植物內(nèi)生芽孢桿菌的研究進(jìn)展

龔國利， 王 亮， 王旭陽， 張 帝， 吳 咪， 田 露

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 西安 710021)

芽孢桿菌科是一類好氧性產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，其生理特征豐富多樣，分布廣泛，極易分離培養(yǎng)，是植物內(nèi)生菌里研究最多以及應(yīng)用價值廣泛的一大類細(xì)菌。芽孢桿菌作為植物微生物內(nèi)生態(tài)的組成部分，占據(jù)了有利的生態(tài)位并廣泛地定殖于植物體內(nèi)。其為植物提供了相應(yīng)的益處，包括促進(jìn)植物生長，在植物病原微生物、昆蟲和線蟲入侵過程產(chǎn)生拮抗，以及與植物聯(lián)合修復(fù)環(huán)境，提高宿主植物抗逆性等。多數(shù)內(nèi)生芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物還具有多種生理活性，是應(yīng)用前景廣泛的微生物資源寶庫。其具有廣譜抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力，可在農(nóng)作物生防、天然藥物研發(fā)、環(huán)境修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用。因此，對植物內(nèi)生芽孢桿菌的研究具有重要的理論意義及應(yīng)用價值。本文對近年來植物內(nèi)生芽孢桿菌的多樣性、對宿主植物的功能作用、應(yīng)用及總結(jié)展望等方面進(jìn)行綜述。

1 植物內(nèi)生芽孢桿菌的多樣性

植物體內(nèi)的芽孢桿菌資源極其豐富，廣泛分布于植物的根莖花葉果實和種子，并且宿主植物和芽孢桿菌的種類繁多，是植物內(nèi)生芽孢桿菌物種多樣性的表現(xiàn)。其中枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)為其中的優(yōu)勢種。芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paemibacillus)和短芽孢桿菌屬(Breuibacillus)等菌屬的相關(guān)報道較多。葛慈斌等[1]從武夷山自然保護(hù)區(qū)采集了9種地衣標(biāo)本，共分離出34種內(nèi)生菌，表明了地衣中芽孢桿菌的物質(zhì)多樣性；其中類芽孢桿菌和芽孢桿菌作為優(yōu)勢屬，分別占總分離細(xì)菌的41.2%和35.3%。

目前芽孢桿菌多樣性的研究采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法，分離得到純培養(yǎng)物后通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段鑒定種屬。Sharma等[2]通過傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法從藏紅花植物中分離出54株內(nèi)生細(xì)菌，利用分子和系統(tǒng)發(fā)育分析將其分為11個不同的類群，其中芽孢桿菌屬有地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、胡米芽孢桿菌(Bacillushumi)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)和沙福芽孢桿菌(Bacillussafensis)等。由于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法會喪失不可培養(yǎng)的細(xì)菌，且內(nèi)生微生物群的復(fù)雜性會產(chǎn)生不準(zhǔn)確的生態(tài)結(jié)果。而非培養(yǎng)法具有可克服傳統(tǒng)培養(yǎng)法的諸多缺點(diǎn)，因此，近些年來發(fā)展迅速。Goulart等[3]使用Illumina測序法對西番蓮相關(guān)的內(nèi)生細(xì)菌群落進(jìn)行了統(tǒng)計，在屬水平上芽孢桿菌的數(shù)量最多，約占12.9%。培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法都具有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，這兩種方法的組合使用可以提供更好的策略來研究芽孢桿菌的多樣性。

2 植物內(nèi)生芽孢桿菌對宿主植物的作用

2.1 促生長

大量文獻(xiàn)報道，芽孢桿菌的定殖可以促進(jìn)植物生長。多數(shù)芽孢桿菌可以通過產(chǎn)生或誘導(dǎo)活性代謝產(chǎn)物和促進(jìn)無機(jī)物吸收來調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，包括促進(jìn)種子萌發(fā)、提高幼苗存活率以及根莖葉的生物量等。Zhao等[4]從藥用植物忍冬中分離到被鑒定為芽孢桿菌屬的6株內(nèi)生菌菌株均表現(xiàn)出較強(qiáng)的促進(jìn)小麥生長的能力，小麥幼苗的株高、根長、鮮重、干重和葉綠素含量均顯著增加。Jayakumar等[5]報道了從姜黃(Curcumalonga)根莖中分離的內(nèi)生芽孢桿菌Fc11具有較強(qiáng)促進(jìn)植物生長的作用。

