈴薯品質(zhì)的重要性狀。在馬鈴薯育種過程中，通過與野生種馬鈴薯雜交，能夠帶來一些優(yōu)異的抗病性狀，但同時也會提高SGAs的含量［38］，所以控制SGAs的含量對于馬鈴薯育種來說是非常重要的。

甾醇側(cè)鏈還原酶2（SSR2）是合成膽固醇的關(guān)鍵酶，與SGAs的合成密切相關(guān)。Sawai等［39］首先通過RNAi技術(shù)對馬鈴薯的StSSR2進行干涉，在StSSR2轉(zhuǎn)錄本顯著降低的轉(zhuǎn)基因植株中，SGAs的含量無論在試管苗或是塊莖皮中都低于非轉(zhuǎn)基因的10%以下，且膽固醇的含量也顯著降低。同時，下調(diào)StSSR2的表達量并不會影響薯塊的產(chǎn)量。然后通過TALENs載體在StSSR2上引入突變，獲得的突變體中SGAs的含量同樣下降到野生型的10%左右。利用這種人工創(chuàng)制的低SGAs的馬鈴薯材料，能夠加速低SGAs品種定向改良及精準(zhǔn)育種的進程。此外，在龍葵堿合成通路中，還有一個2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶（2-oxoglutaratedependent dioxygenase，16DOX）基因，在RNAi植株中被證實能夠強烈抑制SGAs的產(chǎn)生［40］，同時不會影響馬鈴薯的產(chǎn)量。隨后，Nakayasu等［41］利用CRISPR/Cas9基因組編輯體系在馬鈴薯根中對St16DOX進行了敲除，之后對轉(zhuǎn)基因植株進行檢測，發(fā)現(xiàn)在St16DOX不能正常表達的植株當(dāng)中SGAs的含量幾乎為零。因此，St16DOX能夠成為創(chuàng)制不含SGAs的馬鈴薯品種潛在的基因組編輯位點。顯然，經(jīng)過多組學(xué)手段，進一步弄清馬鈴薯SGAs的詳細(xì)代謝途徑及關(guān)鍵調(diào)控酶基因，而后通過基因組編輯技術(shù)，可為降低馬鈴薯塊莖SGAs含量的精準(zhǔn)分子育種提供一條強有力而快捷的技術(shù)實現(xiàn)途徑。

2.2 改良低溫儲藏馬鈴薯塊莖的品質(zhì)

為了延長馬鈴薯的儲藏時間，生產(chǎn)上一般都會采取冷藏的方式，但是冷藏會導(dǎo)致馬鈴薯的蔗糖大量裂解產(chǎn)生還原糖，使得馬鈴薯在高溫加工時產(chǎn)生黑色苦味產(chǎn)物，降低品質(zhì)［42-44］。還原糖還能夠與游離氨基酸如天冬酰胺反應(yīng)生成致癌物質(zhì)丙烯酰胺［45］。所以在冷藏馬鈴薯中，還原糖的含量是一個很重要的指標(biāo)。

液泡轉(zhuǎn)化酶（VInv）定位在液泡中，在低溫冷藏馬鈴薯產(chǎn)生還原糖中扮演著重要的角色［46］，通過RNAi下調(diào)StVlnv的表達能夠顯著降低薯塊中的還原糖濃度，使得薯片中丙烯酰胺的含量下降到野生型薯片的1/15。之后，Clasen等［47］通過PEG介導(dǎo)，把包含靶向StVlnv的TALENs載體導(dǎo)入馬鈴薯原生質(zhì)體中，成功獲得了StVlnv敲除的再生植株。在4個等位基因都突變的冷藏馬鈴薯當(dāng)中，葡萄糖和果糖的含量低于該實驗的極限檢測值（＜0.1 mg/g），同時蔗糖的含量明顯上升。在StVlnv敲除的冷藏馬鈴薯加工成薯片之后，其中丙烯酰胺的含量相較于野生型的下降了73.3%，且薯片的顏色明顯要優(yōu)于野生型的薯片。這為解決冷藏馬鈴薯的品質(zhì)變差提供了很好的解決方法。

