運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存蛋白缺失與心臟疾病的研究進(jìn)展

鐘 曉 宋紫光 高萍萍 宋 湘

脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy,SMA)是一種常染色體隱性遺傳疾病，在新生兒中的發(fā)生率約為1/6000[1]。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存基因1(survival of motor neuron 1,SMN1)突變引起運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存蛋白(survival of motor neuron, SMN)水平降低,繼而導(dǎo)致SMA的發(fā)生。雖然SMN蛋白普遍表達(dá)于各種細(xì)胞內(nèi)，但在SMA疾病中主要表現(xiàn)為腦干和脊髓中α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的退化。進(jìn)行性神經(jīng)元退化使延髓受損、軀干和四肢肌肉無力，在疾病的終末階段可以導(dǎo)致患者癱瘓、呼吸衰竭，最終死亡[2]。

SMA傳統(tǒng)上被認(rèn)為是神經(jīng)肌肉疾病，但越來越多的證據(jù)表明它是一種多系統(tǒng)疾病。據(jù)報(bào)道，在SMA患者和小鼠模型中外周組織和細(xì)胞均有受到影響，包括肝臟、肺、胰腺、脾臟、睪丸、腸和心血管系統(tǒng)的異常[3]。

SMA患者存在心臟異常在60多年前已經(jīng)被提出，但直到現(xiàn)在心臟異常是SMA的一個(gè)潛在的核心病變這一觀點(diǎn)才被接受，尤其是在嚴(yán)重的疾病中[4]。為了更詳細(xì)地研究SMN蛋白與心臟異常的關(guān)系，筆者對現(xiàn)有的臨床和實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)做一綜述。

一、SMN蛋白的結(jié)構(gòu)、分布和功能

SMN蛋白主要由位于5號染色體長臂1區(qū)3帶(5q13)上的SMN1基因表達(dá)產(chǎn)生[5]。SMN蛋白由294個(gè)氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為38kDa，在所有細(xì)胞類型的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中普遍表達(dá)，并且可以和許多蛋白質(zhì)與RNA相互作用[4]。

目前已經(jīng)清楚SMN蛋白參與了許多細(xì)胞通路，但SMN蛋白第1個(gè)確定的和研究最多的功能是其在小核糖核蛋白(small nuclear ribonucleoproteins，snRNP)組裝中的作用。SMN蛋白參與了snRNP的生成以及其向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的過程[6]。 snRNP與一些額外的蛋白質(zhì)一起形成大型顆粒狀復(fù)合物,稱為剪接體。剪接體是一個(gè)復(fù)雜的機(jī)器，它催化移除前體mRNA中的內(nèi)含子[7]。對SMA患者或小鼠模型細(xì)胞剪接活性的研究揭示了SMN蛋白在 snRNP組裝中的基本作用，以及snRNP水平降低與疾病嚴(yán)重程度之間的相關(guān)性[6]。

SMN蛋白在神經(jīng)生長、軸突及突觸細(xì)胞骨架的形成過程中起著重要的作用，并且參與高爾基體相關(guān)分泌囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)[8]。SMN蛋白還可以通過多種機(jī)制調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯。如改變mRNA亞細(xì)胞定位，通過與核糖體自身的聯(lián)系調(diào)節(jié)核糖體單位的局部翻譯，通過調(diào)控mTOR通路來影響蛋白質(zhì)的表達(dá)。研究表明，SMN蛋白在其他領(lǐng)域也具有重要功能，如影響細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)、內(nèi)吞作用,參與蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)過程的自噬、泛素蛋白酶體途徑和線粒體活動(dòng)的監(jiān)管[6]。

