針刺對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及對小膠質(zhì)細(xì)胞和炎癥反應(yīng)的影響①

張英英 單海軍 郭 鑫

(河南省中醫(yī)院兒童腦病康復(fù)科,鄭州 450002)

新生兒缺氧缺血性腦病是指新生兒圍生期窒息引起的缺氧缺血性腦損傷，是新生兒不可逆性腦損傷和新生兒死亡的主要原因，輕者可引起患兒輕度癱瘓、學(xué)習(xí)障礙、注意力缺陷、細(xì)微運動問題等，嚴(yán)重者可遺留癲癇、腦性癱瘓等難治性兒童腦病，針刺在治療缺氧缺血性腦病中取得較好效果[1,2]，但其機制尚不十分清楚。缺氧缺血性腦病的病理生理過程比較復(fù)雜，可出現(xiàn)腦水腫、自由基產(chǎn)生、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、炎癥反應(yīng)、小膠質(zhì)細(xì)胞活化等，小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有的免疫細(xì)胞，在缺氧缺血腦損傷刺激下小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化[3]，釋放大量炎癥細(xì)胞因子，特別是IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎性細(xì)胞因子，加重炎癥反應(yīng)，引起腦組織損傷[4,5]。本文就針刺對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及對小膠質(zhì)細(xì)胞及炎癥反應(yīng)的影響進(jìn)行研究，探討針刺治療缺氧缺血性腦病的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 7日齡、清潔級、新生、體重12～14 g、SD大鼠150只[購自河南省動物實驗中心，合格證號：SYXK(豫)2013-0024]。

1.1.2主要試劑 TTC(美國Sigma公司)，IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒(美國Abcam公司)，DAB顯色試劑盒、免疫組化試劑盒、羊抗小鼠Iba-1抗體(美國Santa Cruz公司)等。

1.2方法

1.2.1分組及缺氧缺血性腦損傷模型建立 將150只大鼠根據(jù)隨機數(shù)字法分為假手術(shù)組、模型組和針刺組，每組50只。模型組和針刺組大鼠采用RICE法建立缺氧缺血性腦損傷模型：乙醚吸入麻醉成功后，在大鼠中位頸部切口，分離左側(cè)頸總動脈，并進(jìn)行結(jié)扎，縫合傷口，2 h后，將大鼠置于密閉缺氧環(huán)境中，給予92%N2+8%O2混合氣體缺氧處理2.5 h。假手術(shù)組大鼠不進(jìn)行血管結(jié)扎及缺氧處理。

1.2.2各組大鼠處理 建模后，假手術(shù)組和模型組大鼠不進(jìn)行針刺處理，針刺組大鼠進(jìn)行針刺處理：選擇“靳三針療法”中的“腦三針”“顳三針”“智三針”取穴，結(jié)合人與動物的骨度比、參照《實驗針灸學(xué)》進(jìn)行穴位定位。腦三針：從大鼠頸椎向上摸到枕骨粗隆上緣向上0.1寸為第1針，向兩旁摸到枕骨粗隆兩側(cè)緣定位第2針和第3針；顳三針：大鼠耳根上緣中點向上0.5寸為第1針，前后耳根向上與第1針?biāo)教幎ㄎ坏?針和第3針；智三針：從兩眼連線中點向上摸到額骨和頂骨之間的冠狀縫定位第1針，眼睛內(nèi)外眥連續(xù)外1/3向上0.3寸定位第2針和第3針。每個穴組先刺第1針，再刺第2針和第3針，“腦三針”和“顳三針”向下平刺，“智三針”向百會方向平刺，每個穴位得氣后行捻轉(zhuǎn)手法均勻、持續(xù)捻轉(zhuǎn)20 s，120次/min，不留針，每天1次，共7 d。

1.2.3取材 治療結(jié)束后，各組隨機取10只大鼠斷頭處死，取腦組織置于PBS液中冷卻，用于腦組織TTC染色；各組取10只大鼠，灌注固定后取腦組織，梯度脫水、透明、石蠟包埋，用于腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba-1表達(dá)測定；各組取10只大鼠，取大鼠腦組織放入液氮中保存，用于ELISA和RT-PCR檢測；各組取10只大鼠用于空間學(xué)習(xí)記憶能力測定。各組剩余大鼠用于其他實驗研究。

1.2.4腦梗死情況測定 將PBS液中腦組織沿冠狀面切片，厚度2 mm，5片。采用TTC染色法對腦組織進(jìn)行染色，將腦組織切片浸入TTC溶液中孵育30 min，PBS液沖洗，福爾馬林溶液中固定，染色固定后梗死區(qū)域腦組織呈白色，正常腦組織呈紅色，采用Image J 1.8.0軟件測量腦梗死面積，計算腦梗死面積占同側(cè)腦組織總面積百分比。