內(nèi)生芽孢桿菌促進(jìn)植物生長可以通過多種機(jī)制介導(dǎo)。一方面，芽孢桿菌可以通過直接產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)和細(xì)胞激動素(KT)等生長激素促進(jìn)植物生長。Soares等[6]從常春藤中分離出的解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)C6c，研究發(fā)現(xiàn)C6c可以通過分泌IAA促進(jìn)常春藤的生長。此外芽孢桿菌還可以誘導(dǎo)宿主植物自身分泌相應(yīng)激素，增強(qiáng)系統(tǒng)免疫性來促進(jìn)植物生長。Raheem等[7]從水稻種子中分離出的解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)RWL-1，其自身可分泌GA，同時也可以誘導(dǎo)水稻內(nèi)源性激素的水平，結(jié)果表明RWL-1在水稻根部定殖并改善植株生長狀況，具有替代化肥，提高作物產(chǎn)量的潛力。

另一方面,芽孢桿菌具有溶解磷酸鹽和生物固定氮等作用，宿主植物無需產(chǎn)生特化結(jié)構(gòu)就可增加氮和磷等營養(yǎng)元素的吸收。Wang等[8]報道了在鹽脅迫條件下彎曲芽孢桿菌(Bacillusflexus)KLBMP 4941表現(xiàn)出固氮、產(chǎn)生鐵載體、氨和促進(jìn)寄主生長的特性，并在其基因組中發(fā)現(xiàn)了與固氮、鐵載體、亞精胺和丙酮合成等植物生長促進(jìn)(PGP)相關(guān)的基因。Ribeiro等[9]研究了4株內(nèi)生芽孢桿菌B1920、B1923、B2084和B2088在體外溶解磷酸鐵(Fe-P)，產(chǎn)生鐵載體和IAA的能力。結(jié)果表明所有菌株均溶解Fe-P，其中B1923、B2084和B2088在色氨酸存在下可以產(chǎn)羧酸鹽型鐵載體和高水平的IAA，未添加磷的條件下植株的地上和地下干重，以及根中N、P、K含量均上升。

此外，內(nèi)生芽孢桿菌不僅可以通過產(chǎn)生不依賴生長素、乙烯或茉莉酸信號通路的揮發(fā)性有機(jī)化合物[10]，還可以通過改變酶的活性來促進(jìn)植物生長，如植物體內(nèi)SOD、POD和CAT酶[11]等。

2.2 抗病原菌

內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)長期穩(wěn)定定殖，通過占據(jù)有利生態(tài)位與病原菌競爭營養(yǎng)及空間，除此之外還可以產(chǎn)生抗菌物質(zhì)及水解酶類起到拮抗病原菌作用。內(nèi)生芽孢桿菌具有廣泛的抗菌作用，其抗菌機(jī)制包括競爭作用、拮抗作用、誘導(dǎo)植物抗性和多種作用混合等。由于近年來從內(nèi)生芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了大量具有抗菌活性的天然產(chǎn)物，直接拮抗機(jī)制在文獻(xiàn)中報道也較為廣泛。大量文獻(xiàn)報道了內(nèi)生芽孢桿菌分泌的一系列抗菌物質(zhì)，包括非核糖體肽合成酶系(NRPSs)合成的脂肽及多肽類物質(zhì)；核糖體途徑合成的細(xì)菌素、類細(xì)菌素、水解酶類及其他活性蛋白；還有聚酮合酶途徑(PKS)合成的聚酮類化合物及其他揮發(fā)性有機(jī)化合物等。

其中脂肽結(jié)構(gòu)多樣，功能多元，具有廣泛的抑菌譜及較好的抑菌效果。包括伊枯草菌素(iturins)、桿菌霉素(bacillomycin)、豐原素(fengycins)和表面活性素(surfactin)等家族。Imen等[12]分離出的解淀桿菌芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)CEIZ-11具有廣譜抗植物病原真菌活性，通過LC-MS分析檢測到3個脂肽家族，包括3個iturin A(A2，A3-5和A6)同源物，一個fengycin A(C16)和一個surfactin(C12)。Gond等[13]從不同品種玉米種子分離到的芽孢桿菌中檢測出抗真菌iturin A，fengycin和bacillomycin的存在，并發(fā)現(xiàn)其可以誘導(dǎo)宿主植物中防御基因的表達(dá)。