2.3 修改馬鈴薯塊莖中的淀粉組成成分

馬鈴薯淀粉在食品和工業(yè)上都有著非常廣泛的應(yīng)用。通?？梢酝ㄟ^化學(xué)或者物理的方式來改變淀粉的性質(zhì)，但是這些手段或多或少都會影響環(huán)境［48］。所以，如果在馬鈴薯塊莖中能夠直接完成淀粉合成特性的轉(zhuǎn)變將會非常有應(yīng)用價值。淀粉有兩種組成成分：直鏈淀粉和支鏈淀粉。其中，馬鈴薯中含有一個合成直鏈淀粉關(guān)鍵的酶：顆粒結(jié)合淀粉合成酶（GBSS1）。高支鏈淀粉馬鈴薯（蠟質(zhì)馬鈴薯）已經(jīng)通過RNAi技術(shù)干涉StGBSS1成功實現(xiàn)［49］。隨后，Andersson等［50］通過在四倍體馬鈴薯中瞬時表達靶向StGBSS1的CRISPR/Cas9編輯載體，使得該基因的4個等位基因全部突變，實現(xiàn)了馬鈴薯中合成的淀粉全部成為支鏈淀粉，并且沒有任何外源DNA片段插入馬鈴薯基因組的情況，這為定向改變馬鈴薯塊莖中的淀粉組成成分，進而為特定食品和工業(yè)用途的馬鈴薯品種的精準(zhǔn)分子育種提供了一個很好的范例。

2.4 改變馬鈴薯自交不親和性

目前，栽培種馬鈴薯都是四倍體，一個馬鈴薯品種要育成每個顯性抗病基因存在3個或者4個等位基因的話，可能需要時間長達15年［51］，這對于馬鈴薯的品種改良是很不利的。而如果用二倍體馬鈴薯的的近交系進行雜交育種的話可能是一個高效的育種方式［4，52］。但是二倍體馬鈴薯存在著自交不親和（Self-incompatibility，SI）現(xiàn)象。馬鈴薯中，自交不親和由高多態(tài)性的S位點所控制，在野生馬鈴薯Solanum chacoense中含有顯性的S位點抑制基因（Sli），能夠?qū)崿F(xiàn)馬鈴薯的自交［53］。但是，導(dǎo)入該基因會使得S. chacoense中的一系列未馴化位點，如長匍匐莖、高龍葵堿等帶入到育種材料中，增加篩選的工作量［38，54］。本課題組在2018年，通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得了控制二倍體馬鈴薯自交不親和的雌蕊決定基因S-RNase序列全長，之后通過CRISPR/Cas9基因組編輯體系，對該基因進行了編輯，成功獲得了S-RNase雙等位基因突變的且自交親和的二倍體馬鈴薯材料［7］。該研究開辟了二倍體馬鈴薯育種的新途徑，拓展了自交親和馬鈴薯資源，將加速馬鈴薯的遺傳改良［55］。不久之后，Enciso-Rodriguez等［56］也對S-RNase進行敲除，同樣獲得了能夠自交親和的二倍體馬鈴薯，進一步證實了對S-RNase的編輯能夠獲得自交親和的二倍體馬鈴薯材料。

3 展望

基因組編輯技術(shù)效率高，可對靶標(biāo)基因進行定點敲除、插入、替換等，是非常實用的基因功能研究以及精準(zhǔn)分子育種工具，已成為農(nóng)作物改良的重要技術(shù)。目前基因組編輯技術(shù)在重要農(nóng)作物如水稻、小麥、玉米等基因功能驗證及定向遺傳改良方面已有許多成功的案例，但是在馬鈴薯定向遺傳改良方面的成功運用尚還有限。

馬鈴薯栽培品種通常是高度雜合的同源四倍體，遺傳背景復(fù)雜，涉及到產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等許多重要農(nóng)藝性狀的重要代謝途徑和關(guān)鍵控制基因尚不清楚，進而或為通過基因組編輯來進行馬鈴薯精準(zhǔn)分子育種的核心限制因素。因此，通過多組學(xué)聯(lián)合分析，弄清控制馬鈴薯重要農(nóng)藝性狀的代謝途徑和闡明關(guān)鍵控制基因的功能，將會為基因組編輯技術(shù)運用于馬鈴薯精準(zhǔn)分子育種奠定堅實的基礎(chǔ)。

此外，基因組編輯技術(shù)用于改良重要農(nóng)作物對生物和非生物脅迫抗性已有不少成功的案例［57-58］，但在馬鈴薯方面尚未見到報道。馬鈴薯晚疫病是公認(rèn)的對馬鈴薯最嚴(yán)重的病害，能夠在感染后10 d完全摧毀馬鈴薯植株［59］。Oliva等［60］在水稻上已經(jīng)通過基因組編輯技術(shù)編輯了感病基因（Susceptible gene）SWEET11、SWEET 13和SWEET 14的啟動子的EBE結(jié)合元件，進而提高了水稻對細(xì)菌性白葉枯病廣泛的抵抗力。而在馬鈴薯上同樣存在著許多S基因，如StUBK［61］、StBSL家族基因［62］和StVIK［63］等，沉默這些基因能夠獲得抗病性增強的表型?？梢酝茰y，利用基因組編輯技術(shù)能夠使得這些S基因應(yīng)用于馬鈴薯抗晚疫病的精準(zhǔn)分子育種，這將會是一個很有前景的研究方向。

