TNFSF14對STZ誘發(fā)Ⅰ型糖尿病的影響及其機制初探①

江 沛 李 由 徐 砜 許桂蓮 李桂清 ( 陸軍軍醫(yī)大學西南醫(yī)院腎科,重慶 400038)

Ⅰ型糖尿病 (type 1 diabetes mellitus，T1DM) 是一種自身免疫性疾病，它是由機體對自身抗原的免疫反應不當而引起的，它由活化的T細胞損傷自體胰島中的β細胞，使之不能正常分泌胰島素，導致胰島素的絕對缺乏[1,2]。

TNFSF14是腫瘤壞死因子超家族(tumor necrosis factor super-family,TNFSF )中的一員,又稱LIGHT或 HVEM-L，其可由樹突狀細胞、巨噬細胞、NKT等多種細胞產生[2]。TNFSF14含有 254個氨基酸，既可為膜結合型分子，又可作為可溶性分子，主要通過與 LTβR(TNFRSF3)和 HVEM(TNFRSF14)兩種受體結合，在腫瘤免疫、炎癥反應、自身免疫性疾病的發(fā)生及胸腺陰性選擇等過程中發(fā)揮重要的生物學作用[3]。TNFSF14缺陷小鼠 (TNFSF14 konckout，TNFSF14 KO小鼠) 具有正常的外周淋巴器官，它通過對免疫細胞的影響或通過參與炎癥過程在調節(jié)宿主免疫應答中起著重要的作用[4]。

鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ) 是一種DNA烷基化試劑，能通過GLUT2葡萄糖轉運蛋白獨自進入細胞，對胰島中的β-細胞具有毒性，根據劑量的不同常用于誘導實驗動物的各型糖尿病模型[5,6]。

鑒于TNFSF14與其受體HVEM和LTβR對于機體免疫具有重要的調節(jié)作用，而目前尚未有文獻闡述其對Ⅰ型糖尿病進程的影響。因此，本文以STZ誘導的T1DM小鼠為模型，探討TNFSF14在Ⅰ型糖尿病中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1材料、試劑 STZ (Sigma) ；檸檬酸(國藥集團)；檸檬酸鈉(國藥集團)；血糖儀(強生穩(wěn)豪)；蘇木素-伊紅染色液(碧云天)；FITC標記的抗小鼠CD3、PE標記的抗小鼠CD4以及APC標記的抗小鼠FoxP3流式抗體均購自Biolegend公司。

1.1.2實驗動物 23～25 g體重雄性SPF級C57BL/6小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司；TNFSF14 KO小鼠(C57BL/6背景)為德國Kfeffer博士惠贈，在動物房潔凈層柜(IVC系統(tǒng))內飼養(yǎng)，恒溫、恒濕條件下自由攝食飲水[2]。

1.2方法

1.2.1Ⅰ型糖尿病小鼠模型的建立 C57BL/6小鼠按照55 mg/kg的劑量，腹腔注射STZ，連續(xù)注射5 d，根據血糖變化情況每周測量2～3次血糖，直至趨勢穩(wěn)定為止[5,6]。

1.2.1.1pH=4.5的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液的配制 檸檬酸(FW:210.14) 2.1 g加入雙蒸水100 ml 中配成A液 檸檬酸鈉 (FW:294.10) 2.94 g加入雙蒸水100 ml中配成B液用時將A、B液按1.2∶1混合，pH計測定pH值,調節(jié)pH=4.2～4.5，即是所需配置STZ的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液。

1.2.1.2含1% STZ 的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液的配制 用0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配制濃度為1%的STZ，即是1 ml 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中溶解0.01 g(10 mg)STZ。

1.2.1.3注射劑量的計算 按照小鼠體重20 g 、劑量55 mg/kg計算，需要體積為100 μl的含1% STZ 的 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液。

1.2.1.4注射前的準備 第一次注射前應禁食4 h，稱量禁食后體重。注射時用檸檬酸緩沖液溶解STZ，放在冰上，錫箔紙避光，按空腹體重注射相應的STZ，并在30 min內注射完畢，因為STZ的水溶液極不穩(wěn)定[2,7,8]。

1.2.1.5模型建立成功的驗證 C57BL/6作為STZ的敏感型動物，從第五次注射后的當天開始取尾靜脈血測血糖，直到連續(xù)2 d血糖超過13.89認為模型建立成功[7,8]。

1.2.1.6實驗標本的獲取 STZ最后一次注射23 d后，脫頸處死小鼠，取出胰腺、脾臟及胰腺淋巴結，將胰腺用4% 多聚甲醛溶液固定；脾臟及胰腺淋巴結置于200目篩網上研磨，紅裂液裂解紅細胞，50 ml PBS洗滌2次，5 ml PBS重懸，制成單細胞懸液。

1.2.2HE染色及評分 取固定好的胰腺，石蠟包埋并連續(xù)切片，做蘇木素-伊紅(HE)染色。采用雙盲法在光鏡下隨機觀察每只小鼠胰腺HE染色后的3～5個胰島并評分，評分標準按照炎癥浸潤的程度進行量化評價：0分，無炎癥細胞浸潤；1分，浸潤百分比<25%；2分，浸潤百分比25%～50%；3分，浸潤百分比>50%。