二、SMN蛋白缺失導(dǎo)致的心臟異常改變

1.SMN蛋白缺乏導(dǎo)致SMA患者心臟異常:2017年一項(xiàng)綜述納入72篇發(fā)表的文章，包括264例心臟異常的SMA患者。SMA患者中主要表現(xiàn)為心律失常和結(jié)構(gòu)性心臟改變。77例SMA 1型患者中有33例患者出現(xiàn)心電圖異常，15例患者心電圖顯示有嚴(yán)重癥狀的心動(dòng)過緩，即心率低于40次/分，其他18例患者出現(xiàn)基線震顫。77例SMA 1型患者中有42例SMA 1型患者存在結(jié)構(gòu)性心臟缺陷，其中50%存在單一的心臟結(jié)構(gòu)異常，包括房間隔缺損、室間隔缺損和左心發(fā)育不良綜合征。其余患者存在多處結(jié)構(gòu)性心臟異常[4]。

63例SMA 2型患者有心電圖基線震顫。少數(shù)患者還有一個(gè)或多個(gè)心電圖異常，包括沖動(dòng)發(fā)生異常的竇性心動(dòng)過速，沖動(dòng)傳導(dǎo)異常的右束支傳導(dǎo)阻滯，以及心房擴(kuò)大、心室擴(kuò)大、心室肥大和心肌損害[4]。124例SMA 3型患者中有67例僅有心電圖基線震顫。6例患者同時(shí)出現(xiàn)心電圖異常和結(jié)構(gòu)性心臟病，如QT間期延長、二尖瓣和三尖瓣脫垂、室間隔肥厚、心室后壁肥厚或萎縮、左心室舒張末期容量減少等異常改變[4]。

從上述研究可以發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)性心臟病幾乎只在SMA 1型患者中發(fā)生，而獲得性心臟病理學(xué)，包括心律失常和傳導(dǎo)異常，在受影響較輕的患者中報(bào)告更頻繁,即SMN蛋白水平越低心臟異常表現(xiàn)越嚴(yán)重。Rudnik-Schoneborn等[9]研究支持了SMN蛋白在心臟發(fā)育中的關(guān)鍵作用。事實(shí)上，他們發(fā)現(xiàn)在單拷貝SMN2的患者中(產(chǎn)生SMN蛋白水平較少)，先天性間隔缺損的發(fā)生率接近75%。而在無SMA的患者中，其發(fā)生率接近1/5000萬。心房撲動(dòng)和心房顫動(dòng)在50歲以下的年輕人中發(fā)生率特別低，但在SMA患者中普遍發(fā)生于年輕時(shí)期，這也揭示了SMN蛋白在心臟異常發(fā)生中的重要作用[4]。

2.SMN蛋白缺乏導(dǎo)致小鼠心臟異常：在輕度和重度SMA小鼠模型中，SMN蛋白缺乏也造成了心血管的異常。包括以室間隔和左心室壁變薄為代表的結(jié)構(gòu)變化、擴(kuò)張型心肌病、纖維化和氧化應(yīng)激增加，但先天性心臟病如房室間隔缺損的發(fā)病卻很少[10]。在輕度和重度的小鼠模型中，射血分?jǐn)?shù)下降和心律失常，特別是心動(dòng)過緩的報(bào)道都表明了心功能的改變[11,12]。值得注意的是，在非常溫和的Burgheron小鼠模型中，一些小鼠死于嚴(yán)重的心肌病，而不是神經(jīng)肌肉病理學(xué)的影響[12]。

Bevan等[11]研究發(fā)現(xiàn)SMN蛋白缺乏會(huì)導(dǎo)致小鼠早期和持續(xù)性的心功能障礙。出生后14天，重型SMN△7小鼠和正常野生小鼠對照，超聲心動(dòng)圖顯示心臟大小、左心室質(zhì)量均下降，室壁厚度變薄、左心室短軸縮短率下降、心動(dòng)過緩。隨著疾病的發(fā)展，逐漸發(fā)展為心肌收縮力下降的擴(kuò)張型心肌病。

