漢黃芩素對LPS-ATP誘導的巨噬細胞氧化應激的抑制作用①

周思瑤 游雷鳴 張海麗 趙夢繁 蘇日娜 劉 慧 郝 鈺

(北京中醫(yī)藥大學生命科學學院免疫與微生物學系,北京 100029)

漢黃芩素是從中藥黃芩、半枝蓮等植物中分離得到的一種重要的黃酮類化合物。現代藥理研究發(fā)現，漢黃芩素具有明顯抗炎作用[1]。且相關研究表明，漢黃芩素可通過抑制NF-κB和MAPK信號通路抑制LPS誘導的大鼠背根神經節(jié)神經元炎癥反應[2]。漢黃芩素能通過抗炎及抗氧化作用來減輕糖尿病性心肌病[3]。且漢黃芩素還可通過抑制氧化應激誘導的MAPK和NF-κB途徑來減輕大鼠體內鎘誘導的腎毒性[4]。還有文獻表明，漢黃芩素可通過激活Nrf2/HO-1-SOD2-NQO-1-GCLC信號轉導軸來抑制IL-1β刺激引起的MAPK信號通路活化，從而抑制炎癥反應[5]。我們從大量參考文獻中得出，漢黃芩素具有明顯的抗氧化應激及抗炎作用。

我們課題組已有前期研究證明，漢黃芩素能抑制 LPS-ATP 聯(lián)合刺激巨噬細胞炎癥反應的發(fā)生，與 LPS 和 ATP 聯(lián)合刺激組相比，漢黃芩素干預組能明顯降低胞內 IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α、NLRP3和 Caspase-1 的 mRNA 水平，減少NF-κB核轉位，并能下調胞外TNF-α和胞內ROS水平[6]。ROS是氧化應激的重要產物，大量的ROS又可以激活巨噬細胞的核轉錄因子 NF-κB使其發(fā)生核轉位，誘導炎癥反應[7]。由此，我們認為漢黃芩素可能是通過降低胞內的ROS水平，減少NF-κB核轉位，抑制NF-κB介導的炎癥基因轉錄繼而減輕巨噬細胞的炎癥反應。那么，是什么機制使胞內ROS水平降低的？是漢黃芩素直接減少ROS產生和釋放還是通過激活抗氧化信號通路降解過多的ROS？Nrf2信號通路是細胞內氧化應激最重要的防御系統(tǒng)之一，當細胞發(fā)生氧化應激，Nrf2 信號通路首先被激活，進而引發(fā)抗氧化物及相關酶類的大量表達，以抵御氧化應激引發(fā)的細胞損傷，減少ROS產生[8]。為此，本研究以脂多糖和三磷酸腺苷聯(lián)合刺激小鼠巨噬細胞為炎癥模型,從抗氧化的角度探究漢黃芩素抑制巨噬細胞炎癥反應的作用機制，并探究漢黃芩素對Nrf2信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 小鼠巨噬細胞系RAW264.7(ATCC:TIB-71),由北京中醫(yī)藥大學免疫與微生物學系實驗室保存。漢黃芩素購自中國藥品生物制品檢定所,反轉錄試劑盒、ATP購自TaKaRa公司,RNA提取試劑TRIZOL購自Invitrogen公司,SYBGreen熒光定量PCR試劑盒購自ToYoBo公司,LPS購自Sigma公司,SOD、MDA檢測試劑盒購自凱基生物公司,胎牛血清購自HyClone公司,Anti-Nrf2抗體、山羊抗兔IgG購自Abcam公司，4%組織細胞固定液購自索萊寶公司，山羊血清購自中杉金橋公司，NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所。引物采用Primer5.0設計,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) RAW264.7細胞用含 10%胎牛血清的 DMEM 高糖培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。鏡下觀察細胞密度達80%左右予以傳代。

