不同雷公藤制劑對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎貧血患者的療效及其機(jī)制①

孫艷秋 劉 健 黃 旦 文建庭 張 穎 (安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，合肥 230038)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種不明原因的自身免疫性疾病，以慢性、對(duì)稱性、進(jìn)行性多關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)，以滑膜炎、血管翳形成為其重要的致殘病理基礎(chǔ)[1-3]，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。貧血為RA中最常見的關(guān)節(jié)外癥狀之一，文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)生率在30%～60%不等；合并嚴(yán)重貧血是加重患者全身癥狀及關(guān)節(jié)功能障礙、影響預(yù)后的重要因素[4]。中藥雷公藤被廣泛地用在RA等風(fēng)濕病的治療中，雷公藤多苷片是臨床常用的雷公藤制劑，作為我國較早研發(fā)使用的抗炎、免疫調(diào)節(jié)藥物，在臨床治療RA療效確切。復(fù)方雷公藤制劑新風(fēng)膠囊為我院院內(nèi)制劑，臨床應(yīng)用20余年，文獻(xiàn)顯示，新風(fēng)膠囊能夠通過顯著升高血清 EPO、改善鐵代謝(升高SI、TF,降低SF)、調(diào)節(jié)體內(nèi)細(xì)胞因子群的平衡(降低致炎性細(xì)胞因子IL-1、TNF-α，升高抑炎細(xì)胞因子IL-10),以及上調(diào) CD4+CD25+CD127loTreg的表達(dá)水平、調(diào)節(jié)免疫，進(jìn)而減輕 RA疾病對(duì)造血功能產(chǎn)生的抑制[5，6],保護(hù)血細(xì)胞，在治療RA原發(fā)病的同時(shí)又改善貧血,減輕患者的病痛。鐵調(diào)素(Hepcidin,Hepc)作為調(diào)節(jié)鐵代謝的負(fù)性關(guān)鍵因素，在較多研究中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量改變參與RA患者機(jī)體貧血過程。本研究觀察不同雷公藤制劑：雷公藤多苷片、新風(fēng)膠囊治療RA貧血的療效及Hepc相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響，并探討其初步作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1診斷標(biāo)準(zhǔn) 診斷依據(jù)參考2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(EULAR)共同提出的RA分類標(biāo)準(zhǔn)[7]。貧血診斷標(biāo)準(zhǔn)參考1972年WHO制訂標(biāo)準(zhǔn)：海平面地區(qū)成年男性<130 g/L，成年女性<120 g/L。輕度貧血男：90 g/L≤Hb<130 g/L，女：90 g/L≤Hb<120 g/L；中度貧血60 g/L≤Hb<90 g/L；重度貧血30 g/L≤Hb<60 g/L；極重度貧血Hb<30 g/L。

1.1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 所有納入患者符合RA、貧血診斷標(biāo)準(zhǔn)；Hb在60～100 g/L的患者；排除合并其他自身免疫性疾病、原發(fā)或繼發(fā)血液系統(tǒng)疾病患者，以及未成年、妊娠、哺乳期、月經(jīng)過多及精神疾病患者。

1.1.3研究對(duì)象 50例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎貧血患者來自2018年8月至2019年5月就診于安徽省中醫(yī)院風(fēng)濕科患者。其中男12例，女38例，年齡37～72歲，平均年齡(52.86±9.14)歲；病程3.5～12年，平均(7.13±2.14)年。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為新風(fēng)膠囊組(XFC組)與雷公藤多苷片組(TPT組)各25例，要求兩組在年齡、性別等方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。健康志愿者25例，作為健康對(duì)照組，均來自安徽省中醫(yī)院體檢中心，經(jīng)檢查排除自身免疫性疾病及其他器質(zhì)性疾病者。要求健康對(duì)照組在年齡、性別一般基線方面，與治療組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。本實(shí)驗(yàn)納入研究對(duì)象均簽署知情同意書，并通過安徽省中醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1治療方案 治療組予以復(fù)方雷公藤制劑新風(fēng)膠囊(Xinfeng Capsule,XFC)，由安徽省中醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)，皖藥制字號(hào)：皖藥制Z20050062，規(guī)格：0.4 g/粒，組方：雷公藤、蜈蚣、黃芪、薏苡仁；每粒膠囊含生藥浸出物 0.4 g。服用方法：口服，每日3次，每次3粒。對(duì)照組雷公藤多苷片(Tripterygium,TPT)，福建匯天生物藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z35020431，規(guī)格10 mg/粒，每日3次，每次3片。連服1個(gè)月。兩組患者在治療前均未使用糾正貧血藥物及輸血治療；兩組患者在治療期間均停用其他治療RA的慢作用抗風(fēng)濕藥及糖皮質(zhì)激素，可繼續(xù)維持使用非甾體類抗炎藥物。

