羽扇豆醇緩解氧化應激對心肌缺血再灌注大鼠心臟功能和心肌組織的保護作用①

崔勤濤 王俊華 劉曉晨 王學惠 蘇國寶 (新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心血管外科，新鄉(xiāng) 453000)

冠心病是由動脈粥樣硬化引起的血管狹窄/阻塞，導致心肌缺血缺氧型心臟病，其發(fā)病的主要原因為心肌缺血[1,2]，冠狀動脈經(jīng)皮介入是目前治療冠心病手段之一，但同時也伴隨著心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MI/RI)。MI/RI病理學表現(xiàn)為心肌組織排列紊亂、胞外基質(zhì)沉積增加、心肌組織損傷，從而引起心率失常，嚴重時可誘發(fā)猝死[3]。羽扇豆醇是三萜烯，存在于食用植物以及中草藥中，動物研究證實羽扇豆醇具有抗炎癥、抗氧化以及促進傷口愈合的作用，并且對前列腺癌、乳腺癌以及黑色素瘤等有抑制作用。有研究顯示羽扇豆醇可以改善腦缺血再灌注大鼠的氧化應激損傷并減輕炎癥反應[4]，但羽扇豆醇在心肌缺血再灌注方面的氧化應激研究報道較少，因此，本研究通過制備大鼠MI/RI模型來探討羽扇豆醇對心肌缺血再灌注大鼠心臟功能、心肌損傷以及氧化應激作用的影響，為臨床治療心肌缺血再灌注患者方案選擇提供動物實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 Caspase-3免疫組化劑盒(貨號：IH-0081R，上海雅吉生物科技有限公司)、羽扇豆醇(CAS號：545-47-1；上海源葉生物科技有限公司)、TRIzol RNA提取試劑盒(貨號：BTN71201-WJU，北京百奧萊博科技有限公司)、地爾硫卓(CAS號：42399-41-7；上海晶都生物技術有限公司)、CK-Mb(貨號：QY-BM11392，上海喬羽生物科技有限公司)、Mb(貨號：0-027530，上海江萊生物科技有限公司)、cTnI(貨號：BS-E12272R1，廣州徠智生物科技有限公司)、TNF-α(貨號：QY-BM10200，上海喬羽生物科技有限公司)、IL-1β(貨號：YAD23684S，北京杰輝博高生物技術有限公司)、iNOS[貨號：JK-(a)-1607，上海晶抗生物工程有限公司]、IL-6[貨號：JK-(a)-0023，上海晶抗生物工程有限公司]、MDA(貨號：0-100860，上海將來實業(yè)股份有限公司)，SOD[貨號：JK-(a)-1752，上海晶抗生物工程有限公司]，LDH(貨號：YM-QP11477，上海遠慕生物科技有限公司)、Nrf1、PGC-1α、TFAM抗體購于武漢博歐特生物科技有限公司。

1.1.2儀器 冷凍離心機(CTK48，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)、熒光顯微鏡(Ti2-U，NIKON)、小動物呼吸機(R407，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)、切片機(HM 340E，賽默飛)、超低溫冰箱(Forma 700，賽默飛)、多功能酶標儀(SpectraMax Paradigm，美谷分子儀器上海有限公司)。

1.2方法

1.2.1動物飼養(yǎng)及分組 4～5周齡的SPF級SD雄性健康大鼠90只，體質(zhì)量(190±20)g，購于成都達碩實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK(川)2015-030，購回飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25℃，濕度40%～50%，人工光照(12 h/晝、12 h/夜)，全天自由飲水。將90只SD大鼠隨機均分為6組，分別為健康對照組(Ctrl)、模型組(I/R)、陽性對照組(Diltia)、10 mg/kg Lupeol組、20 mg/kg Lupeol組、50 mg/kg Lupeol組，Diltia組與Lupeol組SD大鼠分別灌胃5 mg/kg地爾硫卓、10 mg/kg羽扇豆醇、20 mg/kg羽扇豆醇、50 mg/kg羽扇豆醇，1次/d，連續(xù)灌胃1周，健康對照組與I/R模型大鼠灌胃等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃1周。

