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    抗阿爾茨海默癥單鏈抗體的制備與體外活性研究①

    2020-02-20 04:38:38朱禹奇宋思璇張凌宇張文慧張林波
    中國免疫學(xué)雜志 2020年1期
    關(guān)鍵詞:寡聚體單鏈多肽

    付 璐 張 謙 楊 西 朱禹奇 宋思璇 張凌宇 張文慧 張林波

    (吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,長春 130118)

    阿爾茨海默癥(Alzheimer′s disease,AD)是一種漸行性神經(jīng)退行疾病,患者表現(xiàn)為記憶力減退、認(rèn)知能力障礙、行為異常,最終將喪失獨(dú)立生活能力,在發(fā)病后的10~20年因并發(fā)癥死亡[1]。2018年,世界AD患者人數(shù)為5 000萬,預(yù)計到2050年,世界患病人口數(shù)將達(dá)到15 200萬[2]。然而目前沒有任何一種藥物能夠有效地延緩AD的疾病進(jìn)程[3]。研究表明,AD患者腦中有三大病理學(xué)特征:β淀粉樣蛋白(Amyloid-β,Aβ)聚積形成的斑塊、高度磷酸化的微管結(jié)合蛋白聚集形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)和神經(jīng)元丟失[4]。其中,研究者普遍認(rèn)為患者腦中Aβ含量的異常升高是導(dǎo)致AD發(fā)病的最主要原因。因此,利用免疫療法清除腦中的Aβ是最具潛力治療AD的手段。

    Aβ被動免疫療法是向體內(nèi)輸入Aβ特異性抗體,從而清除腦中過量的Aβ,以達(dá)到治療AD的目的。很多藥物研發(fā)公司進(jìn)行了臨床實驗[5]。如輝瑞和強(qiáng)生公司研發(fā)的Bapineuzumab,禮來公司研發(fā)的Solanezumab,都是以Aβ為靶點(diǎn)的抗體,臨床實驗結(jié)果顯示,應(yīng)用Aβ特異性抗體能夠減少患者腦中Aβ的沉積,并對輕度AD患者的認(rèn)知功能有一定的改善[6-8]。而后,由百健公司開發(fā)的抗體BIIB037,在Ⅰ期臨床試驗中取得了較好的效果,目前正在準(zhǔn)備進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗[9];由百健和衛(wèi)材公司一同研制的BAN2401,也在長達(dá)18個月的Ⅱ期臨床試驗中取得了較好的治療效果[10]。這些實驗結(jié)果都顯示出了Aβ被動免疫療法的治療潛力。雖然Aβ被動免疫療法已經(jīng)取得了一定的治療效果,但是由于全抗體存在抗體恒定區(qū)片段,易引發(fā)炎癥反應(yīng),全抗體在AD治療領(lǐng)域中的應(yīng)用依舊存在安全性問題。

    單鏈抗體(single chain fragment variable,scFv)是一種基因工程抗體,其只含有抗體重鏈以及輕鏈的可變區(qū),并通過柔性鉸鏈相連接[11]。對于AD的治療,scFv顯示出了極大的優(yōu)勢。首先,由于scFv相對分子質(zhì)量較小,其能夠更好地透過血腦屏障,顯著提高治療效果;此外,scFv能夠更好地靠近腦中Aβ沉積,高效率地封閉Aβ的致病形式,有更高的治療效率[12]。更重要的是,由于scFv不含有全抗體的恒定區(qū)結(jié)構(gòu),不能夠引起補(bǔ)體反應(yīng),也不會激活腦中的免疫細(xì)胞,降低引起腦部炎癥反應(yīng)的可能,提高抗體治療的安全性[13]。因此,單鏈抗體在AD治療領(lǐng)域的應(yīng)用,顯示出了極大的優(yōu)勢。

    本研究設(shè)計并成功制備了靶向Aβ的單鏈抗體,并對其體外活性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,該單鏈抗體能夠很好地與各種形式的Aβ相結(jié)合,具有良好的生物學(xué)活性,為AD的被動免疫療法奠定了理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1材料 單鏈抗體基因合成于生工生物工程(上海)股份有限公司;載體pET20b質(zhì)粒、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院病原微生物與免疫團(tuán)隊提供;Aβ42多肽由上海吉爾生化合成;限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶(TaKaRa公司);質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司];鎳柱柱料(GE公司);6E10抗體(Covance公司);Anti-His 單克隆抗體、AP 標(biāo)記鼠二抗(Jackson Immuno Rearch 公司);小牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)基、胰酶(Hyclone 公司);免疫組化試劑盒(邁新生物科技有限公司);其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