內(nèi)生芽孢桿菌還可以通過產(chǎn)生或誘導(dǎo)宿主植物產(chǎn)生蛋白多肽類抗菌物質(zhì)，如細(xì)菌素、水解酶類和其他抗菌蛋白等抑制病原體。病原真菌的細(xì)胞壁組分中含有幾丁質(zhì)和β-1,3-葡聚糖，幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶等物質(zhì)具有降解病原真菌細(xì)胞壁的能力，從而抑制病原真菌生長及相應(yīng)疾病的發(fā)生。Seo等[14]發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌GS1產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶使真菌RhizoctoniasolaniKACC40111的菌絲發(fā)生降解，從而顯著抑制了黃瓜幼苗猝倒的發(fā)生率。Habbu等[15]從藥用植物黃姜(Dioscoreazingiberensis)中分離的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)SWB8分泌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有廣譜的抑菌活性。本實驗室分離的短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)可產(chǎn)生蛋白類抑菌物質(zhì)，耐高溫、耐堿性物質(zhì)、對胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感，對革蘭氏陰性菌及陽性菌均有良好的抑制效果[16-17]。

除此之外，內(nèi)生芽孢桿菌還可以產(chǎn)具有抗菌作用的揮發(fā)性有機(jī)化合物。Estibaliz等[18]從蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)中分離到的雙酮哌嗪類化合物，具有抗真菌活性。Vibhuti等[19]從黑胡椒根中分離出的巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)BP17，結(jié)果表明該菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性的吡嗪類化學(xué)物對辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、玉米穗腐病菌(Gibberellamoniliformis)和大葉黃楊炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)等植物病原菌具有拮抗作用。

2.3 抗蟲害

植物寄生線蟲是導(dǎo)致植物病害的病原體，主要包括大豆胞囊線蟲、根結(jié)線蟲和松材線蟲等。由于化學(xué)殺蟲劑存在高毒性和高殘留等弊端，隨著民眾環(huán)保安全意識的提升，尋求一種安全高效以及對環(huán)境無污染的新型殺蟲劑成了共識，而使用微生物及其天然產(chǎn)物開發(fā)生物安全型殺蟲劑是具有理論基礎(chǔ)可實現(xiàn)性的一條途徑。

近年來從土壤中分離得到的具有殺蟲作用的細(xì)菌數(shù)量逐漸下降，植物內(nèi)生菌這一新型微生物農(nóng)藥資源的開發(fā)已成為新的趨勢。內(nèi)生菌長期定殖于植物體內(nèi)，已經(jīng)進(jìn)化為對宿主植物基本無害的物種，普遍具有環(huán)境安全性。其中芽孢桿菌因具有長期穩(wěn)定定殖的能力，且有文獻(xiàn)報道其部分菌株具有優(yōu)良的殺蟲特性而受到了一定關(guān)注。Rashid等[20]報道了擬南芥幼苗在內(nèi)生貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)YC7010處理植物根系后，可誘導(dǎo)植株對桃蚜(Myzuspersicae)產(chǎn)生抗性。Hu等[21]從植物組織中分離出的內(nèi)生蠟狀芽孢桿菌BCM2，它能穩(wěn)定定殖于番茄并具有殺南方根結(jié)線蟲第二期幼體(J2)的活性。并且該菌株具有促進(jìn)植物生長，成功占領(lǐng)生態(tài)位并具有誘導(dǎo)產(chǎn)生南方根結(jié)線蟲J2驅(qū)避劑的潛力。陳澤斌等[22]篩選出5株具有明顯殺全齒復(fù)活線蟲(Panagrellusredivivus)的細(xì)菌，其中4株為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)，1株為蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)。這5株細(xì)菌的發(fā)酵液稀釋5倍處理線蟲12 h后，線蟲的死亡率均達(dá)90%以上；24 h后，死亡線蟲蟲體發(fā)生消解或滲漏。

