GLYX-13通過NR2B-ERK-CREB信號通路改善氯胺酮麻醉后幼鼠認知功能障礙①

鄭文婧 郄曉娟 鄭文芳

(衡水市人民醫(yī)院麻醉科，衡水 053000)

認知功能障礙是手術(shù)患者麻醉后常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，氯胺酮在抗焦慮、抗抑郁、小兒麻醉等方面有廣泛的應用，研究發(fā)現(xiàn)氯胺酮呈時間依賴性和劑量依賴性促進幼鼠神經(jīng)元變性、壞死和凋亡，可引起幼鼠認知功能損害[1，2]。因此探討預防和治療由氯胺酮麻醉所致的認知功能障礙在臨床上具有重要意義。GLYX-13為蘇氨酸-脯氨酸-脯氨酸-蘇氨酸多肽，可與N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體甘氨酸位點結(jié)合，增強小鼠的學習記憶能力[3，4]，但其作用機制尚不清楚。NR2B-ERK-CREB信號通路與大鼠的學習、記憶的形成關(guān)系密切[5，6]。本文對GLYX-13對氯胺酮麻醉后幼鼠認知功能障礙及海馬組織NR2B-ERK-CREB信號通路的影響進行研究，探討GLYX-13改善氯胺酮麻醉后幼鼠認知功能障礙的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康、清潔級、雌雄各半、3周齡、體質(zhì)量7～10 g、C57BL/6小鼠60只[北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2014-000]。

1.1.2主要試劑 鹽酸氯胺酮注射液(福建古田藥業(yè)有限公司，批號：H35020148)，GLYX-13(美國Sigma公司，批號：015M4731V)，Morris水迷宮、曠場實驗(美國Noldus公司)，BCA法蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光液(美國Proteinech Group公司)，兔抗鼠NR2B多克隆抗體、兔抗鼠ERK多克隆抗體、兔抗鼠p-ERK多克隆抗體、兔抗鼠CREB多克隆抗體、兔抗鼠p-CREB多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體、羅丹明熒光標記山羊抗兔二抗(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組及處理 將60只幼鼠根據(jù)隨機數(shù)字法分為對照組(NS組)、氯胺酮麻醉組(Ket組)、氯胺酮麻醉+GLYX-13組(Ket+GLYX-13組)，每組20只。Ket組和Ket+GLYX-13組小鼠每天腹腔注射30 mg/kg氯胺酮，間隔30 min重復一次，每天3次，共5 d[7]；Ket+GLYX-13組小鼠每天首次注射氯胺酮前2 h尾靜脈注射1 mg/kg GLYX-13(參照文獻[4，8]選擇GLYX-13劑量為1 mg/kg)共5 d；NS組小鼠每天注射等量生理鹽水，共5 d。

1.2.2水迷宮實驗 將一高60 cm、直徑120 cm圓形水池中注入清水，水溫維持在22～26℃，將水池分為4個象限，將平臺放置在第一個象限內(nèi)，平臺頂位于水下1.5 cm。前4 d每天上午10點進行定位航行試驗：將小鼠按照1至4象限的順序放入水池中，記錄小鼠逃避潛伏期，即1 min內(nèi)找到平臺所需要的時間，若小鼠在1 min內(nèi)無法找到平臺則引導小鼠上平臺，將其逃避潛伏期記錄為1 min，取4個象限平均值。第5天上午10點進行空間探索實驗：將平臺從水池中撤除，將小鼠從第3象限放入水池，記錄小鼠在1 min內(nèi)穿越原平臺象限次數(shù)和在原平臺象限停留時間。

1.2.3曠場實驗 每天下午4點進行曠場實驗，正方形的曠場箱底部劃分為25個大小相等的方格，中間的9個方格為曠場中心區(qū)，將小鼠放置在曠場箱中央?yún)^(qū)自由活動，記錄15 min內(nèi)小鼠在中心區(qū)停留時間，共測試3 d。

1.2.4Western blot法測定海馬組織NR2B、ERK、p-ERK、CREB、p-CREB蛋白水平 小鼠行為學實驗結(jié)束后，每組取10只小鼠，戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，斷頭取海馬組織，取100 mg海馬組織加入Lysis Buffer裂解液裂解海馬組織，提取海馬組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗：兔抗鼠NR2B多克隆抗體(1∶2 000)、兔抗鼠ERK多克隆抗體(1∶500)、兔抗鼠p-ERK多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗鼠CREB多克隆抗體(1∶5 00)、兔抗鼠p-CREB多克隆抗體(1∶1 000)過夜孵育，以β-actin為內(nèi)參照，加入二抗(1∶3 000)孵育2 h，加入ECL發(fā)光液顯影，采用Quantity One 4.6.2圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值，目標蛋白水平以目標蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

