泛素羧基末端水解酶-1在神經(jīng)退行性疾病中的作用及臨床應(yīng)用

楊 依 趙 麗

神經(jīng)退行性疾病是由神經(jīng)元和(或)髓鞘的喪失所致，病情隨著時(shí)間的推移而惡化，最終出現(xiàn)功能性障礙。常見的神經(jīng)退行性疾病有：阿爾茲海默病(Alzheimer′s disease，AD)、帕金森病(Parkinson′s disease，PD)等。目前這些疾病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，主要有興奮毒性學(xué)說、細(xì)胞凋亡學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說等，這些學(xué)說均與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system，UPS)密切相關(guān)。泛素羧基末端水解酶1(ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1，UCH-L1)作為UPS中的重要組成蛋白，在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。

一、UCH-L1與UPS

UPS是真核細(xì)胞內(nèi)蛋白降解的重要途徑，泛素(Ub)是UPS核心，是由76個(gè)氨基酸組成的高度保守的小分子蛋白。UPS有兩類重要的酶：泛素化酶和去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUB)，UCH是去泛素化酶中的一個(gè)重要家族。UCH有3種異構(gòu)體：UCH-L1、UCH-L2、UCH-L3。UCH-L1主要分布在大腦神經(jīng)元中，可以達(dá)到腦內(nèi)總蛋白量的2%。用組織原位雜交的方法發(fā)現(xiàn)其多分布在黑質(zhì)致密部，或者存在于周圍神經(jīng)系統(tǒng)如三叉神經(jīng)節(jié)等處。此外，UCH-L1也存在于卵母細(xì)胞及精母細(xì)胞。

UCH-L1主要有3種功能：①水解多聚泛素鏈，使泛素單體可以重復(fù)使用；②以二聚體形式作為一種不依賴ATP的泛素連接酶催化k-63形式泛素鏈的形成，從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制k-48形式泛素鏈與異常蛋白的結(jié)合，使異常蛋白不能被蛋白酶體識(shí)別、降解；③穩(wěn)定泛素分子單體，并可以通過調(diào)節(jié)泛素單體水平起到對(duì)UPS的調(diào)控。

二、UCH-L1與阿爾茲海默病

阿爾茲海默病(AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病，為老年期癡呆最常見的一種類型，表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害。臨床及組織病理學(xué)研究表明，AD主要有兩個(gè)病理特征：因病理性β淀粉樣蛋白(amyloid β,Aβ)沉積而生成的老年斑；因微管相關(guān)蛋白tau蛋白過度磷酸化而形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)。UCH-L1已被證明在突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，與AD的發(fā)生密切相關(guān)[1]。

1.UCH-L1參與AD的可能發(fā)病機(jī)制：相關(guān)研究通過質(zhì)譜分析的方法發(fā)現(xiàn)AD患者腦中可溶性UCH-L1與顆粒性UCH-L1的比例發(fā)生明顯改變[2]?？扇苄訳CH-L1是功能的主要執(zhí)行者，它的改變可能參與AD發(fā)病。與野生型小鼠比較，作為AD模型的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)可溶性UCH-L1含量下降約30%，且海馬區(qū)長時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)(long-term potentiation,LTP)受到抑制，出現(xiàn)認(rèn)知障礙；而轉(zhuǎn)染UCH-L1后的小鼠能夠恢復(fù)UCH-L1活性且LTP恢復(fù)到正常水平[3]。

(1)UCH-L1與Aβ：UCH-L1可影響Aβ含量和神經(jīng)元的活動(dòng)。缺血性腦損傷處理后的小鼠腦中UCH-L1含量與活性均會(huì)降低，導(dǎo)致BACE1水平上調(diào)，BACE1作為β分泌酶可以促進(jìn)APP向Aβ方向的分解，從而導(dǎo)致Aβ聚集。而小鼠經(jīng)過注射外源UCH-L1蛋白后大腦中BACE1含量下降，神經(jīng)元的存活率得到提高[4]。同時(shí)，小鼠原代神經(jīng)元經(jīng)此處理后由Aβ引起的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)逆向運(yùn)輸減少的現(xiàn)象得到明顯改善，使神經(jīng)元的生存率和可塑性得到提高[5]。