1.2.2指標(biāo)檢測(cè) 研究者于空腹采集外周靜脈血5 ml，4℃至自然凝固后3 000 r/min離心5 min，分離血清，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)血清轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)、鐵調(diào)素(Hepc)、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白6(BMP6)、SMAD4蛋白(SMAD4)、JAK激酶2(JAK2)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)(ELISA試劑盒由武漢基因美科技有限公司提供)，應(yīng)用比色法測(cè)定血清鐵(SI)、總鐵結(jié)合力(TIBC)(試劑盒由南京建成生物工程研究所提供)；紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(Hb)采用血球儀SYSMEX XE2100測(cè)定；RBC、Hb由安徽省中醫(yī)院檢驗(yàn)中心檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1RA貧血患者相關(guān)指標(biāo)變化

2.1.1RA貧血患者血常規(guī)指標(biāo)、炎癥指標(biāo)情況 與正常對(duì)照組相比，RA患者RBC、Hb、CRP、ESR、IL-6、TNF-ɑ均升高，IL-4、IL-10均下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

2.1.2RA貧血患者鐵代謝指標(biāo)情況 與正常組相比，RA組鐵代謝指標(biāo)SI、TIBC水平明顯降低，TRF、Hepc、BMP6、SMAD4、JAK2、STAT3明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

2.2XFC、TPT組患者血常規(guī)指標(biāo)、炎癥指標(biāo)、鐵代謝及相關(guān)信號(hào)通路指標(biāo)的變化

IndexNC group(n=25)RA group(n=50)RBC(109 L-1)M:4.64±0.73M:3.87±0.541)F:4.26±0.40F:3.59±0.211)Hb(g/L)M:143.62±7.69M:95.35±5.481)F:127.85±6.33F:90.78±4.071)CRP(mg/dl)1.66±1.5359.28±64.581)ESR(mm/h)M:4.14±3.02M:62.23±33.821)F:8.29±5.66F:70.96±39.901)IL-4(ng/L)97.65±8.1441.04±7.731)IL-6(ng/L)25.35±2.89112.62±14.331)IL-10(ng/L)115.37±14.5046.45±10.151)TNF-ɑ(ng/L)112.12±5.25318.00±34.451)

Note：M.Male;F.Female;compared with NC group，1)P<0.01.

2.2.1XFC、TPT組患者血常規(guī)指標(biāo)、炎癥指標(biāo)及炎癥細(xì)胞因子指標(biāo)的情況 與本組治療前相比，兩組患者治療后RBC、Hb、IL-4、IL-10均升高，CRP、ESR、IL-6、TNF-ɑ均下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。兩組相比，XFC組在升高RBC、Hb、IL-4方面，降低TNF-α方面優(yōu)于TPT組(P<0.05或P<0.01)，而TPT組在降低CRP、ESR，升高IL-10方面，優(yōu)于XFC組(P<0.05或P<0.01)。兩組降低IL-6方面，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.2.2XFC、TPT組患者鐵代謝指標(biāo)、Hepc相關(guān)信號(hào)通路指標(biāo)比較 對(duì)治療前相比，兩組患者治療后SI、TIBC均升高，Hepc、IL-6、TNF-α、BMP6、SMAD4、 JAK2、STAT3均下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。并且XFC組在升高SI方面，降低TRF、Hepc、BMP6、SMAD4、JAK2、STAT3方面，優(yōu)于TPT組(P<0.05或P<0.01)；兩組在升高TIBC、降低IL-6方面，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

IndexNC group(n=25)RA group(n=50)Hepc(ng/L)217.24±14.48883.34±109.251)SI(μmol/L)34.71±1.9016.49±3.861)TRF(ng/L)6.87±0.6446.31±3.881)TIBC(μmol/L)74.41±1.4453.55±2.051)BMP6(ng/L)22.03±1.73466.66±82.581)SMAD4(ng/L)135.73±12.27417.14±74.101)JAK2(ng/L)163.05±8.42422.27±35.971)STAT3(ng/L)36.05±3.12120.41±22.511)

Note：Compared with NC group，1)P<0.01.

