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    miR-433-3p靶向MAPK8對肝癌細胞MHCC97H增殖、凋亡和遷移的調(diào)控作用①

    2020-02-20 04:38:34萬智雙眉山市人民醫(yī)院眉山620010
    中國免疫學雜志 2020年1期
    關鍵詞:細胞株靶向肝癌

    萬智雙 熊 丁 曹 宸 (眉山市人民醫(yī)院,眉山 620010)

    肝癌是一種頻繁發(fā)生于慢性肝臟疾病和肝硬化中的惡性腫瘤疾病,原發(fā)性肝癌在常被診斷出的癌癥當中位居第六,并且是導致世界范圍內(nèi)癌癥相關性死亡的第二大主要原因[1,2]。超過半數(shù)的肝癌新病例和死亡都發(fā)生在中國,其中最常見的原發(fā)性肝癌類型是肝細胞癌[3]。在中國所有的癌癥病例當中,肝癌生存率最低,由于早期診斷的缺乏,當診斷出肝癌時已經(jīng)到了晚期,不適合采用根治性手術(shù)治療[4]。因此,發(fā)現(xiàn)能特異性阻斷肝癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的靶向分子,對于肝癌的治療具有重要意義。

    MicroRNA(miRNA)是一種長度約18~22 nt的內(nèi)源性小分子非編碼RNA,在基因表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[5]。miRNA在生物體內(nèi)的異常表達與諸多疾病都有著密切聯(lián)系,其中包括癌癥。迄今為止已有大量文獻報道了miRNA在癌癥發(fā)展和藥物抗性中所起到的關鍵調(diào)控作用[6,7]。然而由于miRNA功能的復雜性,很多方面仍有待進一步研究。在多篇文獻中均報道了miR-433-3p對包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、食管鱗狀細胞癌、膀胱癌等在內(nèi)的多種腫瘤的抑制作用[8-10]。本研究通過體外細胞實驗探討了miR-433-3p與有絲分裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8)的關系,以及miR-433-3p對肝癌細胞MHCC97H增殖、凋亡和遷移的調(diào)控,為miR-433-3p對肝癌的作用提供了新的實驗及理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司,青鏈霉素、Trizol提取液、RIPA裂解液購自北京索萊寶生物公司,lipofectamine 2000購自美國Thermo Fisher公司,miR-433-3p mimic、陰性對照mimic、pcDNA3.1-MAPK8(pc-MAPK8)由廣州銳博生物公司合成,Primescript RT Reagent kit和SYBR PremixEX Taq II試劑盒購自TaKaRa公司,熒光素酶報告系統(tǒng)購自美國Promega公司,BCA試劑盒購自廣州永諾生物公司,CCK8試劑盒、Hoechst試劑盒購自上海碧云天生物公司,所用引物由上海生工生物合成,MAPK8、增殖細胞核抗原(Prolifera-ting cell nuclear antigen,PCNA)、活化半胱天冬酶3(cleave caspase 3,cl-CASP3)、上皮性鈣黏附蛋白(E-cadherin)、神經(jīng)性鈣黏附蛋白(N-cadherin)抗體購自美國Santa Cruz公司。

    1.1.2臨床樣本獲取 收集從2010年到2016年存檔于眉山市人民醫(yī)院的經(jīng)病理檢查確診為肝癌的石蠟包埋組織27例及癌旁組織27例,所有樣本獲取已取得患者家屬知情同意,研究獲得本院倫理委員會批準。

    1.2方法

    1.2.1細胞培養(yǎng) SMMC-7721、HepG2、MHCC 97H、Hep3B肝癌細胞株和HL-7702人正常肝細胞株購自美國ATCC公司,采用含1%青鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng),培養(yǎng)于37℃和5%CO2環(huán)境中。

    1.2.2細胞分組和處理 將MHCC97H細胞分為空白對照(Control)組、陰性對照(negative control,NC)組、miR-433-3p組、pc-MAPK8組和miR-433-3p+pc-MAPK8組,根據(jù)對應的組別,按照lipofectamine 2000說明書,陰性對照mimic轉(zhuǎn)染NC組細胞,miR-433-3p mimic轉(zhuǎn)染miR-433-3p組細胞,pc-MAPK8轉(zhuǎn)染pc-MAPK8組細胞,miR-433-3p mimic和pc-MAPK8共轉(zhuǎn)染miR-433-3p+pc-MAPK8組細胞,轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞用于后續(xù)實驗。