1.2.2檢測試劑盒測定巨噬細胞SOD、MDA、NO的分泌水平 將對數生長期的巨噬細胞RAW264.7接種到6孔板中(1×106個細胞/孔)，設對照組(正常培養(yǎng)不予以刺激)、模型組(先加LPS刺激4 h后再加ATP刺激30 min,LPS和ATP終濃度均為 1 μg/ml)和漢黃芩素(56 μmol/L、28 μmol/L、14 μmol/L)干預組(加入LPS的同時加入漢黃芩素，4 h后加ATP刺激30 min),每組4個復孔。取培養(yǎng)皿中的上清，按照SOD、MDA、NO檢測試劑盒說明書，分別對各組細胞上清中的SOD、MDA、NO水平進行檢測。

1.2.3免疫熒光法檢測巨噬細胞Nrf2核轉位 將巨噬細胞RAW264.7制成細胞濃度為1×104個/ml的細胞懸液，接種1 ml到20 mm激光共聚焦培養(yǎng)皿中。設對照組、模型組、漢黃芩素干預組，各組處理方式同方法1.2.2。待細胞生長至50%～60%，吸凈培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞(3次,3 min/次)。每皿加2 ml 4%多聚甲醛溶液,室溫固定細胞15 min，用PBS清洗細胞(3次,3 min/次)。接著,用0.1%Triton X-100處理細胞15 min(室溫透化),PBS清洗細胞(3次,5 min/次),然后用山羊血清封閉細胞1 h(每皿1 ml),吸凈封閉液，加入兔抗Nrf2抗體工作液(山羊血清1∶500稀釋)，37℃孵育2 h。PBS洗細胞(3次，5 min/次)，加入羊抗兔IgG的二抗工作液(山羊血清1∶500稀釋)，37℃孵育1 h。PBS洗細胞(3次，5 min/次)。加入DAPI對細胞核染色(藍色)，室溫避光孵育5 min。PBS洗細胞(3次,5 min/次)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察Nrf2(紅色)的定位情況。

1.2.4RT-qPCR檢測巨噬細胞Nrf2和抗氧化酶mRNA水平 將巨噬細胞RAW264.7接種到6孔板中(2×106個細胞/孔),設對照組、模型組、漢黃芩素(56 μmol/L、28 μmol/L、14 μmol/L)干預組,每組3個復孔，各組處理方法與1.2.2相同。棄去各孔培養(yǎng)基后用PBS清洗各孔細胞,加入TRIZOL試劑裂解細胞(500 μl/孔),參照說明書的操作要求分別提取各孔細胞的總RNA。參照反轉錄試劑盒操作說明,各取1 μg RNA配制10 μl反轉錄體系合成相應的cDNA,得到的cDNA用DEPC水做10倍稀釋后備用。取1 μl稀釋后的cDNA作為模板,以小鼠GAPDH基因作為內參,加入相應的引物(表1),利用實時熒光定量PCR(qPCR)法檢測各組樣品中相應基因的mRNA水平。定量分析基因包括Nrf2、HO-1、SOD、GPx、CAT以及NQO-1,qPCR數據采用2-ΔΔCt法進行處理和分析。

表1 設計并合成的引物

Tab.1 Primers designed and synthesized in this study

PrimersSequence(5'to 3')qR_Nrf2-FTCTGAGCCAGGACTACGACGqR_Nrf2-R GAGGTGGTGGTGTCTCTGCqR_HO-1-FACAGGTTGACAAGAAGAGGCTAAqR_HO-1-RAACAGGAAGCTGAGAGTGAGGqR_SOD-FGCCCGCTAAGTGCTGAGTCqR_SOD-RAGCCCCAGAAGGATAACGGAqR_GPx-FAGGGTAGAGGCCGGATAAGGqR_GPx-RCGAGCAGCACACATACTGGAqR_CAT-FCTGAGAGAGGGTACACGCAqR_CAT-RGAGCCTGACTCTCCAGTGACqR_NQO-1-FGAGAGGATGGGAGGTACTCGqR_NQO-1-RAATATCTGGGCTCAGGCGTC