Wijngaarde等[4]總結(jié)了14項(xiàng)研究，記錄了SMA小鼠模型心臟病理學(xué)的改變。常見的宏觀表現(xiàn)包括心臟尺寸減小、左心室壁和室間隔厚度減少。而顯微鏡觀察最常見的是心臟纖維化，中等及嚴(yán)重SMA小鼠模型中在疾病的癥狀前階段就可以檢測到。此外，幾乎所有對SMA小鼠模型的研究都報(bào)道了慢速心律失常[4]。最近一項(xiàng)SMA嚴(yán)重小鼠模型的研究證實(shí)了此前的許多研究結(jié)果，但也注意到心臟中血液的顯著匯集，以及心肌細(xì)胞的解體和肌小梁的缺失[13]?？梢奡MN蛋白的缺乏也會(huì)導(dǎo)致小鼠心臟異常改變。

三、SMN蛋白降低導(dǎo)致心臟異常改變可能的機(jī)制

SMN蛋白的降低是如何導(dǎo)致心臟機(jī)械和電生理改變，相關(guān)的研究較少，但目前的幾項(xiàng)研究可以提供一定的參考。

1.SMN蛋白的減少導(dǎo)致線粒體功能障礙：Maxwell等[13]在SMA小鼠出生早期發(fā)現(xiàn)線粒體源性氧化應(yīng)激增加，尤其是與SMN蛋白直接作用的ATP合成復(fù)合物亞基6(該物質(zhì)參與氧化應(yīng)激反應(yīng))表達(dá)增加。心肌細(xì)胞含有許多線粒體以支持其高能量需求，因此對線粒體功能障礙介導(dǎo)的氧化應(yīng)激非常敏感。出生時(shí)氧化應(yīng)激增加不僅表明這是SMA心臟病理學(xué)病因中的一個(gè)重要事件，而且還表明早期線粒體功能障礙。Bevan等[11]對出生晚期的SMNΔ7小鼠心臟進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，肌細(xì)胞的肌質(zhì)幾乎充滿了線粒體。許多線粒體表現(xiàn)出退行性改變，如嵴碎裂，伴有相關(guān)的空泡變性，這與晚期心力衰竭一致。衰竭的SMA心肌線粒體大小的增加可能是由于能量需求增加所進(jìn)行的代償。也可能是由于不適應(yīng)導(dǎo)致氧化細(xì)胞色素的釋放，和(或)線粒體通透性轉(zhuǎn)變的開始，兩者對心泵功能都有害[14]。以上研究均表明線粒體功能障礙可能是SMA心臟缺陷的主要驅(qū)動(dòng)因素，SMN蛋白的缺乏影響線粒體的形態(tài)和功能改變。

2.SMN蛋白的減少影響心肌細(xì)胞的凋亡：為了建立SMA心臟結(jié)構(gòu)變化的細(xì)胞基礎(chǔ)，Maxwell等[13]對從出生(P1)到癥狀早期(P5)的心肌細(xì)胞進(jìn)行了專門的研究。SMA心臟在癥狀前(P3)和早期(P5)心肌細(xì)胞密度顯著減少，但在出生時(shí)沒有。為了確定心肌細(xì)胞密度下降的本質(zhì)，他們對細(xì)胞增凋亡進(jìn)行了分析。用Western blot法對caspase-3進(jìn)行凋亡分析，因?yàn)閏aspase-3參與了caspases的激活級聯(lián)反應(yīng)，也參與了凋亡的發(fā)生[15]。在癥狀早期性SMA小鼠心臟中，caspase-3顯著增加。同時(shí)在SMA小鼠模型上發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激的增加導(dǎo)致了細(xì)胞進(jìn)一步的凋亡[13]。這表明心肌細(xì)胞密度的降低可能與細(xì)胞凋亡的增加有關(guān)，而細(xì)胞凋亡與心臟萎縮是一致的。

Sheng等[16]通過TUNEL染色和透射電鏡分析超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡發(fā)生在相對較晚的時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞凋亡增強(qiáng)存在于組織中，并導(dǎo)致了心臟缺陷。他們還檢測了腫瘤抑制蛋白TRP53/P53(一種SMN相互作用蛋白)的下游基因，包括CDKN1a/p21、Pmaip1/Noxa、Bbc3/Puma、Fas和Bax，發(fā)現(xiàn)它們在P4時(shí)顯著上調(diào)。這些凋亡相關(guān)基因的上調(diào)可以解釋為什么SMA小鼠心臟組織的凋亡增強(qiáng),SMN蛋白的減少可引起凋亡級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。

