C-反應(yīng)蛋白的構(gòu)象變化和動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系的研究進(jìn)展

沈志遠(yuǎn),張 林

(1.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,中國甘肅 蘭州 730000;2.西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,中國陜西 西安 710061)

心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是危害人類健康的主要疾病之一,而動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是CVD的主要病因。AS是一種炎癥性疾病,由低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)在動(dòng)脈壁的沉積和隨后的修飾引起[1]。白細(xì)胞(主要是單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)被內(nèi)皮組織所表達(dá)的黏附因子招募聚集,滲透浸潤到動(dòng)脈內(nèi)膜并產(chǎn)生大量的炎癥細(xì)胞因子和趨化因子[2～3]。之后,浸潤的單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞,攝取修飾后的LDL并逐漸變成體積較大的泡沫細(xì)胞,進(jìn)而促進(jìn)AS的發(fā)展[4]?，F(xiàn)有研究顯示,多種不同類型的炎癥反應(yīng)參與AS的發(fā)生和發(fā)展[5],因此,各種炎癥生物標(biāo)志物被廣泛的研究,用以提高CVD的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測[6]。

在迄今報(bào)道的炎癥生物標(biāo)志物中,C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)是最重要的炎癥指標(biāo)之一。CRP是一種由相同亞基組成的五聚體分子,主要以五聚體CRP(pentameric CRP,pCRP)的形式存在于血液循環(huán)中,在急性炎癥或感染發(fā)作時(shí)由肝臟分泌產(chǎn)生[7]。在臨床上,CRP被用作炎癥、感染和組織損傷的非特異性標(biāo)識物[8]。在機(jī)體發(fā)生炎癥或者組織損傷時(shí),CRP血清濃度6 h內(nèi)可增加1萬倍,而且其分解代謝率與它的血漿濃度并無關(guān)聯(lián)[9]。CRP不僅是炎癥的重要指標(biāo),還是炎癥的調(diào)控因子。其被認(rèn)為是先天免疫的模式識別受體,可以識別并結(jié)合多種內(nèi)源與外源配體,如破損的細(xì)胞膜、細(xì)菌胞壁和核酸等,結(jié)合配體的CRP可以通過其效應(yīng)面進(jìn)一步與補(bǔ)體分子C1q和C4bp等結(jié)合,激活補(bǔ)體途徑,促進(jìn)有害物質(zhì)的清除[10]。此外,CRP還可以通過其效應(yīng)面結(jié)合不同的細(xì)胞表面受體,如 FcγR(Fcγ receptor)[11]、FcαR(Fcα receptor)[12]和 LOX-1(lectin-like oxidized LDL receptor-1)[13]等,從而激活多種免疫細(xì)胞的應(yīng)答。以上這些特征都表明,CRP是宿主防御、免疫調(diào)節(jié)和炎癥的重要組成部分。當(dāng)pCRP經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入炎癥微環(huán)境或暴露在病理?xiàng)l件下時(shí),可從五聚體解離為單體CRP(monomeric CRP,mCRP)。與pCRP相比,mCRP可以與不同的受體結(jié)合,表現(xiàn)出不同的功能特性[14]。mCRP也是一個(gè)很強(qiáng)的炎癥調(diào)節(jié)因子,可以通過激活補(bǔ)體[15～16]、活化內(nèi)皮細(xì)胞[17]和內(nèi)皮祖細(xì)胞等多種途徑來發(fā)揮其作用。越來越多的證據(jù)表明,CRP的功能取決于其構(gòu)象和定位的不同[14,18～23],而mCRP則是其參與局部炎癥調(diào)節(jié)的主要構(gòu)象。在此基礎(chǔ)上,我們旨在探究CRP構(gòu)象的變化對AS的影響。

1 CRP與動(dòng)脈粥樣硬化

炎癥被認(rèn)為在AS的各個(gè)階段都起著關(guān)鍵作用,大量炎癥生物標(biāo)志物的升高已被證明可以預(yù)測CVD的發(fā)生。而這些因子中,與CVD最密切相關(guān)的生物標(biāo)志物之一就是CRP。血清中的低濃度CRP(小于5 mg/L),以前被認(rèn)為沒有臨床意義。但是在20世紀(jì)90年代,隨著新的、更敏感的CRP檢測技術(shù)的發(fā)展,這些低濃度的CRP被賦予了新的意義,并被稱為高敏感性CRP(high-sensitivity CRP,hs-CRP),之后這種測試方法迅速產(chǎn)生了臨床影響。1997年,Ridker等[24]首次描述了hs-CRP的升高與動(dòng)脈疾病風(fēng)險(xiǎn)增加的相關(guān)性。之后越來越多的證據(jù)表明,基于hs-CRP測量的CRP可以獨(dú)立于傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素,用于CVD的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測,并且與傳統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)因素(如高脂血癥和高血壓等[25])一樣密切[26～27]?；谝陨献C據(jù),hs-CRP已經(jīng)成為在CVD風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測中領(lǐng)先的生物標(biāo)志物,并被歸類為Ⅲ類B級證據(jù)[28]。在雷諾茲風(fēng)險(xiǎn)評分中,除了傳統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)因素外,人們還加入了hs-CRP的風(fēng)險(xiǎn)評估,以提高總體風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測的準(zhǔn)確性[29]。研究人員甚至可以基于 hs-CRP 濃度(小于 1.0 mg/L、1.0～3.0 mg/L、大于3.0 mg/L),對低、中、高CVD風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行分類[26]。而且,根據(jù)hs-CRP的水平可以獨(dú)立預(yù)測正常人群CVD死亡的風(fēng)險(xiǎn)[27]。