2 結果

2.1漢黃芩素干預能明顯降低LPS和ATP聯(lián)合刺激的巨噬細胞MDA、NO分泌水平 模型組(LPS-ATP聯(lián)合刺激)與對照組相比，巨噬細胞分泌的NO、MDA顯著增多；與模型組相比，漢黃芩素干預組能夠明顯降低巨噬細胞NO、MDA的分泌水平(表2)。

2.2漢黃芩素能促進LPS和ATP聯(lián)合刺激的巨噬細胞Nrf2 mRNA表達及胞內Nrf2的核轉位 熒光定量PCR結果顯示，與對照組相比，模型組(LPS-ATP聯(lián)合刺激)巨噬細胞中的Nrf2 mRNA水平顯著升高；與模型組相比，漢黃芩素低劑量干預組(14 μmol/L)巨噬細胞中的Nrf2 mRNA水平明顯升高(圖1A)。免疫熒光法觀察巨噬細胞內Nrf2核轉位發(fā)現，對照組巨噬細胞內Nrf2幾乎不表達，模型組Nrf2明顯表達，但多在胞漿內，漢黃芩素干預組巨噬細胞內Nrf2明顯表達，且細胞核內的Nrf2表達量較模型組明顯增多(圖1B、C)。

2.3漢黃芩素能夠上調LPS和ATP聯(lián)合刺激的巨噬細胞抗氧化酶HO-1、SOD、GPx、CAT以及NQO-1的mRNA水平 熒光定量PCR結果顯示，與對照組相比，模型組巨噬細胞中抗氧化酶HO-1、SOD、GPx、CAT、NQO-1的mRNA水平顯著降低。在LPS-ATP聯(lián)合刺激時加入漢黃芩素干預，細胞中這些抗氧化酶的mRNA水平顯著升高(圖2)。

GroupsMDA(nmol/ml)NO(μmol/L)Control group0.34±0.0327.84±0.55Model group1.14±0.071)44.51±2.081)Low dose wogonin(14 μmol/L)0.88±0.112)23.87±1.522)Middle dose wogonin( 28 μmol/L)0.75±0.092)40.30±0.92High dose wogonin(56 μmol/L)0.67±0.062)30.12±1.172)

Note:Compared to Control group,1)P<0.01;compared to Model group,2)P<0.01.

圖1 漢黃芩素對LPS和ATP刺激的巨噬細胞(RAW264.7)Nrf2 mRNA水平及Nrf2核轉位的影響

圖2 漢黃芩素對LPS和ATP聯(lián)合刺激的RAW264.7細胞抗氧化酶mRNA水平的影響

圖3 漢黃芩素對LPS和ATP聯(lián)合刺激的RAW264.7細胞SOD活性的影響

2.4漢黃芩素能明顯提高LPS和ATP聯(lián)合刺激的巨噬細胞SOD活性 模型組(LPS-ATP聯(lián)合刺激)與對照組相比,SOD活性顯著降低；與模型組相比，漢黃芩素干預組能顯著逆轉SOD活性被抑制的情況(圖3)。