1.2.2模型構(gòu)建 MI/RI大鼠模型制備：采取結(jié)扎左冠狀動脈前降支方法制備大鼠MI/RI模型，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，取仰臥位固定頭部、四肢于手術臺，連接心電電極并監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)心電圖、小動物呼吸機(呼吸頻率70次/min，潮氣量9 ml/kg，呼吸比1∶2)，左側(cè)第3～4肋間處剪開大鼠皮膚，分離肌肉組織、打開胸腔、分離心包膜、輕擠壓胸廓、暴露心臟，從左心耳、肺動脈圓錐間找出冠狀動脈左前降支。5/0號帶彎鉤尼龍縫線結(jié)扎分支起點外，在結(jié)扎時尼龍縫線與心肌間放置一根約1 cm細長棉線，此時缺血心肌表現(xiàn)出發(fā)紺、膨出跡象，心電圖有2個以上ST段抬高，T波高聳，或者QRS波增高增寬與T融合，表明心肌缺血形成，結(jié)扎30 min后松開結(jié)扎線，心電圖ST段恢復或與缺血前水平相似，表明大鼠缺血再灌注模型建立成功。其中結(jié)扎前心電圖異常，未觀察至終點就死亡以及造模不成功的大鼠剔除。Ctrl組大鼠不做任何處理。

1.2.3觀察指標 再灌注120 min時，采用超聲心動圖檢查各組大鼠左心室射血分數(shù)(LVEF)、左心室短軸縮短率(FS)、左心室壁厚度(LVWT)、心率(HR)、左心室收縮壓(LVSP)水平，各組大鼠心臟功能指標記錄結(jié)束后，抽取各組大鼠股動脈血5 ml，3 000 r/min 離心15 min，取上層血清并儲存于-80℃，用于肌酸激酶同工酶(CK-Mb)、Mb、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的含量、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β、一氧化氮合酶(iNOS)以IL-6、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)含量檢測。再灌注120 min后，麻醉處死大鼠，取出心臟組織，一部分固定于10%甲醛中性溶液中，用于HE染色以及免疫組化實驗，一部分心臟組織儲存于-80℃，用于RT-PCR以及Western blot檢測。

1.2.4HE切片染色及免疫組化 取置于10%甲醛中性溶液中的心臟組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋，5 μm切片，一部分用于HE染色，切片后進行脫蠟、復水、HE染色、再次脫水及透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察心肌細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。另一部分用于免疫組化，切片脫蠟與復水，PBS浸泡5 min，微波抗原修復，3%H2O2孵育15 min以消除過氧物酶活性，按照試劑盒說明書操作進行，加入DAB顯色，封片圖像采集。

1.2.5Western blot 提取心臟組織蛋白，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度保持一致，經(jīng)過SDS-PAGE電泳，將膜轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入Nrf1、PGC-1α、TFAM、β-actin一抗，于4℃條件下孵育過夜，再用TBST漂洗40 min，分為3次漂洗，再加入經(jīng)HRP標記的二抗繼續(xù)孵育1 h，根據(jù)ECL試劑盒說明書對蛋白條帶進行顯影、定影，觀察各組蛋白條帶成像情況，并進行蛋白條帶分析。