    1.2方法

    1.2.1scFv的表達(dá)與純化 查找PDB數(shù)據(jù)庫,獲得能夠識別Aβ3-7表位的抗體12B4(PDB ID:3IFP)的氨基酸序列,通過基因合成的方式,獲得12B4-scFv的基因片段,并將其構(gòu)建到pET20b表達(dá)質(zhì)粒上,獲得能夠表達(dá)scFv的重組質(zhì)粒pET20b-12B4-scFv。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中,對scFv進(jìn)行表達(dá)與純化,獲得單鏈抗體12B4-scFv。

    1.2.2Aβ寡聚體與Aβ纖維的制備 將Aβ42多肽溶解于六氟異丙醇中,避光溶解至溶液澄清。在室溫條件下將六氟異丙醇揮發(fā)完全。用DMSO將Aβ42多肽完全溶解后,加入F12培養(yǎng)基,渦旋形成多肽懸液。將多肽懸液在4℃ 孵育24 h 后,獲得Aβ寡聚體;將多肽懸液在37℃ 孵育24 h后,獲得Aβ纖維,樣品置于-80℃ 冰箱備用。

    1.2.3ELISA法檢測scFv對不同聚集形式Aβ的結(jié)合活性 在ELISA板中包被Aβ42多肽單體、Aβ寡聚體以及Aβ纖維,每孔100 ng,4℃包被過夜。包被完成后,洗去包被物質(zhì),在37℃下封閉2 h。封閉后,將單鏈抗體從1∶1 000起,5倍稀釋至1∶125 000,加入到孔板中,37℃ 孵育2 h。隨后加入抗His單克隆抗體,37℃ 孵育2 h。然后進(jìn)行二抗孵育與顯色,并利用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果。樣品OD值高于背景值2倍視為陽性結(jié)果。

    1.2.4Western blot法檢測scFv對Aβ寡聚體形成的抑制作用 在上述制備Aβ寡聚體的過程中,加入scFv,4℃孵育24 h 后,收取樣品,進(jìn)行Western blot實驗。首先利用SDS-PAGE對樣品進(jìn)行電泳分離,然后利用電泳半干轉(zhuǎn)化儀,將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。牛奶溶液封后,利用Aβ特異性抗體6E10抗體進(jìn)行孵育,2 h 后,進(jìn)行二抗與顯色。

    1.2.5硫黃素-T熒光法檢測scFv對Aβ纖維形成的抑制作用 采用硫磺素T(THT)法檢測scFv對Aβ纖維形成的抑制作用。將THT溶液加入到Aβ儲備液中。并向其中加入純化后的scFv,至總體積150 μl,混勻后加入孔板中。將孔板置于37℃中進(jìn)行反應(yīng),每30 min利用熒光酶標(biāo)儀對熒光進(jìn)行檢測,激發(fā)波長425 nm,發(fā)射波長460 nm,并繪制纖維生長曲線。

    1.2.6MTT法檢測scFv對Aβ寡聚體產(chǎn)生的細(xì)胞毒性的保護(hù)作用 將SH-SY5Y鋪于 96 孔板中,每孔約 5×104個細(xì)胞。37℃培養(yǎng)24 h后,向孔中分別加入空培養(yǎng)基(陰性對照組)、寡聚體(實驗對照組)或寡聚體和抗體混合物(實驗組)。37℃孵育48 h 后,向孔板中加入MTT,37℃ 孵育4 h。然后將孔板離心后棄去孔中上清。向每孔加入150 μl DMSO,充分振蕩混勻后,用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測吸光度。