IndexXFC group(n=25)Before treatmentAfter treatmentTPT group(n=25)Before treatmentAfter treatmentRBC(109 L-1)M:3.86±0.43M:4.05±0.411)M:3.87±0.65M:3.92±0.421)2)F:3.60±0.24F:3.76±0.251)F:3.58±0.18F:3.64±0.171)2)Hb(g/L)M:96.33±5.78M:110.51±16.551)M:94.37±5.18M:102.52±11.311)2)F:89.68±4.03F:105.52±4.341)F:91.88±4.11F:98.75±4.271)3)CRP(mg/dl)59.28±44.5850.18±24.511)61.33±33.4940.66±17.361)3)ESR(mm/h)M:58.48±39.82M:49.42±17.331)M:65.98±27.82M:39.66±13.241)3)F:72.50±38.21F:50.84±23.771)F:69.42±41.59F:43.64±20.161)3)IL-4(ng/L)40.81±10.7557.75±16.691)41.27±2.5555.43±3.311)2)IL-6(ng/L)109.78±18.0251.62±7.561)112.62±14.3354.57±7.631)IL-10(ng/L)50.59±11.8753.25±20.321)46.45±10.1557.87±15.511)2)TNF-ɑ(ng/L)326.00±39.68129.10±19.961)310.01±26.76174.09±10.951)2)

Note：M.Male;F.Female;compared with before treatment,1)P<0.01；compared with XFC group,2)P<0.05,3)P<0.01.

表4 XFC、TPT組患者鐵代謝指標(biāo)、Hepc相關(guān)信號(hào)通路指標(biāo)比較

Tab.4 Comparison of iron metabolism indicators and Hepc-related signaling pathway indicators in XFC and TPT patients

IndexXFC group(n=25)Before treatmentAfter treatmentTPT group(n=25)Before treatmentAfter treatmentSI(μmol/L)15.27±2.9626.28±1.831)16.49±3.8626.90±2.091)2)TRF(ng/L)45.50±3.6817.32±6.931)46.31±3.8819.61±5.461)2)TIBC(μmol/L)54.41±1.5165.60±1.291)53.55±2.0564.77±2.141) Hepc(ng/L)844.79±127.53340.22±60.761)921.87±70.76466.86±210.651)3)BMP6(ng/L)438.42±102.27194.33±26.691)494.90±42.46227.78±14.811)3)SMAD4(ng/L)389.67±94.69166.85±28.431)444.60±25.91226.16±20.061)3)JAK2(ng/L)416.52±49.35214.42±22.391)428.02±11.70242.73±14.951)3)STAT3(ng/L)118.51±30.6150.87±8.911)122.32±9.4863.95±4.691)3)

Note：Compared with before treatment,1)P<0.01；compared with XFC group,2)P<0.05,3)P<0.01.

3 討論

RA貧血中以慢性病貧血為最常見的類型，占60%～80%，常伴有血液指標(biāo)中單核-巨噬細(xì)胞鐵沉著，血清鐵和總鐵結(jié)合力均顯著降低，以及血清鐵蛋白含量增加[8，9]。Hepc作為調(diào)節(jié)鐵代謝關(guān)鍵因素，在較多研究中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量改變參與機(jī)體貧血過程。RA活動(dòng)時(shí)免疫細(xì)胞、炎癥因子損傷關(guān)節(jié)的同時(shí)干擾正常造血過程，具體包括直接抑制骨髓紅系造血代償、抑制腎臟促紅細(xì)胞生成素合成、縮短紅細(xì)胞壽命、干擾鐵代謝等方面[10]。既往研究表明，炎癥細(xì)胞因子及通路、補(bǔ)體系統(tǒng)、免疫球蛋白等對(duì)RA病程發(fā)展起重要作用[11]。TNF-α、IL-6等促炎因子浸潤于RA關(guān)節(jié)滑膜組織，對(duì)滑膜組織增生、巨噬細(xì)胞激活等起重要作用。IL-4、IL-10可抑制促炎因子分泌、發(fā)揮下調(diào)炎癥反應(yīng)的作用，對(duì)RA患者組織起保護(hù)性[12]。ESR、CRP、RF等指標(biāo)常常用于判斷風(fēng)濕性疾病活動(dòng)期，對(duì)評(píng)估疾病的進(jìn)展、預(yù)后方面有重要意義。Hepc是RA貧血患者鐵代謝重要的負(fù)性調(diào)控者，而BMP6/SMAD4、JAK2/STAT3信號(hào)通路為調(diào)節(jié)Hepc介導(dǎo)貧血的主要信號(hào)通路，且兩條信號(hào)通路的表達(dá)存在相互影響，共同作用促進(jìn)Hepc分泌。研究表明，通過敲除小鼠的 SMAD4 基因，不僅使Hepc的表達(dá)急劇減少，而且發(fā)現(xiàn)小鼠Hepc的表達(dá)在 BMP/SMAD 通路不完整的情況下不受炎癥因子IL-6的影響[13]。本研究通過與正常對(duì)照組對(duì)比發(fā)現(xiàn)，RA組RBC、Hb、SI、TIBC、IL-4、IL-10水平明顯降低，CRP、ESR、TRF、Hepc、IL-6、TNF-α、BMP6、SMAD4、JAK2、STAT3明顯升高，表明RA貧血患者體內(nèi)存在高水平的炎癥反應(yīng)、促炎與抑炎細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡、鐵代謝紊亂，及BMP6/SMAD4、JAK2/STAT3介導(dǎo)的Hepc相關(guān)信號(hào)通路的異?；罨?。