因馬鈴薯品種的原因，很多品種的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系建立起來比較困難［64］，使得一部分品種的馬鈴薯難以獲得所需要的轉(zhuǎn)基因植株；此外，由于目前轉(zhuǎn)基因作物在公眾中的接受程度不高，想要推廣基因組編輯馬鈴薯最好在完成編輯的馬鈴薯中不含外源DNA片段。對于含有外源片段的基因組編輯植株來說，想要去除轉(zhuǎn)基因植株的外源片段，可以通過自交的方式進行篩選［7，56］。另外，也可以通過載體在馬鈴薯原生質(zhì)體中瞬時編輯來達到不含外源DNA片段的目的。但是，馬鈴薯的原生質(zhì)體游離以及再生過程十分繁瑣，耗費時間長達6-7個月［25］。因此，進一步改良和完善基因組編輯技術(shù)，以獲得不含外源DNA片段的無轉(zhuǎn)基因且能穩(wěn)定遺傳的基因組編輯馬鈴薯品種，這將會具有很大的應(yīng)用價值。

CRISPR/Cas9基因組編輯體系因其結(jié)構(gòu)簡單且編輯效率高，在3種基因組編輯工具中應(yīng)用最為廣泛，但是其對于靶位點的識別可以容忍幾個堿基對的不匹配，這意味著某些靶位點可能存在著數(shù)千的潛在脫靶位點，所以會造成脫靶現(xiàn)象，進而對細(xì)胞產(chǎn)生遺傳損害作用［65-67］。Upadhyay等［68］通過對小麥的肌醇加氧酶基因（Inositol oxygenase，INOX），八氫番茄紅素基因（Phytoene desaturase，PDS）的靶位點進行了篩選，發(fā)現(xiàn)在gRNA的近5'部分不匹配并不會完全破壞Cas9的編輯效率。Xie等［69］通過對水稻的PS3基因進行編輯時，對11個潛在的脫靶位點進行了分析，發(fā)現(xiàn)了一個被成功編輯的潛在脫靶位點。這對于CRISPR/Cas9應(yīng)用于作物精準(zhǔn)分子育種是非常不利的。目前主要有3種降低脫靶率的方法：一是改變野生型的Cas9酶活性中心的關(guān)鍵催化殘基，使其由內(nèi)切酶轉(zhuǎn)化為切口酶，在靶位點使用兩個毗鄰的gRNA，能夠顯著的降低脫靶效應(yīng)且不損壞其編輯效率［70-71］；而在單堿基突變的體系當(dāng)中，Zhou等［72］通過把腺嘌呤編輯器（Adenine base editors7.10，ABE7.10）中的腺嘌呤脫氫酶148位的脯氨酸置換為精氨酸后，能夠完全去除對RNA的脫靶效應(yīng)，且并不會降低對靶位點DNA的編輯效率。二是通過在gRNA的5'縮短2-3 bp，同樣能夠降低脫靶效應(yīng)［73］。三是通過在線工具如（http：//cbi.hzau.edu.cn/CRISPR2/）來指導(dǎo)設(shè)計靶位點，達到降低脫靶效應(yīng)的目的［74］。Xie等［75］對幾個重要的模式作物以及農(nóng)作物的全基因組進行了分析，發(fā)現(xiàn)含有特異性的gRNA的轉(zhuǎn)錄單元數(shù)量達到了83.4%-98.6%。因此，大部分基因都可以通過精心挑選靶位點，來避免脫靶效應(yīng)。另外，Cas9蛋白在細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)表達也會對細(xì)胞造成持續(xù)的損傷，Jiang等［76］對萊茵衣藻進行研究，發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白的持續(xù)表達能夠?qū)θR茵衣藻產(chǎn)生毒害作用。在人體細(xì)胞中，通過注射gRNA和Cas9蛋白可以顯著的降低Cas9蛋白對細(xì)胞造成的毒害作用［77］。目前，Cas9蛋白在馬鈴薯中的持續(xù)表達所造成的細(xì)胞毒害以及解決方法尚未見到報道。這就需要大量的實驗來論證并克服Cas9蛋白對馬鈴薯的毒害作用，為基因組編輯技術(shù)應(yīng)用于馬鈴薯的精準(zhǔn)分子育種提供支撐。

總之，基因組編輯技術(shù)將會給馬鈴薯的精準(zhǔn)分子育種提供一個重要的技術(shù)解決手段，使馬鈴薯的重要農(nóng)藝性狀如低SGAs含量、營養(yǎng)與品質(zhì)、風(fēng)味、對生物和非生物脅迫的抗性等得以進行精準(zhǔn)的定向遺傳改良。目前需要通過多組學(xué)手段，全面解析控制馬鈴薯重要農(nóng)藝性狀的代謝途徑和關(guān)鍵基因，進一步開發(fā)精準(zhǔn)高效的基因組編輯技術(shù)，并與常規(guī)育種方法相結(jié)合，以最終育成更多性狀優(yōu)良的馬鈴薯品種。