    1.2.7免疫組化法檢測scFv對AD模型小鼠腦中Aβ斑塊的結(jié)合能力 取9月齡 APP/PS1 AD模型小鼠大腦,多聚甲醛固定后,脫水、透蠟、并進(jìn)行石蠟包埋與切片。將切片進(jìn)行高壓抗原修復(fù)后封閉,以12B4-scFv為一抗進(jìn)行孵育,然后以anti-His單克隆抗體為二抗進(jìn)行孵育,滴加適量酶標(biāo)抗體于切片上,孵育后顯色。復(fù)染、脫水、透明后封片,鏡檢照相。

    1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,組間比較采用t-Test分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1scFv的構(gòu)建、表達(dá)與純化 我們成功將12B4-scFv的基因序列構(gòu)建到pET20b質(zhì)粒上,并用大腸桿菌對12B4-scFv進(jìn)行表達(dá)。利用鎳柱親和層析法,對scFv進(jìn)行了純化。實驗結(jié)果表明,12B4-scFv能夠很好地表達(dá),經(jīng)過純化,能夠獲得純度達(dá)95%以上的蛋白。12B4-scFv的SDS-PAGE與Anti-his Western blot結(jié)果如圖1 所示。

    2.2scFv能夠與不同聚集形式Aβ相結(jié)合 我們通過ELISA的方式對純化所得12B4-scFv與Aβ多肽、Aβ寡聚體以及Aβ纖維的結(jié)合活性進(jìn)行了檢測,結(jié)果如圖2所示。12B4-scFv能夠很好地與3種不同形式的Aβ相結(jié)合,其效價能夠達(dá)到105。其中,抗體與Aβ多肽的結(jié)合能力最強(qiáng),與Aβ纖維的結(jié)合能力最弱。這可能是由于12B4-scFv識別的是Aβ3-7,Aβ在聚集形成寡聚體或者纖維后,其N端暴露部分減少,導(dǎo)致抗體的結(jié)合能力減弱。

    2.3scFv對Aβ寡聚體和纖維的形成具有抑制作用 我們首先通過Western blot 的方式檢測了制備Aβ寡聚體,其分子量大小約為16 kD。在寡聚體制備過程中,加入12B4-scFv共同孵育,能夠顯著減少Aβ寡聚體的含量(圖3A)。

    圖1 12B4-scFv的表達(dá)純化圖Fig.1 Purification of 12B4-scFv

    THT能夠與β折疊結(jié)構(gòu)相結(jié)合,在激發(fā)光存在的情況下,發(fā)出熒光。在Aβ形成纖維的過程中,會產(chǎn)生大量β折疊結(jié)構(gòu),因此Aβ纖維能夠與THT結(jié)合,并通過檢測熒光的強(qiáng)度來檢測Aβ纖維的形成情況。我們在制備Aβ纖維的過程中,加入12B4-scFv,檢測抗體對Aβ纖維形成的抑制作用。實驗結(jié)果如圖3B所示,12B4-scFv的加入能夠抑制Aβ纖維的形成,減少Aβ纖維的生成量,并能夠減慢Aβ纖維形成的速率,與未加入抗體的對照組相比,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

    2.4scFv對Aβ寡聚體產(chǎn)生的細(xì)胞毒性起到保護(hù)作用 我們利用SH-SY5Y細(xì)胞為模型,通過MTT法檢測了Aβ寡聚體對PC12細(xì)胞的毒性以及12B4-scFv對細(xì)胞的保護(hù)作用。實驗結(jié)果如圖4所示。與對照組相比,12B4-scFv能夠抑制Aβ寡聚體產(chǎn)生的細(xì)胞毒性,12B4-scFv的加入可以有效地保護(hù)細(xì)胞,當(dāng)加入抗體的量為0.1 mol/L時,其對細(xì)胞的保護(hù)效率能夠達(dá)到50%(P<0.01)。

    圖2 ELISA法檢測12B4-scFv與不同形式Aβ的結(jié)合活性Fig.2 ELISA assay to determine binding activity of 12B4-scFv to different forms of Aβ

    圖3 12B4-scFv對Aβ寡聚體與纖維形成的抑制作用Fig.3 Inhibition on formation of Aβ oligomers and fibers by 12B4-scFvNote:A.Western blot assay to determine the inhibitory effect of 12B4-scFv against the formation of Aβ oligomer;B.THT method was used to detect the inhibition of 12B4-scFv on the formation of Aβ fibers.