此外,CRP在人AS的早期病變組織中可以被檢測到[30],而且其在炎癥部位的水平與疾病的發(fā)展密切相關(guān)[31]。有證據(jù)表明,AS斑塊大小的變化和治療后復(fù)發(fā)事件的風(fēng)險(xiǎn)也與患者CRP水平的變化緊密關(guān)聯(lián)[32]。除此之外,CRP 還與修飾的 LDL[33～35]、激活的補(bǔ)體[36]和泡沫細(xì)胞[30]等致AS介質(zhì)共定位。這些都意味著CRP不僅僅是一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測因子,還是CVD的直接參與者。事實(shí)上,大量的在體和離體實(shí)驗(yàn)證明,CRP可以通過調(diào)控CVD相關(guān)的炎癥過程影響病情的發(fā)展[37～40]。

盡管有上述令人信服的證據(jù),但也有大量的證據(jù)表明CRP與CVD并無因果關(guān)系。一些流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)CRP與疾病之間并無相關(guān)性[41～44]。例如,CRP基因的非編碼核苷酸多態(tài)性影響CRP的基礎(chǔ)血漿水平,但與未來發(fā)生CVD事件的風(fēng)險(xiǎn)并無關(guān)聯(lián)[44]。除此之外,許多動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)也都表明CRP與AS毫無關(guān)聯(lián)[45～52]。這些爭議使我們無法明確CRP在AS中的確切作用。除了這些離體和在體實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)的大量矛盾外,CRP的急性期血漿濃度過高也是一個(gè)問題,濃度變化如此巨大的CRP是如何精確調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的？hs-CRP又是如何能成為CVD的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測因子的？這些關(guān)于CRP在AS/CVD中的功能作用的種種疑問,都亟待去解決。

2 CRP的活性依賴其構(gòu)象轉(zhuǎn)變

上述這些矛盾以及謎題,或許可以通過CRP在局部炎癥發(fā)生的構(gòu)象以及活性的變化來解答。pCRP的五聚體結(jié)構(gòu)在一定的條件下[53～56]被破壞,從而形成單體的亞基,即為mCRP。pCRP解離為mCRP的過程伴隨著二級結(jié)構(gòu)元件的丟失和三級結(jié)構(gòu)的顯著改變,這導(dǎo)致了mCRP獨(dú)有表位的表達(dá),也賦予了mCRP新的生物活性與功能[16,54,57～60]。

事實(shí)上,CRP變構(gòu)為mCRP會(huì)顯著增強(qiáng)其與各種配體之間的相互作用以及其激活補(bǔ)體的能力。實(shí)驗(yàn)表明,mCRP與天然的和經(jīng)過修飾的LDL有強(qiáng)烈的結(jié)合,而pCRP與LDL只有低至中度的結(jié)合[60]。此外,mCRP在游離狀態(tài)和結(jié)合狀態(tài)下均可與C1q有相互作用,而pCRP僅在與多價(jià)配體結(jié)合后才能結(jié)合C1q[16]。mCRP通過結(jié)合C1q激活或者抑制經(jīng)典補(bǔ)體途徑,這取決于mCRP是處于游離狀態(tài)還是表面結(jié)合狀態(tài)[16]。后續(xù)研究進(jìn)一步揭示,mCRP通過結(jié)合細(xì)胞表面的C1q、因子H和C4b等補(bǔ)體成分,發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及壞死細(xì)胞的非炎癥清除作用[15,61]。另外,mCRP還可以在短時(shí)間內(nèi)(4 h)通過頂端刺激人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,上調(diào)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、IL-6、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和E-選擇素(CD62E)等因子的表達(dá),進(jìn)而激活內(nèi)皮細(xì)胞[17],而pCRP則需要較長時(shí)間(24 h)[17,62]。這些研究說明,之前發(fā)現(xiàn)的CRP的相關(guān)功能很可能是pCRP發(fā)生構(gòu)象變化解聚為mCRP所致。