1.2.6RT-PCR 采用TRIzol試劑盒提取組織total RNA，依據(jù)cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄第一條鏈cDNA，用SYBR PCR Master Mix用于RT-PCR，PCR程序設置參考試劑盒說明書，文章用所用引物設計及合成均由Sangon Biotech公司完成。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠心臟功能及超聲心動圖檢查結(jié)果比較 與I/R組相比，Ctrl組、Diltia組、20 mg/kg Lupeol組以及50 mg/kg Lupeol組的HR、LVSP、LVEF、FS以及LVWT均增加(P<0.05)，而10 mg/kg Lupeol組大鼠的HR、LVSP、LVEF、FS以及LVWT與Ctrl組的差異比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2各組大鼠CK-Mb、Mb、cTnI含量比較 與I/R組相比，Ctrl組、Diltia組、20 mg/kg Lupeol組以及50 mg/kg Lupeol組的CK-Mb、Mb、cTnI含量均降低(P<0.05)，而10 mg/kg Lupeol組大鼠的CK-Mb、Mb、cTnI含量與Ctr組的差異比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3羽扇豆醇對MI/RI大鼠心肌組織損傷的保護作用 采用HE染色觀察各組大鼠心肌組織損傷情況，結(jié)果顯示Ctrl組大鼠心肌組織細胞排列規(guī)則緊密、心肌纖維無變形現(xiàn)象且分布均勻；I/R組大鼠心肌組織細胞心肌纖維排列紊亂，胞質(zhì)間水腫現(xiàn)象明顯；Lupeol組大鼠心肌組織細胞損傷程度逐漸減輕，其中 Lupeol 50 mg/kg時的細胞損傷程度最??；Diltia組大鼠心肌細胞的損傷程度明顯低于I/R模型組，見圖1。采用RT-PCR檢測各組大鼠心肌組織中Ki67、Survivin表達量，結(jié)果顯示，與I/R組相比，Ctrl組、Diltia、20 mg/kg Lupeol組以及50 mg/kg Lupeol組心肌組織中的Ki67、Survivin mRNA含量增加(P<0.05)，而10 mg/kg Lupeol組大鼠心肌組織中的Ki67、Survivin mRNA含量與Ctrl組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。采用免疫組化檢測各組大鼠心肌組織中Caspase-3水平，結(jié)果顯示，Diltia組、20 mg/kg Lupeol組以及50 mg/kg Lupeol組心肌組織中的Caspase-3陽性率明顯低于I/R組(P<0.05)，而10 mg/kg Lupeol組Caspase-3陽性率與I/R組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2、表3。

GroupsDosage(mg/kg)HR(beat/min)LVSP(mmHg)LVEF(%)FS(%)LVWT(mm)Ctrl-414.87±35.161)135.37±21.291) 58.05±11.281)28.12±6.930.85±0.061)I/R -207.21±26.5257.02±12.1723.37±8.458.05±1.890.52±0.04Lupeol 10213.12±28.6162.13±14.5425.92±7.369.49±2.010.54±0.0520298.19±38.541) 93.36±10.421) 39.16±6.421)15.05±3.731)0.73±0.071)50349.21±35.491)127.07±9.271) 49.93±8.391)24.46±5.921)0.90±0.051)Diltia5275.64±22.931) 99.58±12.141) 42.03±7.481)20.01±4.141)0.74±0.06

Note：1)P<0.05 compared with the I/R group.

GroupsDosage(mg/kg)CK-Mb(U/L)Mb(ng/ml)cTnI(ng/ml)Ctrl- 21.27±7.381)27.08±8.391)0.12±0.021)I/R -114.25±11.23148.16±14.450.65±0.03Lupeol 10108.74±12.77137.38±18.540.63±0.0620 75.12±10.531) 89.23±11.421)0.29±0.041)5028.52±9.071) 45.26±5.381)0.16±0.031)Diltia537.76±5.981) 58.01±8.071)0.26±0.051)

Note：1)P<0.05 compared with the I/R group.

2.4各組大鼠TNF-α、 IL-1β、 iNOS以及IL-6含量比較 與I/R組相比，Ctrl組、Diltia組、20 mg/kg Lupeol組以及50 mg/kg Lupeol組的TNF-α、IL-1β、iNOS以及IL-6含量均降低(P<0.05)，而10 mg/kg Lupeol組大鼠的TNF-α、IL-1β、iNOS以及IL-6含量與Ctrl組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

2.5各組大鼠MDA、SOD、LDH含量比較 與I/R組相比，Ctrl組、Diltia組、20 mg/kg Lupeol組以及50 mg/kg Lupeol組的MDA含量均降低(P<0.05)，SOD、LDH活性增加(P<0.05)，而10 mg/kg Lupeol組大鼠的MDA含量、SOD、LDH活性與Ctrl組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表5。

2.6各組大鼠Nrf1、PGC-1α、TFAM水平比較 與I/R組相比，Ctrl組、Diltia組、20 mg/kg Lupeol組以及50 mg/kg Lupeol組的Nrf1、PGC-1α、TFAM水平增加(P<0.05)，而10 mg/kg Lupeol組大鼠的Nrf1、PGC-1α、TFAM水平與Ctrl組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表6、圖3。

GroupsDosage(mg/kg)Ki67 mRNA(2-ΔΔCt)Survivin mRNA(2-ΔΔCt)Caspase-3 positive rate(%)Ctrl-11)11)-I/R -0.17±0.030.04±0.0163.54±5.48Lupeol 100.19±0.040.07±0.0259.74±4.47200.45±0.051)0.29±0.031)42.65±3.881)500.84±0.071)0.68±0.041)23.41±2.651)Diltia50.75±0.061)0.54±0.031)13.58±1.251)

Note：1)P<0.05 compared with the I/R group.