    1.2.3RT-PCR檢測 Trizol溶液提取各組樣品RNA并通過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,進行PCR反應,條件設置為:95℃預變性2 min,95℃變性5 s,60℃退火10 s,反應進行40個循環(huán)。按照SYBR PremixEX TaqⅡ試劑盒說明書檢測mRNA或miRNA轉(zhuǎn)錄水平,通過2-ΔΔCt法進行計算。

    1.2.4熒光素酶報告實驗檢測 生物信息學的方法分析預測了miR-433-3p與MAPK8的靶向作用位點,構(gòu)建MAPK8 3′-UTR區(qū)域的pGL3 luciferase promoter野生型(WT)和突變型(MUT)載體,分別與miR-433-3p或陰性對照mimic共轉(zhuǎn)染HEK293細胞,48 h后檢測熒光素酶酶活性。

    1.2.5Western blot檢測 RIPA溶液提取各組細胞總蛋白,BCA試劑盒定量,每孔30 μg上樣量進行點樣,通過10%SDS-PAGE分離蛋白,半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白印跡到PVDF膜上,使用5%脫脂牛奶封閉2 h,使用一抗4℃孵育過夜,PBS緩沖液清洗PVDF膜,加入二抗孵育2 h,滴加ECL顯色液進行顯影,實驗采用GAPDH作為內(nèi)參。

    1.2.6CCK8法檢測細胞增殖 將按1.2.1處理的細胞于5%CO2,37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng),每隔1 d使用CCK8法測定細胞增殖倍數(shù),總共進行3 d。具體測定方法為:細胞接種于96孔板,每孔加入10 μl的CCK8試劑并培養(yǎng)4 h,酶標儀測定450 nm吸光值。

    1.2.7Hoechst檢測細胞凋亡 細胞接種于6孔板,4%多聚甲醛固定細胞,0.5% TrintonX-100透膜處理,滴加Hoechst染料進行染色30 min,熒光顯微鏡觀察細胞凋亡。

    1.2.8Transwell檢測細胞侵襲 50 μl基質(zhì)膠加入Transwell小室中37℃凝固3 h,上室加入無血清培養(yǎng)基,下室加入完全培養(yǎng)基,各組細胞分別接種于Transwell小室上室,培養(yǎng)48 h。擦除未過膜的細胞,多聚甲醛固定殘余的細胞,使用1%結(jié)晶紫進行染色并拍照。

    1.2.9劃痕愈合法檢測細胞遷移 細胞接種于6孔板,細胞鋪滿板內(nèi)80%的空間時,中槍頭對細胞進行垂直水平劃線,PBS清洗之后,在5%CO237℃的條件下培養(yǎng)24 h,顯微鏡觀察劃痕愈合情況。

    2 結(jié)果

    2.1肝癌細胞株中miR-433-3p表達下調(diào) 如圖1A所示,與正常肝組織比較,肝癌組織中miR-433-3p表達顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。同時,如圖1B所示,與正常肝細胞株HL-7702比較,肝癌細胞株SMMC-7721、HepG2、MHCC97H、Hep3B中miR-433-3p表達均顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。選用了miR-433-3p表達量最低的MHCC97H細胞株進行后續(xù)實驗。

    圖1 RT-PCR檢測人臨床肝組織樣本和細胞株中miR-433-3p表達Fig.1 RT-PCR detection of miR-433-3p expression in human clinical liver tissue samples and cell linesNote: **.P<0.01 versus Normal & HL-7702 group.

    2.2miR-433-3p抑制MAPK8 mRNA轉(zhuǎn)錄 如圖2所示,與Control組比較,NC組miR-433-3p表達水平無顯著差異,miR-433-3p組miR-433-3p表達水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);同時,與Control組比較,NC組MAPK8轉(zhuǎn)錄水平無顯著差異,miR-433-3p組MAPK8轉(zhuǎn)錄水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

    圖2 RT-PCR檢測MHCC97H細胞中miR-433-3p對MAPK8轉(zhuǎn)錄的影響Fig.2 RT-PCR detection of effects of miR-433-3p on MAPK8 transcription in MHCC97H cellsNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group.

