一株植物乳桿菌的抑菌物質(zhì)性質(zhì)研究及抑菌條件優(yōu)化

姚沛琳 張凱迪 張新劍 韓盼盼

摘 要：以傳統(tǒng)發(fā)酵食品為篩選源，獲得50株乳酸菌，采用牛津杯方法篩選出一株抑菌性能較好的植物乳桿菌7-1，抑菌圈直徑為15.24mm，并且邊緣清晰.然后對植物乳桿菌7-1的抑菌物質(zhì)進行性質(zhì)研究和抑菌條件優(yōu)化，為天然生物防腐劑的研究提供參考.結(jié)果表明：該菌產(chǎn)生的細菌素，熱穩(wěn)定性良好，在酸性條件下保持較高抑菌活性，經(jīng)蛋白酶處理后抑菌活性幾乎喪失.采用單因素正交實驗對該菌產(chǎn)細菌素條件進行優(yōu)化，結(jié)果為：葡萄糖為碳源、培養(yǎng)基初始pH為7、培養(yǎng)時間為36h，抑菌圈直徑為19.6mm，邊緣清晰.這一結(jié)果為天然生物防腐劑的研究提供了一個新的菌株和參考，豐富了天然生物防腐劑研究文庫.

關(guān)鍵詞：乳酸菌;分離鑒定;抑菌;優(yōu)化

中圖分類號：TS202.3? 文獻標識碼：A? 文章編號：1673-260X（2020）01-0070-04

乳酸菌是一類可以通過利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏染色陽性細菌[1]，在自然界中分布十分廣泛[2].因其具有很好的益生作用，被廣泛應用于食品等與人類相關(guān)的產(chǎn)業(yè).

乳酸菌能夠抑制腐敗菌和病原菌的生長，從而達到防止腐敗變質(zhì)、延長保質(zhì)期的作用[3-4].因此，乳酸菌被公認為是最具有潛在開發(fā)價值的天然生物防腐劑[5-7].經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌在代謝過程中可產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì).其產(chǎn)生的酸性物質(zhì)可顯著降低環(huán)境的pH值和Eh（氧化還原電位）值，讓環(huán)境保持酸性，從而對致病菌產(chǎn)生拮抗作用，以達到抑菌目的[8].其產(chǎn)生的過氧化氫因為沒有過氧化氫酶的存在，從而可以在食物環(huán)境中不斷積累，進而對其他微生物產(chǎn)生抑制作用[9].在這些抑菌物質(zhì)中起主要作用的是一種被稱為細菌素的物質(zhì).細菌素是由某些細菌在代謝過程中經(jīng)核糖體合成的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白質(zhì)類物質(zhì)[10-11].因為細菌素具有強抑菌性且無抗藥性，完全彌補了傳統(tǒng)抗生素的缺陷，因此被認為是“抗生素的理想替代品”，得到人們的廣泛關(guān)注.

隨著人們對食品安全的關(guān)注以及抗生素的濫用產(chǎn)生的抗性，人們一直在努力尋找一種可以代替抗生素的安全有效的天然生物防腐劑.而乳酸菌細菌素作為抑菌物質(zhì)摻入食品系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛研究，且其在食品中的安全性和有效性已經(jīng)得到反復驗證[12-13].如果可以篩選出一株抑菌性能較好的乳酸菌，將對天然防腐劑的研發(fā)起到積極作用.因此，本實驗首先篩選對大腸桿菌抑菌作用較強的乳酸菌，然后研究其抑菌物質(zhì)性質(zhì)以及優(yōu)化抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生條件，為天然生物防腐劑的研究提供一定的理論參考.

1 材料方法

1.1 實驗菌株

乳酸菌來源：從皖南、皖北等地區(qū)自家腌制菜中篩選得到.

大腸桿菌ATCC25922，由學院實驗室提供.

1.2 設(shè)備及試劑

主要設(shè)備：SHP—250型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學儀器有限公司）;1-15PK離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）;722型可見光分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）;phs-25型PH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）.

主要試劑：木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、硫酸鎂、硫酸錳、瓊脂、乙醇、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、乳糖、蔗糖、低聚果糖、低聚半乳糖等化學試劑，均購置于國藥集團.

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌的分離與純化

從皖南、皖北等地區(qū)獲得的家庭自制腌制菜的汁液中分離乳酸菌菌株.無菌操作取樣品1mL，用無菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋，選擇合適的梯度，涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)培養(yǎng)48h.挑取典型菌落，多次劃線后得到純菌株.將得到的純菌株進行革蘭氏染色、菌落形態(tài)觀察、接觸酶實驗等系列實驗，確定為乳酸菌后用甘油保藏在-80℃的冰箱里[14].