2.4 抗逆境

植物生長發(fā)育過程中，面臨的逆境分為生物脅迫和非生物脅迫兩種。內(nèi)生芽孢桿菌面臨的生物脅迫為病原真菌及寄生線蟲，非生物脅迫包括高溫、干旱、鹽堿和重金屬污染。內(nèi)生芽孢桿菌通過提高其自身及宿主的耐受性應(yīng)對非生物和生物脅迫，相關(guān)報道表明從生長在逆境的植物分離出的許多內(nèi)生芽孢桿菌都具有抗逆或提高宿主抗逆性的能力。

隨著干旱地區(qū)、鹽堿地及重金屬污染土壤等地區(qū)面積不斷擴(kuò)大，使得處于逆境下的植物生長及農(nóng)作物增產(chǎn)愈發(fā)困難。因此，研究植物內(nèi)生生態(tài)中穩(wěn)定定殖的芽孢桿菌為提高宿主植物應(yīng)對非生物脅迫能力和農(nóng)作物增產(chǎn)方面提供了新的研究思路。龐海東等[23]分離到 8 株具有促生作用的芽孢桿菌，這些芽孢桿菌都具有產(chǎn)鐵載體、IAA、多糖和淀粉酶活性，且具有抗Cd、Pb、Cu和Zn多種重金屬的作用，其中巨大芽孢桿菌(B.megaterium)P24和P37使得香蒲的地上和地下部干重顯著增加40.0%～46.4%，表明在重金屬污染條件下耐重金屬芽孢桿菌能夠促進(jìn)香蒲生長。Gagné-Bourque等[24]研究了在干旱脅迫下接種枯草芽孢桿菌(B.subtilis)B26菌株后對毛茛屬植物(PhleumpratenseL.)的生長、含水量、光合作用和代謝的影響。結(jié)果表明枯草芽孢桿菌B26可以通過改變根和芽中滲透物的積累來改善干旱脅迫下植株的生長。Chinnaswamy等[25]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生巨大芽孢桿菌(B.megaterium)NMp082在體外產(chǎn)生的IAA和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸酯(ACC)脫氨酶，可以促進(jìn)苜蓿和擬南芥生長且誘導(dǎo)植物的鹽脅迫耐受性增強(qiáng)。

3 植物內(nèi)生芽孢桿菌應(yīng)用

3.1 農(nóng)業(yè)生防

環(huán)境條件、農(nóng)作物的品種品質(zhì)和病蟲害等都會對作物產(chǎn)量有一定的影響，因此如何獲得穩(wěn)定高產(chǎn)的農(nóng)作物是目前農(nóng)業(yè)面臨的一個難題。芽孢桿菌的特殊性是其可以產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孢，具有抗逆性強(qiáng)和穩(wěn)定定殖的優(yōu)勢。由其衍生的微生物農(nóng)藥與傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥相比，具有對人畜安全無毒害、對環(huán)境無污染和對病原菌具有廣譜抑制作用且不易產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)點(diǎn)，同時具有促生、抗病蟲害和抗逆等作用。因此，芽孢桿菌衍生的微生物農(nóng)藥有望成為化學(xué)農(nóng)藥的替代品，為穩(wěn)步提高作物產(chǎn)量提供了可行思路。蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)、蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)是用于農(nóng)業(yè)的研究最多的芽孢桿菌物種[26]。

Ansary等[27]評估了解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)BDR-2和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)BRtL-2兩株內(nèi)生菌，發(fā)現(xiàn)兩株菌對植物病原真菌核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)均具有拮抗能力，并且可以促進(jìn)黃瓜和水稻幼苗的生長。Wang等[28]報道了一株具有防治花生青枯病潛力的解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)BZ6-1，其抗菌物質(zhì)為surfactin和fengycin A等脂肽同系物。采用盆栽試驗來檢驗BZ6-1對花生青枯病的控制效率，每株幼苗添加15 mL(108cfu/mL)培養(yǎng)液，發(fā)病率從對照的84.5%顯著下降到12.1%。