    2.3miR-433-3p靶向作用于MAPK8 如圖3所示,與MAPK8 WT+NC比較,MAPK8 WT+miR-433-3p組熒光素酶活性顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);MAPK8 MUT+NC與MAPK8 MUT+miR-433-3p組不存在顯著的熒光素酶活性差異。

    圖3 熒光素酶報告實驗檢測miR-433-3p和MAPK8的靶向作用關系Fig.3 Luciferase reporter assay for targeting relationship between miR-433-3p and MAPK8Note: n=3,**.P<0.01 versus MAPK8 WT+NC group.

    2.4miR-433-3p抑制MAPK8表達 如圖4所示,與Control組比較,miR-433-3p組MAPK8蛋白表達顯著降低,pc-MAPK8組MAPK8蛋白表達顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與pc-MAPK8組比較,miR-433-3p+pc-MAPK8組MAPK8蛋白表達顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

    圖4 Western blot檢測MAPK8蛋白表達Fig.4 Western blot detection of MAPK8 protein expressionNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group;##.P<0.01 versus pc-MAPK8 group.

    2.5miR-433-3p抑制肝癌細胞增殖 如圖5所示,與Control組比較,miR-433-3p組MHCC97H細胞增殖水平顯著降低,pc-MAPK8組細胞增殖水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與pc-MAPK8組比較,miR-433-3p+pc-MAPK8組細胞增殖水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

    圖5 CCK8檢測MHCC97H細胞增殖Fig.5 CCK8 detection of cell proliferation of MHCC 97H cellsNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group;##.P<0.01 versus pc-MAPK8 group.

    2.6miR-433-3p誘導肝癌細胞凋亡 如圖6所示,與Control組比較,miR-433-3p組MHCC97H細胞凋亡率顯著升高,pc-MAPK8組細胞凋亡率顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與pc-MAPK8組比較,miR-433-3p+pc-MAPK8組細胞凋亡率顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

    圖6 Hoechst檢測MHCC97H細胞凋亡Fig.6 Hoechst detection of cell apoptosis of MHCC 97H cellsNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group;##.P<0.01 versus pc-MAPK8 group.

    2.7miR-433-3p抑制肝癌細胞遷移 如圖7所示,與Control組比較,miR-433-3p組MHCC97H細胞劃痕愈合率顯著降低,pc-MAPK8組細胞劃痕愈合率顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與pc-MAPK8組比較,miR-433-3p+pc-MAPK8組細胞劃痕愈合率顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

    圖7 劃痕愈合法檢測MHCC97H細胞遷移能力Fig.7 Wound healing test of migration ability of MHCC 97H cellsNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group;##.P<0.01 versus pc-MAPK8 group.

    2.8miR-433-3p抑制肝癌細胞侵襲 如圖8所示,與Control組比較,miR-433-3p組MHCC97H細胞侵襲數(shù)目顯著降低,pc-MAPK8組細胞侵襲數(shù)目顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與pc-MAPK8組比較,miR-433-3p+pc-MAPK8組細胞侵襲數(shù)目顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

    圖8 Transwell法檢測MHCC97H細胞侵襲能力Fig.8 Transwell chamber test of invasion ability of MHCC97H cellsNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group;##.P<0.01 versus pc-MAPK8 group.

    2.9miR-433-3p對增殖、 凋亡及轉(zhuǎn)移相關蛋白的表達調(diào)控 如圖9所示,與Control組比較,miR-433-3p組MHCC97H細胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關蛋白E-cadherin和凋亡相關蛋白Caspase-3表達顯著升高,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關蛋白N-cadherin和細胞增殖相關蛋白PCNA表達顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與pc-MAPK8組比較,miR-433-3p+pc-MAPK8組細胞中E-cadherin和Caspase-3蛋白表達升高,N-cadherin和PCNA蛋白表達降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

    圖9 Western blot檢測增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移相關蛋白表達Fig.9 Western blot determination of proliferation,apoptosis and metastasis related protein expressionNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group;##.P<0.01 versus pc-MAPK8 group.