3.SMN蛋白的減少導(dǎo)致心肌纖維化增加：心肌纖維化是心肌細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的結(jié)果。它導(dǎo)致組織僵硬和心律失常，并使心力衰竭患者易發(fā)生心源性猝死[17]。Shababi等[1]報(bào)道，SMNΔ7小鼠心臟間質(zhì)纖維化，最初在P2上發(fā)展，在P5和P9上增強(qiáng)。高水平的纖維化與諸如心率減慢等心臟缺陷相關(guān)，提示心肌纖維化是SMA小鼠心臟病理學(xué)的重要因素。Shababi等[1]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SMA小鼠新生心臟組織中存在高水平的活性氧，因此提出氧化應(yīng)激，一種已知的促纖維化因子，是心臟纖維化的潛在機(jī)制。Sheng等[16]觀察到生存蛋白survivin在出生時(shí)表達(dá)下調(diào)，生存蛋白survivin的失調(diào)和氧化應(yīng)激都可能導(dǎo)致SMA小鼠心臟間質(zhì)纖維化。所以，SMN蛋白減少可以通過增加活性氧和影響下游蛋白導(dǎo)致心肌纖維化。

4.SMN蛋白降低影響下游蛋白表達(dá)進(jìn)一步導(dǎo)致心臟病理性改變：許多微陣列的研究，觀察到廣泛的基因表達(dá)缺陷存在于SMA小鼠模型中，包括前mRNA剪接。然而，在脊髓和心臟等受影響組織中，作用于SMN下游的關(guān)鍵基因仍不清楚。最近，Sheng等[16]確認(rèn)Birc5(survivin)是SMA心臟發(fā)病的關(guān)鍵基因。存活蛋白survivin作為凋亡抑制因子家族中最小的成員，在有絲分裂細(xì)胞中起著關(guān)鍵作用。最重要的是，survivin決定了心肌細(xì)胞總數(shù)，是出生后心臟發(fā)育必不可少的。他們用特異性siRNA抑制正常小鼠原代心肌細(xì)胞SMN基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)存活蛋白survivin表達(dá)降低，并引起細(xì)胞周期停滯，表明存活蛋白survivin是SMN的下游。單獨(dú)過表達(dá)存活蛋白survivin可以顯著恢復(fù)細(xì)胞周期進(jìn)展，表明SMN蛋白缺乏在SMA心肌細(xì)胞的細(xì)胞停滯中的關(guān)鍵作用。而且，只要survivin的表達(dá)得以恢復(fù)，其他基因的失調(diào)可在一定程度上得到耐受。因此，作為SMN下游蛋白，survivin是導(dǎo)致SMA心力衰竭的主要因素之一。

有研究者對SMN下游蛋白進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)重脊髓性肌萎縮的小鼠模型中，核纖層蛋白A/C失調(diào)導(dǎo)致心臟病理改變。核纖層蛋白A和C，由LMNA基因編碼，除了為細(xì)胞核提供結(jié)構(gòu)支持外，還涉及其他幾種功能，包括機(jī)械信號、染色質(zhì)組織和基因表達(dá)調(diào)控。LMNA基因突變引起的疾病主要表現(xiàn)為心臟病理改變。每個(gè)患者患有嚴(yán)重的心臟疾病，最終需要起搏器治療。在每個(gè)病例中進(jìn)行家族史檢查，顯示出高頻率的心臟異常和突然無法解釋的心臟病死亡[18]。這使得核纖層蛋白A/C的正確功能成為維持心臟健康的關(guān)鍵要求。他們發(fā)現(xiàn)，在SMA小鼠模型的心臟組織中，核纖層蛋白A/C強(qiáng)有力地增加，因此表明核纖層蛋白A/C至少部分負(fù)責(zé)先前報(bào)道的SMA中的心臟缺陷。SMN蛋白水平降低，似乎很可能增加的核纖層蛋白A/C水平使心肌細(xì)胞變硬，阻礙其正常收縮的能力并誘導(dǎo)先前在SMA中報(bào)道的心臟缺陷。