中藥雷公藤被廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕病的治療，具有“祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、消腫止痛”的功效；雷公藤功效最早記錄于《滇南本草》，記載其“味辛，性溫，有毒。入肝脾十二經(jīng)，行十二經(jīng)絡(luò)”，具有“治筋骨疼痛，風(fēng)寒濕痹，癱瘓痿軟，濕氣流痰”等功效?，F(xiàn)代研究表明雷公藤具有抑制增殖、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗癌等作用[14,15]。雷公藤多苷片是經(jīng)中藥雷公藤減毒后制成的雷公藤制劑，作為我國較早研發(fā)使用的抗炎、免疫調(diào)節(jié)藥物，在臨床治療RA療效確切。復(fù)方雷公藤制劑新風(fēng)膠囊由雷公藤、蜈蚣、黃芪、薏苡仁4味藥通過配伍組成，應(yīng)用于臨床20余年，文獻(xiàn)表明其具有良好的調(diào)節(jié)免疫、抗炎鎮(zhèn)痛、穩(wěn)定紅細(xì)胞膜、增加微循環(huán)灌注等作用，能夠改善細(xì)胞代謝和促進(jìn)功能恢復(fù)等[16]；劉健等[17]通過研究發(fā)現(xiàn)：處于疾病活動(dòng)期的RA貧血的患者的外周血中，表現(xiàn)為CD4+CD25+CD127loTreg水平的降低。經(jīng)XFC干預(yù)后 CD4+CD25+Treg、Foxp3、CD4等蛋白的表達(dá)升高，5-HT、CORT、TNF-α表達(dá)降低，調(diào)節(jié) Notch 信號(hào)傳導(dǎo)通有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)TPT組、XFC組患者：經(jīng)不同雷公藤制劑TPT、XFC治療后，兩組患者與治療前相比，RBC、Hb、SI、TIBC、IL-4、IL-10均升高，CRP、ESR、TRF、Hepc、IL-6、TNF-α、BMP6、SMAD4、JAK2、STAT3明顯下降。表明以上兩種不同雷公藤制劑均能夠改善RA患者的貧血狀態(tài)，降低炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)機(jī)體鐵代謝，降低Hepc信號(hào)通路的活化。而通過TPT組、XFC組的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，XFC組在升高RBC、Hb、SI、IL-4方面，降低TRF、Hepc、TNF-α、BMP6、SMAD4、JAK2、STAT3方面，優(yōu)于TPT組；表明XFC在改善患者貧血、調(diào)節(jié)鐵代謝方面，療效優(yōu)于TPT。

綜上，雷公藤多苷片、新風(fēng)膠囊兩種不同雷公藤制劑，均能夠改善患者的貧血狀態(tài)，與降低RA患者機(jī)體炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)鐵代謝，降低Hepc相關(guān)的BMP6/SMAD4、JAK2/STAT3信號(hào)通路的活化有關(guān)。并且新風(fēng)膠囊在升高血紅蛋白、調(diào)節(jié)鐵代謝，降低Hepc相關(guān)信號(hào)通路活化方面，優(yōu)于雷公藤多苷片，其具體分子學(xué)機(jī)制，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。