1.3.2 體外抑菌實驗

采用牛津杯瓊脂擴散法[15].將過夜培養(yǎng)的乳酸菌菌液接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)20h，再在4℃，12000rpm/min下離心20min，過濾除菌，得到乳酸菌無細胞發(fā)酵上清液.將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)12h，調(diào)節(jié)OD至0.3，菌落數(shù)約在1×108cfu/mL左右.取大腸桿菌菌懸液1mL，與LB固體培養(yǎng)基混合凝固后，將滅過菌的牛津杯放置在培養(yǎng)皿上.再往牛津杯里添加200μL乳酸菌無細胞發(fā)酵上清液，將此平板正面靜置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后測量抑菌圈大小.

1.3.3 乳酸菌抑菌物質(zhì)的性質(zhì)研究

1.3.3.1 抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性試驗

將過夜培養(yǎng)的乳酸菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20h，在4℃和12000rpm/min條件下離心20min，過濾除菌，得到乳酸菌無細胞發(fā)酵上清液.將此上清液分別在37℃、60℃、80℃、90℃、100℃的水浴鍋中處理30min，對照組置于4℃冰箱保存30min，檢測其抑菌活性[16].

1.3.3.2 抑菌物質(zhì)的pH穩(wěn)定性試驗

取等量乳酸菌發(fā)酵上清液6份，調(diào)節(jié)pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，過濾除菌，然后檢測其抑菌活性[16].

1.3.3.3 抑菌物質(zhì)的蛋白酶敏感性試驗

取等量乳酸菌上清液2份，調(diào)節(jié)pH值分別至兩種酶液的最適pH（胰蛋白酶為7.4、木瓜蛋白酶為6.0），對照組為原始菌液，再分別加入胰蛋白酶和木瓜蛋白酶處理60min（蛋白酶濃度為1.0mg/mL），調(diào)pH為初始值，過濾除菌，然后檢測其抑菌活性[16].

1.3.4 乳酸菌抑菌條件優(yōu)化的單因素試驗

1.3.4.1 不同培養(yǎng)時間對抑菌能力的影響

培養(yǎng)基的初始pH為6.2，碳源為葡萄糖，將接好菌的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)12h、18h、24h、36h、48h.通過體外抑菌實驗測定不同培養(yǎng)時間抑菌圈的大小，以此來確定最佳培養(yǎng)時間.

1.3.4.2 不同碳源對抑菌能力的影響

培養(yǎng)基的初始pH為6.2，培養(yǎng)時間為24h.以葡萄糖、乳糖、蔗糖、低聚果糖、低聚半乳糖分別作為培養(yǎng)基中的唯一碳源進行培養(yǎng).同樣根據(jù)抑菌圈直徑大小來確定最佳碳源[17-18].

1.3.4.3 培養(yǎng)基初始pH對抑菌能力的影響

培養(yǎng)時間為24h，碳源為葡萄糖，取等量的MRS液體培養(yǎng)基5份，初始pH值分別調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，檢測抑菌活性，根據(jù)抑菌圈大小選定最合適的初始pH.

1.3.5 乳酸菌抑菌條件優(yōu)化的正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，每個因素選擇三個較優(yōu)水平，以抑菌圈大小為指標，進行L9（34）正交實驗，最后對實驗結(jié)果進行整理分析從而得到最佳的抑菌條件.

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌體外抑菌實驗結(jié)果

采用純培養(yǎng)方法從不同來源的腌制菜中分離出50株乳酸菌，以大腸桿菌為指示菌，對其進行體外抑菌實驗，實驗結(jié)果見表1.由表1可知，大多數(shù)乳酸菌對大腸桿菌都有不同程度的抑制能力.經(jīng)過綜合評定選擇菌株7-1為研究對象，經(jīng)細菌16S rDNA鑒定為植物乳桿菌.

2.2 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的性質(zhì)研究結(jié)果

2.2.1 抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性

乳酸菌抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性結(jié)果如圖1所示.由圖1可知，乳酸菌抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性在研究范圍內(nèi)是比較好的.隨著溫度的增加，出現(xiàn)先緩慢增加后緩慢降低的趨勢.植物乳桿菌7-1可以耐受100℃的高溫，經(jīng)過高溫處理后，抑菌活性僅降低17.24%.結(jié)果表明，該菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)中起主要作用的不是大分子蛋白質(zhì).