1.2.3流式細胞術 檢測兩組小鼠脾臟和胰腺淋巴結細胞中的細胞亞群(CD3+T細胞、CD4+T細胞以及CD4+FoxP3+調節(jié)性T細胞)的百分比。將脾臟和胰腺淋巴結制備成單細胞懸液，然后進行染色：加入FITC-CD3、PE-CD4和APC-FoxP3抗體，避光、冰上孵育25 min，流式洗液洗滌2次。流式細胞儀(BD FACS CantoⅡ)檢測各亞群的百分率。

2 結果

2.1TNFSF14 缺陷顯著下調STZ誘導的Ⅰ型糖尿病的發(fā)生 在最后一次注射STZ后，我們通過監(jiān)測血糖發(fā)現TNFSF14 KO 小鼠的血糖整體升高緩慢，相比之下，WT組升高迅猛，在處死小鼠前已經全部超過正常血糖值(圖1，虛線為血糖臨界值)。HE結果可以看出，TNFSF14 KO組的胰島清晰可見，結構完整，而WT組中胰島被大量破壞，并且有大量炎癥細胞浸潤(圖2A、B)。提示TNFSF14在Ⅰ型糖尿病的病理發(fā)生中起關鍵作用。

2.2與WT組相比，TNFSF14 KO小鼠脾臟和胰腺淋巴結淋巴細胞中CD3+T細胞的百分比明顯下調 前面的結果已經證明TNFSF14通路在Ⅰ型糖尿病的進程當中發(fā)揮關鍵作用，為進一步探討其介導Ⅰ型糖尿病的機制，我們采用流式細胞術檢測兩組小鼠脾臟和胰腺淋巴結中CD3+T細胞和CD4+T的百分比。結果表明，TNFSF14 KO組脾臟及胰腺淋巴結中的CD3+T細胞明顯高于WT組(P<0.05)(圖3A)，而CD4+T細胞百分比無顯著差異(圖3B)。

圖2 HE檢測WT和TNFSF14 KO小鼠的胰腺病理變化及評分Fig.2 Pathological changes and scores of pancreas in WT and TNFSF14 KO mice were detected by HE stainingNote: A.HE Staining (×400).n=5 cells/ground；B.Score of pathological changes in the pancreas tissue.*.P<0.05.

圖4 WT和TNFSF14 KO小鼠脾臟及胰腺淋巴結淋巴細胞中CD4+FoxP3+調節(jié)性T細胞亞群的百分比Fig.4 Percentage of CD4+FoxP3+regulatory T cell subsets in spleen and pancreas lymph nodes of WT and TNFSF14 KO miceNote: SP.Spleen；pLN.Pancreatic lymph node.*.P<0.05,**.P<0.01.

2.3與WT組相比，TNFSF14 KO小鼠脾臟和胰腺淋巴結淋巴細胞中的CD4+FoxP3+調節(jié)性T細胞的百分比顯著升高 已有的文獻表明調節(jié)性T細胞是一群抑制性T細胞，它積極抑制免疫系統(tǒng)的激活，防止發(fā)生病理性的自我反應[9,10]，我們的結果表明，TNFSF14 KO組小鼠脾臟及胰腺淋巴結淋巴細胞中的CD4+FoxP3+調節(jié)性T細胞百分比顯著高于WT組小鼠(P<0.05)(圖4A、B)。

3 討論

Ⅰ型糖尿病，是一種胰島素絕對缺乏的糖尿病，它的病因涉及遺傳和環(huán)境因素的結合[11]，潛在的機制包括胰腺中產生胰島素的β細胞的自身免疫破壞[12]。目前還沒有預防Ⅰ型糖尿病的方法，如果不及時治療，糖尿病會引起許多并發(fā)癥，嚴重影響患者的生活質量，甚至危及生命。據估計，每年約有8萬名兒童患上這種疾病。

本文以STZ腹腔注射小鼠誘導Ⅰ型糖尿病為模型，探討TNFSF14在Ⅰ型糖尿病中的作用。結果表明注射STZ于WT小鼠后，血糖持續(xù)升高，在23 d后全組小鼠的血糖都超過了正常值，而TNFSF14 KO組小鼠的血糖上升顯著減緩，提示TNFSF14通路在Ⅰ型糖尿病的進程當中發(fā)揮重要作用。

為了進一步確定TNFSF14是如何參與Ⅰ型糖尿病的進程，我們流式細胞術檢測了經STZ誘導后的兩組小鼠的脾臟和胰腺淋巴結中細胞亞群的百分比。結果表明，TNFSF14 KO組脾臟及胰腺淋巴結中的CD4+FoxP3+調節(jié)性T細胞百分比均顯著低于WT組(P<0.05)。

免疫系統(tǒng)有一個重要功能就是能夠區(qū)分自我和非我，當自我/非我識別失敗時，免疫系統(tǒng)就會破壞自身的細胞和組織，從而導致自身免疫性疾病[13]。調節(jié)性T細胞積極抑制免疫系統(tǒng)的激活，防止病理自我反應，即自身免疫疾病。CD4+FoxP3+調節(jié)性T細胞是免疫抑制性的，抑制或下調效應T細胞的誘導和增殖[14]，由此我們推測TNFSF14通過下調調節(jié)性T細胞的分化來介導Ⅰ型糖尿病的發(fā)生，其具體的分子機制需進一步探討。

綜上所述，我們的研究結果表明，TNFSF14在Ⅰ型糖尿病的病理發(fā)生中發(fā)揮重要作用，其可能通過抑制CD4+FoxP3+調節(jié)性T細胞的分化來介導Ⅰ型糖尿病的發(fā)生。