1.2.5腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba-1表達(dá)測定 采用免疫組化法測定腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba-1表達(dá)情況：腦組織石蠟包塊切成厚5 μm切片，室溫復(fù)溫15 min，烘烤30 min，脫蠟至水，滴加山羊血清孵育20 min，加入Iba-1抗體過夜孵育，滴加聚合物輔助劑孵育20 min，滴加二抗孵育20 min，DAB顯色，染核、脫水、封片后，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對圖像進(jìn)行分析，每張切片選5個400倍高倍視野計算平均陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.6腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA水平測定 每只大鼠取50 mg腦組織，加入Trizol孵育5 min，提取總RNA，采用實時熒光定量Real-time PCR 檢測測定腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA水平，以β-actin為內(nèi)參照，反應(yīng)條件：95℃ 3 min；94℃ 15 s、62℃ 40 s，共40個循環(huán)。IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA相對表達(dá)量以IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)量與β-actin表達(dá)量的比值表示。

1.2.7腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平測定 每只大鼠取50 g腦組織加入勻漿液勻漿后，離心(12 500 r/min)25 min，取上清液，采用ELISA法測定腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平(具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行)。

1.2.8大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力測定 治療結(jié)束后14 d(大鼠28 d齡)時，每組取10只大鼠，采用Morris水迷宮測定大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。第1天至第5天對大鼠進(jìn)行平臺訓(xùn)練，將直降14 cm、高32 cm平臺置于迷宮中水下1 cm處，從4個不同方向隨機分4次放入迷宮中，自由探索直到找到平臺，其到達(dá)平臺的時間為逃避潛伏期，2 min內(nèi)沒有找到平臺者被引導(dǎo)至平臺并停留15 s，記錄逃避潛伏期為2 min，記錄各組大鼠第5天的逃避潛伏期進(jìn)行比較。第6d進(jìn)行空間搜索，從迷宮中將平臺移除，從平臺相對應(yīng)的位置將大鼠放入迷宮，測試2 min，觀察大鼠穿過平臺位置的次數(shù)，將其作為大鼠穿臺指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力比較 與假手術(shù)組比較，模型組和針刺組大鼠逃避潛伏期延長(P<0.05)，穿臺指數(shù)降低(P<0.05)；與模型組比較，針刺組大鼠逃避潛伏期縮短(P<0.05)，穿臺指數(shù)增加(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠腦梗死面積比較 假手術(shù)組大鼠腦組織均呈紅色，無梗死現(xiàn)象；模型組大鼠腦組織出現(xiàn)大片明顯的白色梗死區(qū)域；針刺組大鼠腦組織出現(xiàn)小部分白色梗死區(qū)域。針刺組腦梗死面積明顯低于模型組(P<0.05)。見圖1和表2。

2.3各組大鼠腦組織Iba-1表達(dá)情況 與假手術(shù)組比較，模型組和針刺組大鼠腦組織Iba-1陽性細(xì)胞增多(P<0.05)，與模型組比較，針刺組大鼠腦組織Iba-1陽性細(xì)胞減少(P<0.05)。假手術(shù)組大鼠腦組織區(qū)見少量小膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞胞體瘦長，有細(xì)長的分枝狀突起，處于未活化狀態(tài)；模型組大鼠腦組織區(qū)見小膠質(zhì)細(xì)胞增多，胞體變大，突起粗大，呈活化狀態(tài)；針刺組大鼠腦組織區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞明顯少于模型組。見表2和圖2。

表1 各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力比較

Tab.1 Comparison of spatial learning and memory ability of rats in each group

GroupsnEscape latency (s)Wearing indexSham operation group108.67±1.965.46±1.43Model group1018.24±4.951)2.04±0.651)Acupuncture group1012.47±2.831)2)3.52±0.871)2)F19.16227.371P<0.001<0.001

Note：Compared with the sham operation group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05.

2.4各組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組和針刺組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA相對表達(dá)量升高(P<0.05)；與模型組比較，針刺組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA相對表達(dá)量降低(P<0.05)。見圖3。

2.5各組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組和針刺組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)；與模型組比較，針刺組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.05)。見表3。

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色圖Fig.1 TTC staining of brain tissue of rats in each group

表2 各組大鼠腦梗死面積和腦組織Iba-1陽性細(xì)胞比較

Tab.2 Comparison of cerebral infarct size and brain tissue Iba-1 positive cells in each group

GroupsnCerebralinfarct size(%)Brain tissue Iba-1positive cellsSham operation group10-7.45±1.41Model group1042.15±4.481)27.38±4.721)Acupuncture group1031.23±3.141)2)16.57±3.091)2)F6.31288.310P<0.001<0.001

Note：Compared with the sham operation group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05.