有文獻(xiàn)報道內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)CC09是應(yīng)用潛力巨大的一株生防菌，其通過產(chǎn)生Iturin等環(huán)脂肽類物質(zhì)拮抗病原菌，我國科研人員據(jù)此開發(fā)了兩種防治小麥白粉病的解淀粉芽孢桿菌制劑，即以細(xì)胞為主體的解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑(≥100億芽孢/g)[29]和抗真菌成分Iturin A為主體的15%水劑[30]。

3.2 醫(yī)藥

植物內(nèi)生菌是天然藥物的重要來源，在其與宿主長期共存中，產(chǎn)生了一系列有活性的代謝產(chǎn)物，如抗菌活性成分、抗病毒物質(zhì)和抗腫瘤物質(zhì)等。芽孢桿菌在醫(yī)藥及基因工程領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用前景，不僅可以生產(chǎn)具有多種功能的活性物質(zhì)，還擁有作為優(yōu)良基因工程菌株的潛力，為開發(fā)新型藥物提供了新的篩選來源。

近年來隨著抗生素濫用，耐藥菌株甚至超級細(xì)菌的出現(xiàn)，更多研究者寄希望于從自然界尋找結(jié)構(gòu)新穎、高效低毒和不易產(chǎn)生耐藥性的抗菌活性物質(zhì)。Moustafa 等[31]分離到的芽孢桿菌菌株SA產(chǎn)生的抗菌蛋白，對革蘭氏陽性菌具有廣譜的抑菌活性，特別是可以抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)。Akinsanya等[32]從蘆薈植物中分離的芽孢桿菌ALR-2產(chǎn)生的活性物質(zhì)SF5(5 mg/mL)，能有效抑制蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)和金黃色葡萄球菌，抑菌圈直徑分別為(28.6±0.5) mm和(30.3±0.5) mm，其效果顯著高于標(biāo)準(zhǔn)抗生素環(huán)丙沙星(5 μg,分別為23.6 mm±0.5 mm和18.6 mm±0.5 mm)和卡那霉素(30 μg,分別為20.3 mm±0.5 mm和13.6 mm±0.5 mm)。此外將抗菌物質(zhì)與金屬材料形成復(fù)合抗菌材料也是一個新興的復(fù)合領(lǐng)域，有報道將內(nèi)生芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌脂肽用于合成銀納米粒子(Ag-NPs)[33-34]，其不僅具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性，還對多種致病菌具有敏感性。

此外,隨著人口老齡化的日益嚴(yán)重，腫瘤患者逐漸增多。直接從藥用植物中提取抗腫瘤物質(zhì)是一直以來最為常見的抗腫瘤藥物來源，但存在植物中的抗腫瘤物質(zhì)含量少和提取率低的問題。而采用化學(xué)方法合成藥物，同樣存在毒性大的弊端。因此，開展植物內(nèi)生菌抗腫瘤藥物研究就顯得尤為重要，同時對天然藥物的開發(fā)及藥用植物的保護(hù)有非常重大的意義。Nenkata-chalam等[35]從內(nèi)生芽孢桿菌JUPR15中提取的生物活性成分B5，該化合物由9-十八碳烯酸、噻吩衍生物和二硝基苯甲酰胺衍生物組成。用B5處理HeLa、HepG2和MCF-7等癌細(xì)胞后癌細(xì)胞的存活率顯著降低，IC50值由6.5變?yōu)?3.2 μg/mL，且對正常外周淋巴細(xì)胞無毒。Zhao等[36]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生枯草芽孢桿菌(B.subtilis)產(chǎn)生的Iturin A類脂肽可誘導(dǎo)人異質(zhì)上皮性結(jié)直腸腺癌(Caco 2)細(xì)胞發(fā)生胞吞和凋亡。以上報道表明，植物內(nèi)生芽孢桿菌可以為抗癌治療提供具有高治療價值的前景和可再現(xiàn)的天然產(chǎn)物來源。

3.3 環(huán)境修復(fù)

傳統(tǒng)的環(huán)境修復(fù)方法價格昂貴，難以處理大規(guī)模污染，且對生態(tài)系統(tǒng)并不友好。隨著內(nèi)生菌研究的發(fā)展，內(nèi)生菌及植物-內(nèi)生菌聯(lián)合修復(fù)環(huán)境逐漸顯露出治理環(huán)境的潛力。內(nèi)生芽孢桿菌在修復(fù)重金屬污染土壤、降解殘留農(nóng)藥和有害化合物、凈化有害氣體及污水等方面都有報道。