(2)UCH-L1與NFTs：研究發(fā)現(xiàn)敲除UCH-L1基因的小鼠出現(xiàn)類似AD癥狀。該小鼠腦中可溶性UCH-L1含量下降，而腦神經(jīng)元中神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFTs)數(shù)量增多，提示UCH-L1可能參與神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成[6]。具體體現(xiàn)為：一方面，UCH-L1的下調(diào)可促進(jìn)tau蛋白高磷酸化而形成NFTs。LDN是UCH-L1抑制劑，經(jīng)LDN處理后的小鼠N2a細(xì)胞中微管結(jié)合tau蛋白含量下降，說明UCH-L1影響tau蛋白的微管結(jié)合能力，而未與微管結(jié)合的tau蛋白容易聚集。利用高磷酸化tau(Ser202、Thr205)特異性抗體AT8進(jìn)行免疫熒光與硫黃素染色發(fā)現(xiàn)tau蛋白高磷酸化并異常聚集，且都以LDN劑量依賴性增加[7]。另一方面，UCH-L1的下調(diào)還可減少異常聚集tau蛋白的降解。在tau相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，UPS由于超出其所能承受的負(fù)荷或功能受損而無法有效降解蛋白質(zhì)。此時(shí)組蛋白去乙?；?HDAC6)可與泛素化蛋白形成復(fù)合物，運(yùn)輸?shù)轿⒐芙M織中心形成聚集體，減小異常聚集蛋白對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用的范圍，并通過自噬-溶酶體途徑(autophagy-lysosome pathway,ALP)將其降解。轉(zhuǎn)染tau441后的HEK293細(xì)胞可過量表達(dá)tau蛋白，此后，與單獨(dú)應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG132比較，同時(shí)應(yīng)用MG132和LDN處理的細(xì)胞中HDAC6與tau蛋白的結(jié)合下降，不能形成標(biāo)志性的核周球狀聚集體結(jié)構(gòu)，而此時(shí)UCH-L1寡聚體水平顯著降低，k-63形式的泛素鏈水平降低。表明在tau蛋白過量表達(dá)、異常聚集的情況下，UCH-L1寡聚體的下調(diào)會(huì)減少k-63形式泛素鏈的產(chǎn)生，抑制HDAC6的激活，從而影響HDAC6與tau蛋白的結(jié)合，使得小分子泛素化的tau蛋白在細(xì)胞質(zhì)中分散，影響聚集體的形成，阻止異常聚集的蛋白質(zhì)經(jīng)自噬-溶酶體途徑降解[8]。

2.UCH-L1多態(tài)性對(duì)AD的保護(hù)：UCH-L1多態(tài)性對(duì)AD的保護(hù)作用一直存在爭(zhēng)議。UCH-L1基因的3號(hào)外顯子上第54位胞嘧啶突變?yōu)橄汆堰?C54A)可使得相應(yīng)位點(diǎn)出現(xiàn)S18Y多態(tài)性。2006年，Xue等對(duì)中國漢族散發(fā)AD患者和健康人的基因分析結(jié)果表明A等位基因和AA基因型可能對(duì)女性散發(fā)AD有保護(hù)作用。然而，2010年Zetterberg等對(duì)瑞典AD患者和健康人群的調(diào)查統(tǒng)計(jì)則發(fā)現(xiàn)S18Y多態(tài)性未對(duì)AD產(chǎn)生保護(hù)機(jī)制。此外，有研究通過Meta分析發(fā)現(xiàn)，UCH-L1基因的5種常見的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，即rs11556271、rs3756002、rs3775256、rs4861387、rs28581187與日本AD患者發(fā)病無相關(guān)性，不能作為評(píng)估AD發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)因素[9]。

三、UCH-L1與帕金森病

帕金森病(PD)是僅次于阿爾茲海默病的第2大神經(jīng)退行性疾病，PD可分為家族性PD(FPD)和散發(fā)型PD(SPD)。中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的變性以及細(xì)胞蛋白內(nèi)含物——路易小體的出現(xiàn)是帕金森癥的兩個(gè)病理學(xué)標(biāo)志，α-突觸核蛋白是路易小體的重要組成成分。特異性敲除其多巴胺神經(jīng)元UCH-L1基因后的黑腹果蠅出現(xiàn)神經(jīng)退行性改變，導(dǎo)致其腦內(nèi)多巴胺含量下降，從而出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙[10]。UCH-L1對(duì)PD的作用主要通過引發(fā)UPS異常而實(shí)現(xiàn)，而某些突變型UCH-L1的致病作用還與自噬-溶酶體途徑有關(guān)。