2.2.2 pH對抑菌效果的影響

pH對植物乳桿菌7-1抑菌效果的影響結(jié)果見圖2.由圖2可知，植物乳桿菌7-1的抑菌效果隨pH值的增大呈現(xiàn)先增后顯著降低的趨勢.當pH為4時抑菌活性最大;當pH在4-6時，抑菌活性顯著下降;當pH在6-7時，抑菌活性劇烈下降直至失去活性.結(jié)果表明溶液的酸堿性對抑菌物質(zhì)的抑菌活性影響很大，在酸性條件下抑菌活性強，在中性及堿性條件下幾乎失去活性，符合細菌素的性質(zhì).

2.2.3 抑菌物質(zhì)的蛋白酶穩(wěn)定性

植物乳桿菌7-1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的蛋白酶穩(wěn)定性結(jié)果如圖3所示.結(jié)果表明，經(jīng)過蛋白酶酶解之后，此抑菌物質(zhì)的抑菌活性劇烈下降近乎失活，由此結(jié)果可以推斷植物乳桿菌7-1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)主要為多肽類物質(zhì)，而細菌素正符合這一性質(zhì)[19]，故可以進一步判定植物乳桿菌7-1發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)為細菌素，可以被蛋白酶降解，具有環(huán)境友好型特點.

綜合圖1、圖2和圖3結(jié)果可知，植物乳桿菌7-1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)初步可以判定為多肽類細菌素，具有良好的熱穩(wěn)定性，在酸性條件下抑菌活性較大，具有環(huán)境友好型等特點.

2.3 不同培養(yǎng)時間對抑菌效果的影響

抑菌物質(zhì)大多數(shù)是微生物的次級代謝產(chǎn)物，不同的培養(yǎng)時間會對抑菌物質(zhì)的產(chǎn)量產(chǎn)生影響從而影響抑菌效果.因此，為了探究植物乳桿菌7-1產(chǎn)抑菌物質(zhì)的最佳培養(yǎng)時間，設(shè)置了培養(yǎng)時間梯度，結(jié)果如圖4所示.抑菌效果隨培養(yǎng)時間的延長先增大后降低，當培養(yǎng)時間為24h時，抑菌效果最好.微生物的次級代謝產(chǎn)物一般在穩(wěn)定期會積累，這個結(jié)果說明植物乳桿菌7-1在24h時結(jié)束穩(wěn)定期進入衰亡期，24h后抑菌效果下降可能是因為衰亡期的微生物與抑菌物質(zhì)相互作用，影響了其活性.

2.4 不同碳源對抑菌效果的影響

在微生物的生長繁殖過程中，碳源作為重要的營養(yǎng)要素之一必不可少.因此，為了探究植物乳桿菌7-1的生長狀態(tài)達到最佳時的碳源，研究了不同碳源對抑菌效果的影響，結(jié)果如圖5所示，不同的碳源條件下產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的抑菌性能各不相同，其中最好的碳源是低聚果糖，葡萄糖次之，低聚半乳糖最差，結(jié)果表明植物乳桿菌7-1可以更好地利用低聚果糖.

2.5 不同初始pH對抑菌效果的影響

培養(yǎng)基的酸堿性與微生物的生長繁殖有很大的關(guān)系，因此，為了探究植物乳桿菌7-1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的抑菌活性最大時的培養(yǎng)基的初始pH，設(shè)置了不同初始pH，結(jié)果如圖6所示.結(jié)果表明，植物乳桿菌7-1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的抑菌活性隨著初始pH的遞增呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當pH為7時抑菌活性最大.當pH在6-7范圍內(nèi)時抑菌性變化不明顯，而當培養(yǎng)基初始pH呈堿性時抑菌活性開始顯著降低.通過這一結(jié)果可以進一步推斷植物乳桿菌7-1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)應該是細菌素，由于培養(yǎng)基的堿性條件抑制或影響了細菌素的活性從而導致抑菌活性降低.

2.6 抑菌條件正交優(yōu)化結(jié)果

以A（培養(yǎng)時間）、B（不同碳源）、C（初始pH）3因素，進行L9（34）正交實驗，通過抑菌圈大小為評價指標，對抑菌條件進行優(yōu)化從而得到最佳的抑菌條件.其正交因素水平表如表2所示，結(jié)果分析見表3.