內(nèi)生芽孢桿菌具有耐受、吸附和解毒重金屬的能力，可通過促進(jìn)宿主植物生長，從而提高植物耐受能力增加植物對重金屬的吸收能力。解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)P29能使香蒲的Cd含量和總吸收量顯著增加31.1%和63.5%；Cd去除率最高可達(dá)79.5%。該菌株促進(jìn)香蒲生長從而增加香蒲Cd總吸收量，達(dá)到去除水中Cd污染的作用，具有應(yīng)用于水體重金屬污染修復(fù)的潛力[23]。

芽孢桿菌的降解能力為去除土壤及農(nóng)作物中的有害物質(zhì)提供了生物及環(huán)境友好型處理方法，這種天然方法不會造成二次污染，且為農(nóng)藥殘留、化學(xué)殘留的處理提供了新的手段。Patel和Kumar[37]分離的內(nèi)生芽孢桿菌CP1R具有降解2,4-二氯苯酚(2,4- dcp)的能力。宋勝男等[38]研究發(fā)現(xiàn)人參內(nèi)生多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)對田間栽培人參根中5種農(nóng)藥的降解率為66.07%、46.24%、21.05%、72.40%和54.21%。Feng等[39]分離到一種新的能降解難降解有害有機(jī)化合物鄰苯二甲酸酯(PAEs)的內(nèi)生芽孢桿菌YJB3，該菌株可以將PAEs分解為鄰苯二甲酸單丁酯(MBP)和鄰苯二甲酸(PA)，直至被完全降解。

Khaksar等[40]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)ERBP通過調(diào)控IAA和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶活性減輕甲醛應(yīng)激介導(dǎo)的影響，從而在甲醛脅迫下刺激蝶豆(ClitoriaTernatea)種子萌發(fā)和幼苗生長。這種有利的內(nèi)生菌-植物聯(lián)盟在甲醛脅迫下對植物保護(hù)和植物修復(fù)具有重要價值。

4 總結(jié)與展望

植物內(nèi)生芽孢桿菌作為近年來文獻(xiàn)報道較多且未完全開發(fā)的微生物資源，在植物中廣泛存在，具有生成抗逆芽孢增加定殖存活率的優(yōu)勢，無論在農(nóng)業(yè)生防、醫(yī)藥還是環(huán)境修復(fù)方面都具有應(yīng)用潛力。

4.1 植物內(nèi)生芽孢桿菌多樣性的研究方法

在植物內(nèi)生芽孢桿菌多樣性的研究中，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法是研究芽孢桿菌多樣性的重要基礎(chǔ)，是豐富內(nèi)生芽孢桿菌資源，研究活細(xì)菌進(jìn)而研究生理學(xué)特性不可替代的方法。但這種傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法無法分離不可培養(yǎng)的細(xì)菌，并且在菌株脫離內(nèi)生態(tài)環(huán)境后會出現(xiàn)菌種退化或喪失特有生理活性的問題。隨著DNA技術(shù)的快速發(fā)展，包括基于PCR的DNA分析、定量PCR(qPCR)、熒光原位雜交(FISH)、DNA測序和DNA微陣列等更多革命性技術(shù)被應(yīng)用。這些技術(shù)可以在不培養(yǎng)細(xì)菌的情況下，對微生物群的細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性和定量的分析。該方法可以不依賴于培養(yǎng)技術(shù)，但這種非培養(yǎng)法在較精細(xì)的分類學(xué)水平上缺乏細(xì)菌鑒定的精確度。當(dāng)前，內(nèi)生芽孢桿菌多樣性的研究大多局限于通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法和手段鑒定細(xì)菌種屬，其主要側(cè)重于對細(xì)菌的生理特性及活性的研究。在未來的研究中，通過高通量、高效率和快速計算的非培養(yǎng)法鑒定內(nèi)生芽孢桿菌種屬并建立獨(dú)屬于植物內(nèi)生菌的資源庫將是研究植物內(nèi)生芽孢桿菌的有效方法，同時結(jié)合培養(yǎng)法研究植物內(nèi)生芽孢桿菌的多樣性將有助于深入開發(fā)內(nèi)生菌資源。