1.2.5采用免疫熒光法測定海馬CA1區(qū)NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白表達情況 取各組小鼠行為學實驗結(jié)束后每組剩余的10只小鼠，麻醉后斷頭處死，取小鼠海馬組織在福爾馬林中過夜固定，取出海馬組織塊經(jīng)梯度脫水、透明、浸蠟、包埋，切成5 μm厚切片。將石蠟切片烤片30 min，脫蠟、脫水，加入檸檬酸鹽緩沖液煮沸12 min修復抗原，加入Tritonx-100通透30 min，加入山羊血清封閉40 min，加入一抗過夜孵育，加入羅丹明熒光標記二抗孵育1 h，加入DAPI封片，鏡下觀察熒光染色情況，采用Image-Pro plus圖像分析軟件分析陽性熒光信號強度，二抗標記的免疫陽性細胞呈紅色。陽性對照標本：一抗(NR2B、p-ERK、p-CREB)滴加海馬組織切片，之后加羅丹明熒光標記二抗；陰性對照標本：PBS代替一抗滴加組織切片。

2 結(jié)果

2.1三組小鼠水迷宮實驗結(jié)果比較 與NS組比較，Ket組和Ket+GLYX-13組小鼠逃避潛伏期延長(P<0.05)，穿越原平臺象限次數(shù)和在原平臺象限停留時間降低(P<0.05)；與Ket組比較，Ket+GLYX-13組小鼠逃避潛伏期縮短(P<0.05)，穿越原平臺象限次數(shù)和在原平臺象限停留時間升高(P<0.05)，見表1。

2.2三組小鼠曠場實驗中心區(qū)停留時間比較 與NS組比較，Ket組和Ket+GLYX-13組小鼠3 d中心區(qū)停留時間均縮短(P<0.05)；與Ket組比較，Ket+GLYX-13組小鼠3 d中心區(qū)停留時間均延長(P<0.05)，見表2。

2.3三組小鼠海馬組織NR2B、ERK、p-ERK、CREB、p-CREB蛋白水平比較 三組小鼠海馬組織ERK、CREB蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；三組小鼠海馬組織NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)：與NS組比較，Ket組和Ket+GLYX-13組小鼠海馬組織NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白水平降低(P<0.05)；與Ket組比較，Ket+GLYX-13組小鼠海馬組織NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白水平升高(P<0.05)，見表3和圖1。

2.4三組小鼠海馬CA1區(qū)NR2B、 p-ERK、 p-CREB熒光陽性信號強度比較 與NS組比較，Ket組和Ket+GLYX-13組小鼠海馬CA1區(qū)NR2B、p-ERK、p-CREB熒光陽性信號強度降低(P<0.05)；與Ket組比較，Ket+GLYX-13組小鼠海馬CA1區(qū)NR2B、p-ERK、p-CREB熒光陽性信號強度升高(P<0.05)，見表4和圖2。

GroupsnEscape latency(s)Day 1Day 2Day 3Day 4Number of quadrants crossingthe original platform(times)In the original platformquadrant residence time(s)NS group2055.24±6.1342.13±4.7622.14±2.9816.47±1.898.69±1.2417.68±2.13Ket group2068.25±6.371)53.24±5.171)33.27±3.121)23.16±2.141)3.15±1.031)9.24±1.171)Ket+GLYX-13 group2060.14±5.821)2)48.71±5.691)2)27.39±2.911)2)19.32±1.781)2)6.26±1.211)2)14.35±1.091)2)F23.12322.90268.68359.738113.889152.856P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

Note：Compared with the NS group,1)P<0.05;compared with the Ket group,2)P<0.05.

GroupsnResidence time in the central area(s)Day 1Day 2Day 3NS group2057.32±5.3656.47±5.2557.86±4.79Ket group2025.15±4.981)26.71±4.871)26.34±4.851)Ket+GLYX-13 group2049.72±5.131)2)48.58±5.221)2)49.12±5.211)2)F212.451181.618215.842P<0.001<0.001<0.001

Note：Compared with the NS group,1)P<0.05;compared with the Ket group,2)P<0.05.

GroupsnNR2BERKp-ERKCREBp-CREBNS group100.37±0.080.72±0.130.39±0.070.84±0.150.64±0.13Ket group100.09±0.041)0.69±0.120.11±0.031)0.83±0.140.18±0.071)Ket+GLYX-13 group100.18±0.051)2)0.71±0.140.21±0.061)2)0.85±0.130.43±0.101)2)F58.3810.13864.2550.05150.031P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

Note：Compared with the NS group,1)P<0.05;compared with the Ket group,2)P<0.05.

GroupsnNR2B fluorescencepositive signal intensityp-ERK fluorescencepositive signal intensityp-CREB fluorescencepositive signal intensityNS group100.042±0.0090.034±0.0080.051±0.007Ket group100.016±0.0071)0.013±0.0051)0.010±0.0051)Ket+GLYX-13 group100.027±0.0081)2)0.022±0.0071)2)0.024±0.0091)2)F26.34024.13084.065P<0.001<0.001<0.001

Note：Compared with the NS group,1)P<0.05;compared with the Ket group,2)P<0.05.