    圖4 12B4-scFv對Aβ寡聚體產(chǎn)生的細(xì)胞毒性的保護(hù)作用Fig.4 Protective effect of 12B4-scFv on cytotoxicity induced by Aβ oligomerNote:**.P<0.01.

    圖5 12B4-scFv與AD模型鼠腦中Aβ斑塊的結(jié)合作用Fig.5 12B4-scFv bind to Aβ plaques in brain of AD model mice

    2.5scFv能夠與AD模型小鼠腦中Aβ斑塊結(jié)合 我們?nèi)?月齡 APP/PS1 AD模型小鼠的腦組織,并制備組織切片。以12B4-scFv為一抗,anti-His單克隆抗體為二抗,進(jìn)行免疫組化實驗。結(jié)果如圖5所示。12B4-scFv能夠與AD模型鼠腦中海馬區(qū)Aβ斑塊相結(jié)合,具有治療潛力。

    3 討論

    AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且至今未明確,目前尚無一種有效的治療手段能夠延緩AD的疾病進(jìn)程[3]。淀粉級聯(lián)假說指出,Aβ在腦中的異常分泌和產(chǎn)生過多,使其在腦組織內(nèi)沉積,對周圍的突觸和神經(jīng)元具有毒性作用,可破壞突觸膜,最終引起神經(jīng)細(xì)胞死亡[14]。Aβ的沉積還會導(dǎo)致AD的其他病理變化,如微管結(jié)合蛋白的過度磷酸化等,是AD發(fā)病的核心環(huán)節(jié)[15]。減少Aβ的形成,抑制Aβ的沉積,是最可能治療AD的有效途徑。

    在過去的十幾年中,Aβ免疫療法逐漸發(fā)展起來。AN1792是第一個進(jìn)入臨床的AD主動免疫療法,其以全長的Aβ42為免疫原進(jìn)行了臨床試驗,但不幸的是這種主動免疫會引起T細(xì)胞免疫反應(yīng),導(dǎo)致6%的受試者產(chǎn)生了腦膜腦炎反應(yīng),最終該臨床實驗因安全性問題而失敗[16]。雖然臨床試驗以失敗告終,但結(jié)果顯示,相比于對照組,Aβ的免疫治療能夠減少患者腦中Aβ沉積,并改善生活障礙。因此,如果能夠避免主動免疫的副作用,Aβ免疫療法依舊充滿希望[17,18]。此后,以Aβ為靶點(diǎn)的被動免疫療法發(fā)展起來,直接向人體注射靶向不同Aβ形式的抗體,具有靶點(diǎn)精確,起效快速,副作用小等特點(diǎn)。很多以Aβ為靶點(diǎn)的被動免疫療法進(jìn)入了臨床試驗,并取得了一定的治療效果[19]。但是由于全抗體存在抗體恒定區(qū)片段,易引發(fā)炎癥反應(yīng),并且具有分子量較大、血腦屏障透過率低等缺點(diǎn),其在AD的治療領(lǐng)域中的應(yīng)用依舊存在安全性與有效性的問題。scFv由于其分子量小,不含有恒定區(qū)片段,大大增加了抗體治療的安全性與有效性,成為AD被動免疫治療的新方向[20]。

    本研究在Aβ免疫療法的基礎(chǔ)上,對靶向Aβ3-7的抗體12B4進(jìn)行了改造,成功表達(dá)純化了其12B4-scFv。該scFv能夠與Aβ單體、寡聚體、纖維很好地結(jié)合,并能夠有效抑制Aβ寡聚體與纖維的形成。此外,該scFv還能抑制Aβ寡聚體產(chǎn)生的細(xì)胞毒性,能夠與AD模型鼠腦中產(chǎn)生的斑塊相結(jié)合,具有非常好的體外活性。12B4-scFv避免了Aβ免疫療法目前存在的安全性與有效性的問題。此外,其體外功能的研究更揭示了抗體清除體內(nèi)Aβ的作用機(jī)制。在下一步的實驗中,我們將會利用12B4-scFv對不同年齡段的AD模型鼠進(jìn)行治療,進(jìn)一步探究12B4-scFv對AD模型小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用,為阿爾茨海默癥的新型抗體療法奠定基礎(chǔ)。

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