4.2 效應(yīng)分子及機(jī)制研究

植物內(nèi)生芽孢桿菌及其天然產(chǎn)物具有多種功能，近幾年的文獻(xiàn)報道主要聚焦于對其促生和抗菌作用、活性代謝產(chǎn)物的純化及結(jié)構(gòu)鑒定和對植物病原真菌與人畜源致病因子的拮抗機(jī)制等方面的研究。其中對促生作用的研究大部分都集中在生長激素、固氮及溶解磷酸鹽的能力上，還有部分研究關(guān)注在極端環(huán)境下芽孢桿菌對植物的促生及抗逆機(jī)理。其次對抗菌作用的研究主要集中于直接拮抗機(jī)制，包括對抗菌活性天然產(chǎn)物脂肽、抗菌蛋白、細(xì)菌素等的鑒定，對植物病原真菌和人源致病菌的抗菌活性評價及機(jī)理研究。但是其中對于拮抗機(jī)制的研究大多流于表面，主要側(cè)重于對菌體或孢子形態(tài)變化、細(xì)胞膜完整度、胞內(nèi)物質(zhì)滲漏等方面進(jìn)行表征，對深層次的機(jī)理研究較少。

如今對植物內(nèi)生芽孢桿菌及其天然產(chǎn)物功能作用的研究眾多，但是缺乏一定的深度，未來應(yīng)更加注重深層次研究，例如天然產(chǎn)物的合成基因研究及其異源生物合成、天然抗菌物質(zhì)對致病菌基因及代謝的影響機(jī)制。此外，在極端環(huán)境下誘導(dǎo)植物的促生及抗逆、從海洋植物和極端生境植物中發(fā)掘內(nèi)生芽孢桿菌的新型產(chǎn)物和植物內(nèi)生芽孢桿菌對環(huán)境的生物修復(fù)都將是未來的研究方向。

4.3 應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)化

目前內(nèi)生芽孢桿菌的產(chǎn)業(yè)化主要體現(xiàn)在農(nóng)業(yè)方面，依據(jù)內(nèi)生芽孢桿菌開發(fā)的微生物農(nóng)藥除了具有環(huán)境相容性，同時具有增產(chǎn)、防治病蟲害和提高逆境下存活能力的作用。國內(nèi)外都曾開發(fā)出內(nèi)生芽孢桿菌制劑，包括活菌制劑和以活性物質(zhì)為主體的制劑。

在實現(xiàn)應(yīng)用的過程中，研究者們也遇到了一些難題。首先是防效的穩(wěn)定性問題?；罹苿┠芊穹€(wěn)定定殖并發(fā)揮出相應(yīng)效果是生防制劑能否推廣的關(guān)鍵，環(huán)境因素(溫度，pH值)和生物因素(植物體內(nèi)微生物競爭)都會使其效果減弱或失效。有報道輪枝鐮刀菌(Fusariumverticillioides)產(chǎn)生的鐮刀菌酸對莫海威芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)等生防制劑具有拮抗作用，會減少活菌制劑定殖的細(xì)胞數(shù)，降低防效[41]。最新文獻(xiàn)報道將生防制劑中的抗菌物質(zhì)采用合成生物學(xué)方法，通過基因工程和分子生物學(xué)手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)設(shè)計及生物合成，這種方法不僅可以增強(qiáng)其穩(wěn)定性，還能簡化生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)量并降低成本。Lee等[42]通過引入d-氨基酸和脂肪酸設(shè)計的d-型脂肽dCopW3明顯改善了其鹽敏感性和穩(wěn)定性。

其次還要確保菌株及其產(chǎn)物對人畜安全無害。有研究發(fā)現(xiàn)從農(nóng)作物中分離出的內(nèi)生蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)可以產(chǎn)生腸毒素，存在使人腹瀉的潛在危害性[43]。此外，活菌制劑類微生物農(nóng)藥更偏向于預(yù)防，相比于化學(xué)農(nóng)藥具有見效時間長和效果弱的缺陷。目前在農(nóng)業(yè)中應(yīng)傾向于菌種混合或與化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配施加使用。