1.UCH-L1調(diào)節(jié)α-突觸核蛋白的細(xì)胞間傳遞：盡管諸如α-突觸核蛋白等蛋白質(zhì)包涵體在細(xì)胞間傳遞的詳細(xì)機(jī)制尚未得到充分了解，但預(yù)計(jì)這種傳遞可以解釋許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制[11]。近年來，脂筏(lipid raft)被認(rèn)為可通過影響神經(jīng)元中特異性細(xì)胞內(nèi)含物的轉(zhuǎn)運(yùn)、傳播從而與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，UCH-L1與脂筏功能密切相關(guān)：在UCH-L1含量下降的原代神經(jīng)元中，脂筏依賴性內(nèi)吞作用增強(qiáng)，內(nèi)源性α-突觸核蛋白的含量沒有明顯變化但其在細(xì)胞間的傳遞顯著增加?？紤]到UCH-L1的去泛素化作用及其與脂筏的聯(lián)系，UCH-L1可能是通過調(diào)節(jié)脂筏蛋白的泛素化和去泛素化狀態(tài)而調(diào)節(jié)脂筏依賴性的內(nèi)吞作用[12]。

2.UCH-L1突變與PD

(1)UCH-L1I93M突變與PD:1998年Leroy等在德國一個(gè)PD家系中發(fā)現(xiàn)UCH-L1基因突變(C277G)，這一突變導(dǎo)致UCH-L1編碼的第93位異亮氨酸(I)變?yōu)榧琢虬彼?M)，水解酶活性降低約50%。2004年Ardley等研究發(fā)現(xiàn)，相比于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染UCH-L1I93M突變質(zhì)粒后的COS-7細(xì)胞中呈聚集狀態(tài)的內(nèi)含物含量更高。UCH-L1I93M產(chǎn)生的毒性作用可能參與PD的發(fā)病。與野生型小鼠比較，轉(zhuǎn)染UCH-L1I93M基因的gad小鼠在行為學(xué)上表現(xiàn)出自發(fā)活動(dòng)的減少，而在神經(jīng)病理學(xué)改變上表現(xiàn)出黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元減少，一部分黑質(zhì)神經(jīng)元中出現(xiàn)致密核心小泡和嗜銀顆粒，這些表現(xiàn)都與PD癥狀極為相似。免疫印跡顯示中腦不溶性UCH-L1比率大大提高，提示I93M突變引發(fā)的毒性作用可能導(dǎo)致了多巴胺神經(jīng)元的退行性改變，從而參與了PD的發(fā)病[13]。UCH-L1I93M活性的下降也是引發(fā)PD重要因素。DUB活性下降的UCH-L1I93M可通過影響自噬-溶酶體途徑而抑制α-突觸核蛋白的降解。用mRFP-GFP-LC3雙熒光自噬指示體系追蹤HeLa細(xì)胞系的LC3水平和自噬流發(fā)現(xiàn)UCH-L1I93M突變細(xì)胞中GFP/RFP比率沒有明顯改變，但LC3斑點(diǎn)輕微增加且細(xì)胞中p62含量明顯積累，表明自噬體和溶酶體的融合過程未受影響，但自噬體的形成受到一定程度的抑制，自噬功能出現(xiàn)嚴(yán)重障礙。此時(shí)，α-突觸核蛋白以及異常蛋白的清除必然受到影響，過多的有毒產(chǎn)物聚集形成路易小體，導(dǎo)致PD的發(fā)病[14]。