3 討論

炎癥是機體對各種致炎因素引起組織損害而產生的一種基本病理過程，也是許多疾病的重要發(fā)生機制。適當的炎癥反應作為機體的一種自我保護機制是有益的，但過度炎癥反應則會造成組織器官嚴重的病理損傷。我們課題組的前期研究表明，漢黃芩素能顯著抑制LPS和ATP聯(lián)合誘導的巨噬細胞RAW264.7的炎癥反應，能明顯降低胞內IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α、NLRP3和Caspase-1的mRNA水平，減少NF-κB核轉位，并能下調胞外TNF-α和胞內ROS水平[6]。ROS又稱活性氧，其產生與炎癥密切相關。有研究表明，ROS可以激活巨噬細胞的核轉錄因子NF-κB核轉位，誘導炎癥反應[7]。還有研究表明，細胞應激后ROS濃度增加導致硫氧還蛋白(TXNIP也稱為VDUP1)從氧化硫氧還蛋白-1(Trx-1)中解離，TXNIP隨后與NLRP3相結合并激活NLRP3炎性小體[9]。這些都說明漢黃芩素對巨噬細胞炎癥的抑制作用可能與其下調胞內ROS水平有關，那么漢黃芩素又是通過什么機制下調胞內ROS水平的呢？眾所周知，ROS是氧化應激的重要產物，而氧化應激的發(fā)生是由于機體或細胞遭受內源性或外源性的有害物質刺激后，產生大量的自由基，釋放出過多的活性氧簇(ROS)、活性氮簇(RNS)等氧化物質，而機體或細胞本身的抗氧化能力下降，機體的氧化反應大大超出抗氧化的清除能力，導致大量積累的 ROS等[11]氧化物不能被清除，從而誘導細胞損傷，并促進炎癥反應發(fā)生[10]。反過來，炎癥細胞在炎癥部位釋放出許多活性物質，也會導致氧化應激加劇。薛嘉虹等[11]研究表明，炎癥因子 TNF-α 可增強 NADPH 氧化酶的表達，并抑制抗氧化酶SOD的表達，導致氧化應激反應的發(fā)生，而抑制 TNF-α 的表達，可有效地抑制氧化應激反應。由此可見，氧化應激和炎癥是密切相關的病理生理過程，常相伴而生。據此，本研究以LPS和ATP聯(lián)合刺激的RAW264.7小鼠巨噬細胞為炎癥細胞模型，從抗氧化應激的角度探究漢黃芩素下調ROS水平的作用機制，從而證明漢黃芩素能否通過抑制氧化應激下調ROS水平，進而抑制NF-κB核轉位，減少NLRP3活化，最終抑制炎癥反應的發(fā)生。

NO是活性氮簇(RNS)中的一種，是氧化應激的重要產物，其分泌水平能反映氧化應激的程度。氧化應激生成過多的ROS會引起細胞發(fā)生過氧化脂質反應，使細胞膜受到損傷，破壞細胞的功能和結構，而丙二醇(MDA)作為過氧化脂質產生的終末產物是公認的氧化應激標志物。本實驗結果發(fā)現，與對照組相比，模型組巨噬細胞NO、MDA的分泌水平顯著提高，而漢黃芩素干預組相對于模型組其細胞NO、MDA的分泌水平顯著降低，說明炎癥反應能伴隨氧化應激的發(fā)生，漢黃芩素能抑制氧化應激的發(fā)生。

Nrf2信號通路是細胞內氧化應激最重要的防御系統(tǒng)之一，當細胞發(fā)生氧化應激，Nrf2 信號通路首先被激活，Nrf2因子核轉位與抗氧化反應元件(anti-oxidant response element，ARE)上的DNA 基序(GCTGAGTCA)識別并結合，啟動抗氧化基因的轉錄，進而引發(fā)抗氧化物及相關酶類的大量表達，包括 NADPH、 NQO-1、 HO-1、 SOD、 GPx 和 GST 等，以抵御氧化應激引發(fā)的細胞損傷[7]。本實驗結果發(fā)現，與模型組相比，漢黃芩素干預組能顯著提高巨噬細胞內Nrf2 mRNA水平，促進Nrf2的核轉位，并能顯著上調抗氧化酶HO-1、SOD、GPx、CAT、NQO-1的mRNA水平，增加SOD活性，說明漢黃芩素可激活轉錄因子Nrf2進行核轉位，啟動抗氧化酶基因的轉錄，促進抗氧化酶蛋白的表達，從而發(fā)揮抗氧化作用。

綜上所述，LPS與ATP聯(lián)合刺激巨噬細胞能夠引起細胞的氧化應激，漢黃芩素可能通過激活Nrf2核轉位，啟動抗氧化酶基因的轉錄，誘導抗氧化酶的表達，清除過量的自由基，包括ROS、NO等，繼而抑制NF-κB的核轉位，減少NLRP3炎性體活化，從而發(fā)揮抑制炎癥反應的作用。本研究在一定程度上豐富了漢黃芩素抗炎抗氧化的作用機制，然而，其抗氧化的具體分子機制，如漢黃芩素是如何激活Nrf2核轉位的，對Nrf2-ARE信號通路上的關鍵信號分子有何影響仍有待進一步的研究。