圖2 各組小鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞活化免疫組化染色(×400)Fig.2 Immunohistochemical staining of microglia in brain tissue of each group (×400)

表3 各組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平比較

Tab.3 Comparison of IL-6,IL-1β and TNF-α levels in brain tissue of rats in each group

GroupsnIL-6(pg/mg)IL-1β(pg/mg)TNF-α(pg/mg)Sham operation group1053.26±12.6316.46±12.3747.35±11.42Model group10175.35±34.211)42.34±16.531)98.26±17.531)Acupuncture group1096.24±18.561)2)27.48±14.211)2)62.14±13.471)2)F68.7208.05533.232P<0.0010.002<0.001

Note：Compared with the sham operation group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05.

圖3 各組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression of IL-6,IL-1β and TNF-α mRNA in brain tissue of rats in each group

3 討論

新生兒缺氧缺血后可引起酸中毒、低血糖、氧自由基損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、小膠質(zhì)細(xì)胞活化、興奮毒作用、細(xì)胞因子釋放等變化，上述因素的變化及相互作用共同引起腦損傷。小膠質(zhì)細(xì)胞來源于胚胎前期骨髓干細(xì)胞，成熟后廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，正常狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞處于休眠或靜息狀態(tài)，活性低，無抗原提呈功能，無吞噬功能，從而使腦內(nèi)免疫處于比較低的水平；在腦組織受到損傷等刺激后，小膠質(zhì)細(xì)胞可迅速活化，發(fā)生功能、形態(tài)、免疫顯型變化，引起免疫應(yīng)答反應(yīng)，釋放大量炎性介質(zhì)和細(xì)胞毒素，分泌炎性細(xì)胞因子[6,7]。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和促炎因子是神經(jīng)炎癥的特征性表現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)炎癥的主要效應(yīng)細(xì)胞，在腦組織受到缺氧缺血性損失時，小膠質(zhì)細(xì)胞最先被活化，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞胞體變肥大，突起縮短，數(shù)量增加[8]，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)系統(tǒng)具有兩種作用：一方面可通過釋放大量神經(jīng)營養(yǎng)因子、抗炎細(xì)胞因子、血管內(nèi)皮生長因子等吞噬損傷神經(jīng)細(xì)胞、促進(jìn)血管生成、抑制炎癥反應(yīng)，減輕神經(jīng)元損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；另一方面可釋放IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎性細(xì)胞因子、氧自由基、一氧化氮等啟動炎癥反應(yīng)，引起神經(jīng)元損傷[9,10]?？梢?，小膠質(zhì)細(xì)胞具有保護(hù)神經(jīng)元和引起神經(jīng)元損傷的雙重作用，但過度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞則是引起持續(xù)性炎癥反應(yīng)的主要原因，過度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可引起IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎因子的大量釋放，大量促炎細(xì)胞引起又可不斷活化小膠質(zhì)細(xì)胞，損傷神經(jīng)元，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致神經(jīng)損傷[11,12]。

針刺治療缺氧缺血性腦損傷具有不可替代和特定的優(yōu)勢[13,14]，主要原理為針刺通過刺激人體經(jīng)絡(luò)調(diào)節(jié)氣血運行和人體臟腑器官功能，針刺具有操作簡單、無不良反應(yīng)、療效肯定的優(yōu)勢，有著極大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益[15,16]。靳三針療法是一種傳統(tǒng)針灸療法，近年來在針灸治療小兒腦病方面的研究取得了比較滿意的效果[17]。本文采用“靳三針療法”治療缺氧缺血性腦損傷大鼠模型，發(fā)現(xiàn)針刺可顯著降低缺氧缺血性腦損傷大鼠逃避潛伏期、增加穿臺指數(shù)、減少腦梗死面積、降低腦組織Iba-1陽性細(xì)胞數(shù)量和腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平?？梢?，針刺對缺氧缺血性腦損傷大鼠具有腦保護(hù)作用，其機制可能為缺氧缺血引起腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化，過度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎性細(xì)胞因子，大量生成的IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎性細(xì)胞因子又進(jìn)一步活化小膠質(zhì)細(xì)胞，形成惡性循環(huán)引起腦組織損傷；針刺通過降低缺氧缺血引起的腦小膠質(zhì)細(xì)胞活化、降低IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎性細(xì)胞因子水平，從而發(fā)揮對腦組織的保護(hù)作用。

綜上所述，針刺可能通過降低小膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎癥反應(yīng)發(fā)揮對缺氧缺血性腦損傷的保護(hù)作用。