圖1 三組小鼠海馬組織NR2B、ERK、p-ERK、CREB、p-CREB蛋白Western blot電泳圖Fig.1 Western blot analysis of NR2B,ERK,p-ERK,CREB and p-CREB proteins in hippocampus of three groups of miceNote:A.NS group；B.Ket group；C.Ket+GLYX-13.

圖2 免疫熒光法測定三組小鼠海馬CA1區(qū)NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白表達(×200)Fig.2 Immunofluorescence assay for NR2B,p-ERK,and p-CREB protein expression in hippocampal CA1 region of three groups of mice(×200)

3 討論

氯胺酮鎮(zhèn)痛效果好，無明顯呼吸抑制作用，在小兒全身麻醉和基礎麻醉中應用廣泛[9]。但近來研究發(fā)現(xiàn)氯胺酮可對大腦產(chǎn)生損傷，導致認知功能障礙[10]。氯胺酮可通過誘導神經(jīng)元細胞凋亡等方式對腦組織造成損害，影響近期和遠期認知功能障礙[11,12]。因此在麻醉過程中聯(lián)合其他藥物或其他腦保護手段可減輕氯胺酮對神經(jīng)元的毒性作用，減輕腦組織損傷，減少氯胺酮對認知功能的損傷，提高麻醉安全性。

興奮性氨基酸(谷氨酸)在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，是一種生理興奮性遞質(zhì)，對突觸功能及可塑性具有重要作用，NMDA受體由多個受體亞單位組成的一種異五聚體，對鈣離子有高通透性[13，14]。在正常情況下，鈣離子通道被鎂離子電壓阻斷，當大量谷氨酸和NMDA受體亞基NR2B高親和性結(jié)合時，可以置換出離子通道中的鎂離子，激活NMDA受體對鈣離子的高通透性，從而產(chǎn)生興奮毒性[15]。ERK是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)亞家族成員，當上游的ERK激酶受到突觸內(nèi)NMDA受體鈣離子通道鈣內(nèi)流的刺激時，ERK可發(fā)生磷酸化，磷酸化的ERK(p-ERK)核轉(zhuǎn)位，并磷酸化下游的CREB，CREB為促存活轉(zhuǎn)錄因子，磷酸化的CREB(p-CREB)可通過調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等基因的表達，減少神經(jīng)元的凋亡[16,17]。海馬組織缺乏NR2B可引起學習記憶等認知功能障礙，高表達NR2B可通過ERK信號通路參與海馬學習記憶的鞏固，ERK可激活CREB，磷酸化的CREB參與海馬記憶的形成，從而提高認知功能[18,19]。

NMDA受體是麻醉藥物作用的關(guān)鍵部位，麻醉藥物和NMDA受體結(jié)合可拮抗NMDA受體的作用，引起神經(jīng)元變性壞死，抑制神經(jīng)營養(yǎng)谷氨酸供給大腦，影響大腦功能。GLYX-13可作用于含NR2B的NMDA受體甘氨酸位點，提高NR2B亞基蛋白的表達水平，增強海馬的學習記憶能力。GLYX-13可促進海馬CA1區(qū)突觸傳遞，可增加突觸傳遞過程的長時程增強幅度，減少長時程抑制的發(fā)生[20,21]。

本研究發(fā)現(xiàn)：氯胺酮可延長小鼠逃避潛伏期，降低穿越原平臺象限次數(shù)并在原平臺象限停留時間和中心區(qū)停留時間均縮短，降低海馬組織NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白水平且海馬CA1區(qū)NR2B、p-ERK、p-CREB熒光陽性信號強度。表明氯胺酮可引起幼鼠認知功能障礙，其機制可能為氯胺酮和NMDA受體NR2B亞基結(jié)合，降低NR2B水平，NR2B表達水平降低抑制ERK磷酸化，從而抑制CREB磷酸化，損害海馬組織的認知功能。氯胺酮麻醉幼鼠給予GLYX-13處理可縮短小鼠逃避潛伏期，延長穿越原平臺象限次數(shù)、在原平臺象限停留時間和中心區(qū)停留時間，提高海馬組織NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白水平且海馬CA1區(qū)NR2B、p-ERK、p-CREB熒光陽性信號強度升高。表明GLYX-13可能通過作用于含NR2B的NMDA受體甘氨酸位點，提高NR2B亞基蛋白的表達水平，通過激活ERK和CREB增加海馬的認知能力。

綜上所述，氯胺酮可引起幼鼠認知功能障礙，GLYX-13可能通過激活NR2B/ERK/CREB信號通路發(fā)揮中樞神經(jīng)保護作用，改善氯胺酮引起的幼鼠認知功能障礙。