由表3可知，影響植物乳桿菌7-1抑菌活性的三個因素的主次順序依次為A（培養(yǎng)時間）>B（不同碳源）>C（初始pH），即培養(yǎng)時間對抑菌活性影響最大，其次為不同碳源的培養(yǎng)基，影響最小的是培養(yǎng)基的初始pH.根據(jù)極差分析可知，得到最大的抑菌活性對應的最優(yōu)抑菌條件的組合為A3B1C3，即培養(yǎng)時間為36h、碳源為葡萄糖、初始pH為7.通過結(jié)果可知在這種組合下植物乳桿菌7-1的抑菌圈大小為19.6mm.

3 結(jié)論

本研究首先從不同來源的腌制菜中分離純化出50株乳酸菌，然后根據(jù)體外抑菌實驗從中篩選出一株抑菌效果最佳的植物乳桿菌7-1.對植物乳桿菌7-1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)其可以耐受100℃的高溫，在酸性條件下抑菌活性較大，可以被蛋白酶降解失去抑菌活性，初步判斷該菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)主要為細菌素.抑菌條件優(yōu)化的結(jié)果表明植物乳桿菌7-1的培養(yǎng)時間為36h、碳源為葡萄糖、培養(yǎng)基初始pH為7時可以得到最佳的抑菌活性.通過對植物乳桿菌7-1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的性質(zhì)進行研究以及抑菌條件優(yōu)化，豐富了天然生物防腐劑研究文庫，為今后天然生物防腐劑的研究提供了一份參考.

參考文獻：

〔1〕金世琳.乳酸菌的科學與技術(shù)[J].中國乳品工業(yè)，1998，26（2）：14-15.

〔2〕李帥.乳酸菌的益生功能及其在畜牧生產(chǎn)中的應用[J].農(nóng)村經(jīng)濟與科技，2017，28（4）：36.

〔3〕姚沛琳，王劍，等.對大腸桿菌生物膜具有高抑制能力的乳酸菌的篩選[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2019，45（06）：59-64.

〔4〕徐炳政，張東杰，王穎，等.乳酸菌細菌素應用研究進展[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2015，27（01）：60-63.

〔5〕呂利軍，季海峰，楊英，等.乳酸菌微膠囊及其合生素對仔豬生產(chǎn)性能和免疫力的影響[J].畜牧與獸醫(yī)，2009，41（2）：35-37.

〔6〕朱小喬，劉通訊.極具潛力的天然防腐劑-Nisin[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，27（4）：66-69.

〔7〕張淑敏，還連棟.羊毛硫細菌素及其應用[J].微生物學通報，1999，26（6）：430-433.

〔8〕BAIRD PARKER A C. Organic Acids in Microbial Ecology of Foods[M]. London： Academic Press，1980： 289-293.

〔9〕陳靜，陳志宏，張汆.蜂王漿酶解產(chǎn)物穩(wěn)定性及酶解動力學研究[J].食品科技，2019，44（02）：285-289.

〔10〕孫杰，姜杰，等.一株產(chǎn)細菌素乳酸菌的篩選及其細菌素特性研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2018，44（09）：48-52.

〔11〕KAUR G， MALIK R K，MISHRA S K，et al. Nisin and Class IIa bacteriocin resistance among Listeria and other foodborne pathogens and spoilage bacteria[J]. Microbial Drug Resistance，2011，17（2）：197-205.

〔12〕Dobson A，Cotter P D，Ross R P，et al. Production： a probiotic trait[J]. Applied and Environmental Microbiology，2012，78（1）：1-6.

〔13〕Blanco Massani M，Morando P J，Vignolo G M，et al. Characterization of a multilayer film activated with lactobacillus curvatus CRL705 bacteriocins[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2012，92（6）：1318-1323.

〔14〕楊穎，陳衛(wèi)，田豐偉等.產(chǎn)抑菌物質(zhì)乳桿菌的篩選及性質(zhì)的研究[J].工業(yè)微生物，2006，36（03）：13-17.

〔15〕O.TOOLE G A，PRATTLA，WATNICK P I，et al.Genetic approaches to study of biofilms[J]. Methods Enzymol，1999，（310）：91-109.

〔16〕薩如拉.廣譜抗菌活性乳酸桿菌的生物學特性及其應用研究[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，2018.

〔17〕楊雪鵬，汪芳芳，閆記，等.降解類胡蘿卜素菌株的培養(yǎng)基優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2014，49（3）：402-408.

〔18〕何寧，倪灣，陳洋，等.一株乳酸明串珠菌的鑒定及抑菌培養(yǎng)基配方優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2018，39（22）：133-137.

〔19〕敖靈，馮敏，劉書亮，等.肉源產(chǎn)廣譜細菌素乳酸菌的篩選及其細菌素特性研究[J].中國釀造，2008，186（9）：67-70.