GroupsDosage(mg/kg)TNF-α(pg/ml)IL-1β(pg/ml)iNOS(pg/ml)IL-6(pg/ml)Ctrl- 45.16±7.341) 37.42±0.091)54.64±8.821)14.17±4.171)I/R -144.64±16.54176.79±21.25231.42±29.4889.73±13.68Lupeol 10139.48±19.62169.66±25.34226.43±25.6685.69±11.3120 96.35±12.141) 107.01±18.121) 145.62±15.281)57.36±9.051)50 53.48±9.441) 63.55±9.171) 79.38±8.441)26.21±6.531)Diltia5 62.53±10.261) 58.68±11.141) 98.06±13.541)38.32±7.281)

Note：1)P<0.05 compared with the I/R group.

GroupsDosage(mg/kg)MDA(mmol/ml)SOD(U/ml)LDH(U/L)Ctrl-2.15±0.311)11.03±1.611)896.39±125.041)I/R -5.72±0.543.58±0.572 371.01±284.12Lupeol 105.68±0.463.54±0.762 291.42±219.48203.52±0.351)7.14±0.441)1 732.39±165.281)502.44±0.521)10.05±0.821)1 023.48±127.131)Diltia52.83±0.431)6.04±0.611)1 648.03±150.941)

Note：1)P<0.05 compared with the I/R group.

GroupsDosage(mg/kg)Nrf1/β-actin(%)PGC-1α/β-actin(%)TFAM/β-actin(%)Ctrl-0.22±0.031)0.57±0.071)0.29±0.041)I/R -0.02±0.010.01±0.010.04±0.02Lupeol 100.04±0.010.02±0.010.05±0.03200.08±0.031)0.14±0.031)0.12±0.041)500.18±0.041)0.64±0.071)0.30±0.021)Diltia50.26±0.021)0.44±0.061)0.32±0.051)

Note：1)P<0.05 compared with the I/R group.

圖3 各組大鼠心肌組織Nrf1、PGC-1α、TFAM凝膠成像結(jié)果(×200)

3 討論

再灌注是治療冠心病急性心肌梗死的重要方式之一，可以快速打開患者堵塞血管并恢復患者冠狀脈血供。雖然再灌注治療在冠心病救治方面取得一定效果，但其也只限于局部治療，不能有效阻止冠心病的病理進程，治療后也會出現(xiàn)MI/RI心肌損傷，導致冠心病患者的治療效果欠佳[5]。MI/RI為冠心病病理環(huán)節(jié)之一，臨床表現(xiàn)為氣短、胸痛、乏力、心率失常等癥狀，MI/RI使機體氧自由基增多、鈣離子超載、炎癥反應、線粒體功能及能量代謝出現(xiàn)障礙，最終使心肌組織細胞發(fā)生不可逆的損傷，增加患者心力衰竭、心源性猝死風險[6]。