對于SMN蛋白的缺陷如何導(dǎo)致心臟異常，還有其他一些可能的解釋，包括可能干擾正常心臟發(fā)育的特定mRNA剪接[19]。低水平SMN蛋白已經(jīng)顯示出影響動(dòng)物模型中的胚胎器官發(fā)育，包括心臟發(fā)生[2]。低水平的SMN蛋白也可能導(dǎo)致心臟發(fā)生中特定細(xì)胞類型的功能障礙。潛在的候選細(xì)胞類型是神經(jīng)嵴細(xì)胞(NCC)，心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞(cNCC)由NCC遷移并分化而成。這些細(xì)胞參與大血管的肌結(jié)締組織(中膜)、心臟流出道間隔(將圓錐管分為主動(dòng)脈和肺干)、心房和心室間隔的發(fā)育[4]。SMN蛋白缺乏可能改變下游信號通路的功能，這些通路對于NCC的遷移過程很重要[20]。此外，盡管心臟電傳導(dǎo)系統(tǒng)本身來自心肌細(xì)胞，但導(dǎo)致心律失常的心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)展來自NCC[21]。所以SMN蛋白濃度降低后對心肌細(xì)胞和自主神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生雙重影響導(dǎo)致SMA患者及動(dòng)物模型表現(xiàn)出心臟異常改變。

四、SMN蛋白減少導(dǎo)致心肌損害的治療

目前對于SMA疾病除了支持和對癥治療外，特異性治療很有限。而對于SMN蛋白降低導(dǎo)致的心肌損害的治療，目前只在動(dòng)物模型上進(jìn)行初步嘗試。Heier等[22]用曲古抑菌素A(一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑)治療的小鼠可以改善心率和心臟大小，而且神經(jīng)肌肉功能也得到改善。Bevan等[11]研究了自身互補(bǔ)腺相關(guān)病毒9型 (selfcomplementary adeno-associated virus type 9,scAAV9)攜帶SMN基因?qū)MNΔ7小鼠心臟缺損的治療作用。同樣在產(chǎn)后早期使用scAAV9-SMN治療，可以預(yù)防心動(dòng)過緩和擴(kuò)張型心肌病的早期發(fā)展。Shababi等[23]也使用表達(dá)全長SMN cDNA的scAAV9處理SMNΔ7模型，表明SMA心臟存在纖維化、氧化應(yīng)激激活、血管重塑和毛細(xì)血管數(shù)量顯著減少。在治療的動(dòng)物中，心臟結(jié)構(gòu)缺陷得到改善。通過體內(nèi)心臟磁共振成像的功能分析顯示，經(jīng)治療的SMA小鼠的心臟仍然表現(xiàn)出功能缺陷。所以在出生后治療的SMA動(dòng)物中僅部分挽救了心臟功能。Biondi等[24]在SMA小鼠模型中研究了體育鍛煉對心肺功能的影響，并觀察到許多益處，包括減少心肌成熟的延遲、減少纖維化、提高心肌傳導(dǎo)速度和減少心律失常、心肌梗死和心動(dòng)過緩，恢復(fù)部分心臟功能。此外，該研究結(jié)果顯示交感神經(jīng)系統(tǒng)有助于改善該模型中的心律失常和心動(dòng)過緩。

五、展 望

綜上所述，SMA患者及模型研究表明SMN蛋白在心臟的發(fā)生和維持心臟正常功能中具有重要作用，SMN蛋白的缺乏導(dǎo)致了心臟結(jié)構(gòu)、電和機(jī)械功能的病理改變。這些發(fā)現(xiàn)提供了一個(gè)新的研究領(lǐng)域，有利于對遺傳學(xué)確診的SMA患者進(jìn)行可控、標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)一和全面的心臟檢查。解開SMN相關(guān)細(xì)胞類型中的分子通路，有助于設(shè)計(jì)最適合治療的靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)可與SMN靶向治療相結(jié)合，有助于提高SMA治療的臨床成功率。