    3 討論

    有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)家族是一類在細胞中扮演著重要調(diào)控作用的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族。促炎細胞因子、生長因子、環(huán)境脅迫等因素產(chǎn)生的刺激經(jīng)過一系列激酶信號級聯(lián)放大,促使MAPK激活[11]。MAPK8又被稱為c-Jun氨基末端激酶1(c-Jun N-terminal kinase 1,JNK1),是MAPKs家族的重要成員之一,可磷酸化并激活轉(zhuǎn)錄因子激活子蛋白1(activator protein-1,AP-1),進而激活下游一系列基因的表達,在細胞增殖、細胞分化、細胞生存、細胞死亡、炎癥及其他病理過程中起著重要的調(diào)控作用[12]。在肝癌中,已有大量文獻表明MAPK8與肝癌具有密切的關系[13,14],具有作為藥物治療靶點的潛力。而Tao等[15]的研究表明,在心肌中miR-433-3p可靶向作用于MAPK8與AZIN1,調(diào)控心肌纖維化的進程,Yang等[16]報道了miR-433-3p可通過抑制cAMP反應元件結(jié)合蛋白1(cAMP response element-binding protein 1,CREB1)的表達與功能,發(fā)揮抑制肝癌細胞遷移的作用。推測在肝癌細胞中miR-433-3p可能與MAPK8存在靶向作用,調(diào)控肝癌的發(fā)展。為了證實這一推測本文首先檢測了miR-433-3p在多種肝癌細胞株中的表達,發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞株中miR-433-3p表達均發(fā)生下調(diào),表明miR-433-3p可能參與了肝癌的調(diào)控。進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-433-3p與MAPK8存在靶向作用關系,并且miR-433-3p的高表達可顯著抑制MAPK8的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達,結(jié)果表明在肝癌細胞MHCC97H中miR-433-3p可靶向作用于MAPK8,抑制MAPK8的表達。

    不受控制的細胞增殖以及逃避凋亡的能力是癌細胞的主要特征之一,研究表明MAPK8對肝癌細胞的增殖起著重要的調(diào)控作用。Hui等[14]報道了JNK1在肝細胞癌模型中可通過提高細胞增殖促進基因c-Myc的表達,下調(diào)增殖抑制因子p21的表達,促進腫瘤生長。本研究發(fā)現(xiàn)miR-433-3p顯著抑制了肝癌細胞MHCC97H的增殖并促進細胞凋亡,MAPK8的過表達可逆轉(zhuǎn)miR-433-3p的作用。同時,miR-433-3p顯著提升了cl-CASP3的表達,抑制PCNA的表達,MAPK8過表達可逆轉(zhuǎn)這一作用。PCNA可調(diào)節(jié)細胞從G1期進入S期,參與了DNA復制所需的聚合酶的合成,其表達水平與細胞增殖呈正相關;細胞凋亡主要是由Caspase家族蛋白介導的,cl-CASP3是細胞凋亡途徑的最主要的執(zhí)行蛋白[17,18]。實驗結(jié)果表明miR-433-3p可通過下調(diào)MAPK8表達抑制肝癌細胞MHCC97H的增殖并促進細胞凋亡。

    不受限制的遠端轉(zhuǎn)移能力是癌細胞的另一主要特征,其中遷移和侵襲在癌細胞轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。研究表明MAPK8同樣參與了對肝癌細胞遷移和侵襲的調(diào)控作用。Tsai等[19]報道了甘草查爾酮A可通過下調(diào)MKK4/JNK信號通路,抑制肝癌細胞的遷移和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)miR-433-3p顯著抑制了肝癌細胞MHCC97H的遷移和侵襲,MAPK8過表達可逆轉(zhuǎn)miR-433-3p的抑制作用。同時,miR-433-3p顯著提升了E-cadherin的表達,抑制N-cadherin的表達,MAPK8的過表達可逆轉(zhuǎn)miR-433-3p的調(diào)控作用。E-cadherin參與同類型細胞的黏附連接作用,是維持上皮細胞形態(tài)的重要成分,N-cadherin則起著相反的作用,促進細胞向間質(zhì)形態(tài)轉(zhuǎn)變[20,21]。實驗結(jié)果表明miR-433-3p可通過下調(diào)MAPK8表達抑制肝癌細胞MHCC97H的遷移和侵襲。

    綜上所述,miR-433-3p可靶向抑制肝癌細胞MHCC97H中MAPK8的表達,提升cl-CASP3和E-cadherin的表達,抑制PCNA和N-cadherin的表達,進而抑制細胞的增殖、遷移和侵襲,促進細胞凋亡。本研究首次探究了在肝癌中miR-433-3p通過靶向作用于MAPK8,對肝癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用,為肝癌的靶向治療干涉提供了新的參考。

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