MI/RI促進心肌細胞凋亡，增加心臟梗死面積，加重心肌功能損傷[7]。羽扇豆醇廣泛存在于食用植物與中草藥中，并且對多種癌癥表現(xiàn)出抗癌作用，濃度羽扇豆醇可以致癌物質(zhì)對大鼠肝臟損傷[8,9]。本研究結(jié)果顯示I/R模型組大鼠HR、LVSP、LVEF、FS及LVWT降低，心臟組織的受損程度嚴重，羽扇豆醇預處理后再進行MI/RI可以明顯改善大鼠再灌注后的心臟功能，減低血清CK-Mb、Mb、cTnI、LDH含量以及心肌組織的Caspase-3陽性率，并增加心肌組織中Ki67、Survivin mRNA含量。CK-Mb、Mb、cTnI及LDH是檢測心肌損傷的重要指標[10]，Ki67為調(diào)節(jié)細胞增殖有關基因并參與細胞周期調(diào)節(jié)[11]，Survivin為凋亡抑制基因[12]，Caspase-3是機體內(nèi)所有凋亡途徑最終行使凋亡功能的蛋白[13]。程斌等[14]研究發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rb1可以促進Survivin表達，抑制大鼠脊髓缺血再灌注引起的細胞凋亡，從而保護神經(jīng)功能。三七總皂苷可以增加全腦缺血大鼠側(cè)腦室室管膜區(qū)的Ki67表達水平，加速神經(jīng)祖細胞的增殖[15]。劉春曉等[16]研究顯示枳實薤白桂枝湯可以抑制MI/RI大鼠血清中cTnI、LDH含量，并抑制心肌組織中Caspase-3表達。本研究結(jié)果與既往研究相似，表明羽扇豆醇對MI/RI大鼠的心臟具有保護作用，可能是通過上調(diào)Ki67、Survivin表達，降低心臟組織細胞中Caspase-3水平，促進心肌細胞增殖、抑制心肌細胞凋亡，來實現(xiàn)對大鼠的心臟保護作用。

正常生理狀態(tài)下，心肌細胞中存在少量的氧自由基，但會被自由基清除系統(tǒng)清除，不會對心肌細胞產(chǎn)生嚴重損傷。當發(fā)生缺血缺氧時，機體清除自由基的能力降低，生成自由基的能力增強，當機體恢復血氧供給后，自由基含量增加，增強機體氧化應激反應。本研究結(jié)果顯示心肌缺血再灌注大鼠的血清SOD活性降低，MDA、TNF-α、IL-1β、iNOS以及IL-6水平增加，而羽扇豆醇可以降低心肌缺血再灌注大鼠血清中MDA、TNF-α、IL-1β、iNOS以及IL-6含量并增加SOD活性。SOD在自由基清除過程具有重要作用，當機體內(nèi)SOD減少時，細胞膜中的不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)容易受到自由基破壞，使脂質(zhì)發(fā)生降解產(chǎn)生MDA，同時也會改變細胞的通透性，導致線粒體功能出現(xiàn)障礙，所以MDA與SOD能夠反映機體氧化應激狀態(tài)[17,18]。與此同時，心肌缺血再灌注損傷也與炎癥因子有著密切關系，當發(fā)生MI/RI時，巨噬細胞中的iNOS表達上調(diào)，使iNOS含量增加，促進再灌注損傷；TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥因子含量增加可以通過反饋作用促進氧自由基含量增多，加重缺血再灌注損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)羽扇豆醇可以增加MI/RI大鼠心肌組織中的Nrf1、PGC-1α、TFAM水平。Nrf1能夠調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈相關基因表達的轉(zhuǎn)錄因子，是NRFs的亞型之一，PGC-1α可以與NRFs結(jié)合作用于線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)的啟動子區(qū)，促進線粒體DNA復制與轉(zhuǎn)錄，促進線粒體的增殖。TFAM水平對維持機體線粒體呼吸鏈的電子傳遞具有重要作用，是細胞能量代謝的重要保證。劉路等[19]研究顯示電針“足三里”穴可以促進大鼠心肌組織Nrf1、PGC-1α、TFAM水平，提高能量代謝。本研究與其相似，表明羽扇豆醇可以降低MI/RI大鼠的心肌組織的氧化應激及炎性反應，提高心肌細胞能量代謝，從而實現(xiàn)對心臟功能的保護作用。

綜上所述，羽扇豆醇一方面可以通過降低MI/RI大鼠心肌細胞Caspase-3陽性率，上調(diào)心肌組織Ki67、Survivin表達，來促進心肌細胞增殖、降低細胞凋亡；羽扇豆醇一方面還可以降低MI/RI大鼠血清促炎性因子水平，提高機體清除自由基能力，降低機體氧化應激反應，保護線粒體呼吸鏈，提高心肌細胞的能量代謝，從而實現(xiàn)對MI/RI大鼠心臟功能及心肌損傷的保護作用。本研究結(jié)論僅僅是在大鼠實驗所得，在臨床上是否也存在相似功能，還需要進一步研究。