(2)UCH-L1S18Y多態(tài)性與PD：S18Y多態(tài)性被發(fā)現(xiàn)在PD中起到神經(jīng)保護(hù)作用：UCH-L1S18Y基因所轉(zhuǎn)錄的UCH-L1蛋白二聚化趨勢(shì)降低，具有水解酶活性高而連接酶活性低的特點(diǎn)。此時(shí)底物α-突觸核蛋白更容易被蛋白酶體識(shí)別，經(jīng)UPS降解而減少PD的發(fā)病[15]。S18Y多態(tài)性的保護(hù)作用在小鼠身上已經(jīng)得到證明。經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)染UCH-L1S18Y基因的小鼠可明顯減少因MPTP誘導(dǎo)引起的黑質(zhì)神經(jīng)元損失，同時(shí)紋狀體多巴胺含量的下降幅度也降低[16]。然而，S18Y多態(tài)性對(duì)于人類的保護(hù)作用卻一直受到質(zhì)疑。Liu等[17]將22項(xiàng)遍及各大洲的研究進(jìn)行Meta分析后發(fā)現(xiàn)，UCH-L1多態(tài)性與人群患PD風(fēng)險(xiǎn)中度相關(guān)；而對(duì)亞洲、歐洲和美國人群UCH-L1多態(tài)性進(jìn)行的亞組分析未顯示任何與PD風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的種族依賴性；對(duì)年齡進(jìn)行亞組分析時(shí)，仍未觀察到明顯關(guān)聯(lián)；但剔除其中3項(xiàng)低質(zhì)量研究后的Meta分析顯示,UCH-L1等位基因A與PD風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)；同時(shí)，在隱性模型(CC vs CA+AA)中也顯示出S18Y多態(tài)性與PD風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[17]。

四、腦脊液UCH-L1水平對(duì)于神經(jīng)退行性病變的診斷

近期的研究發(fā)現(xiàn)，腦脊液(cerebrospinal fluid,CSF)中UCH-L1水平對(duì)于PD、AD的診斷起重要作用。與正常人群比較，AD患者CSF中UCH-L1水平明顯升高。因此，CSF中UCH-L1可作為AD的診斷依據(jù)和分子標(biāo)志物[18]。相反，與正常人群比較，PD患者CSF中UCH-L1含量明顯下降，也可用于PD的診斷。此外，研究發(fā)現(xiàn)PD患者CSF中UCH-L1濃度與發(fā)病年齡亦呈正相關(guān)，且用于突觸核蛋白病(包括PD和MSA)患者病情程度分級(jí)的Hoehn and Yahr(H&Y)量表得分與CSF中UCH-L1水平呈正相關(guān)，提示CSF中UCH-L1水平可能作為突觸核蛋白病的階段分層指標(biāo)[19]。

五、展 望

近年來臨床研究發(fā)現(xiàn)，腦脊液中UCH-L1水平在AD、PD患者與健康人群中存在顯著差異，UCH-L1有望對(duì)臨床確診、疾病程度分級(jí)工作起到輔助診斷作用。然而盡管已有眾多研究探討了UCH-L1的結(jié)構(gòu)和功能，發(fā)現(xiàn)UCH-L1對(duì)神經(jīng)退行性疾病有著重要的作用，但是UCH-L1在AD、PD發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制尚不清楚。

UCH-L1對(duì)神經(jīng)退行性疾病中的特殊內(nèi)含物或標(biāo)志物都有重要影響，其中可溶性UCH-L1的作用尤為重要。脂筏模型是近年來神經(jīng)退行性疾病中的討論熱點(diǎn)，UCH-L1被發(fā)現(xiàn)可以通過脂筏蛋白調(diào)節(jié)α-突觸核蛋白的細(xì)胞間傳遞，且與目前一些已知蛋白對(duì)于脂筏的影響機(jī)制明顯不同，但這一具體作用機(jī)制還未被發(fā)現(xiàn)。關(guān)于UCH-L1S18Y多態(tài)性、UCH-L1I93M突變對(duì)神經(jīng)退行性疾病的保護(hù)或促進(jìn)作用仍然存在分歧，不同的研究調(diào)查顯示出不同的結(jié)果，因此還需要更多數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)來源和人群分類方法以得出最終結(jié)論。

綜上所述，鑒于UCH-L1對(duì)于神經(jīng)退行性疾病的重要影響，進(jìn)一步深入研究UCH-L1在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能和作用底物對(duì)明確神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制有十分重要的指導(dǎo)意義，同時(shí)也可為神經(jīng)退行性疾病的早期預(yù)防、早期診斷、早期治療以及新藥的開發(fā)提供新的思路和靶點(diǎn)。同時(shí)也應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，不僅要探討UCH-L1的下游通路以發(fā)現(xiàn)其在神經(jīng)退行性疾病中的作用，更要追根溯源，探索導(dǎo)致UCH-L1發(fā)生改變的原因，如導(dǎo)致UCH-L1不同形式之間轉(zhuǎn)換以及導(dǎo)致UCH-L1發(fā)生不同翻譯后修飾的影響因素，從根本上降低神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生概率。