3 炎癥局部發(fā)生CRP變構(gòu)并增強(qiáng)其生物學(xué)活性

mCRP的生物活性明顯增強(qiáng),說明mCRP可能是一種被激活的CRP變體,而pCRP則只是mCRP的前體,是一種基礎(chǔ)狀態(tài)的結(jié)構(gòu)。然而,自從mCRP的概念提出以來,關(guān)于mCRP的生物學(xué)活性已經(jīng)爭論了幾十年。主要的問題是,pCRP的分子結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定,而mCRP的制備則需要對pCRP進(jìn)行高度變性處理。因此,識別具有病理生理相關(guān)性的pCRP解離途徑是解決這一問題的關(guān)鍵。通過電鏡成像、免疫熒光等途徑,Ji等[54]發(fā)現(xiàn)pCRP與受損的生物膜(包括脂質(zhì)體和細(xì)胞膜)結(jié)合可導(dǎo)致其部分構(gòu)象快速的變化,進(jìn)而解聚為mCRP,期間還伴隨著補(bǔ)體系統(tǒng)的活化。另外,有研究發(fā)現(xiàn)pCRP在壞死細(xì)胞和活化的血小板膜表面也可以以溶血蛋白依賴的方式結(jié)合和解離[56]。受損細(xì)胞膜誘導(dǎo)的pCRP解聚進(jìn)一步揭示了mCRP的顯著積累和有效作用最有可能發(fā)生在炎癥位點(diǎn),即損傷壞死細(xì)胞和受損細(xì)胞膜富集的地方。使用高特異性抗體的免疫組化分析顯示,在AS斑塊[56,63]、糖尿病[64]以及腦卒中[65]等疾病中,局部病變部位存在的CRP主要亞型都是mCRP,而不是pCRP。病灶處pCRP的解聚不僅用于增強(qiáng)其生物學(xué)活性的表達(dá),還是一個(gè)緩沖機(jī)制,避免了急性炎癥期pCRP濃度急劇升高而導(dǎo)致的全身性效應(yīng),這也為我們解釋了CRP極有可能是通過構(gòu)象的改變從而實(shí)現(xiàn)其對炎癥反應(yīng)的精細(xì)調(diào)控。

迄今發(fā)現(xiàn)的所有pCRP解聚生成mCRP的途徑都與局部炎癥條件有關(guān),如細(xì)胞膜受損[54,56,61]、病理蛋白質(zhì)聚集[66]和活化細(xì)胞釋放的微粒[55]等。另外,活化的巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞的直接合成也是mCRP的一個(gè)來源[67],但是這條途徑也與炎癥相關(guān)。因此,pCRP可能只是作為全身炎癥的標(biāo)志物,而mCRP則是局部炎癥的活躍分子。盡管如此,如果局部形成的mCRP能夠釋放到循環(huán)中,它極有可能成為比pCRP更好的潛在炎癥標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn),循環(huán)系統(tǒng)中的細(xì)胞微泡上就攜帶有mCRP[55]。另有研究報(bào)道,mCRP自身抗體與自身免疫病[68～70]等全身性炎癥疾病密切相關(guān)。因此,相較于pCRP,mCRP可能是一種更好的炎癥標(biāo)志物。最近,Zhang等[71]優(yōu)化了血漿中檢測mCRP的ELISA方法,該檢測方法可重復(fù),而且靈敏度非常高(達(dá)到1 ng/mL)。這為研究mCRP與AS以及其他炎癥疾病之間的關(guān)系提供了一個(gè)非常簡捷有效的工具。

4 mCRP活性調(diào)節(jié)的機(jī)制研究

mCRP在炎癥各方面的作用正在逐步被人們發(fā)現(xiàn),但是mCRP的具體作用機(jī)制仍不太清楚。研究發(fā)現(xiàn),從不同的制備方法中獲得的mCRP會(huì)表現(xiàn)出明顯不同的生物學(xué)活性。通過尿素變性pCRP和基因重組兩種方法制備的mCRP,雖然它們都表達(dá)相同的表位,但后者卻具有更強(qiáng)的促炎活性,例如:與LDL的結(jié)合力更強(qiáng)[60];具有較強(qiáng)的結(jié)合補(bǔ)體C1q并進(jìn)一步激活補(bǔ)體的能力[16];可激活HAECs細(xì)胞,促進(jìn)單核細(xì)胞與HAECs細(xì)胞的黏附[62]。然而,隨著亞基間二硫鍵的還原,來自pCRP脲變性的mCRP會(huì)表現(xiàn)出與重組mCRP類似的活性,說明亞基間二硫鍵是mCRP功能的一個(gè)重要開關(guān)[58]。每個(gè)CRP亞基都包含兩個(gè)進(jìn)化保守的半胱氨酸殘基(Cys36和Cys97),它們形成二硫鍵以穩(wěn)定亞基的疏水核心。當(dāng)pCRP解離為單體亞基時(shí),二硫鍵才會(huì)被還原,說明pCRP的解離是亞基間二硫鍵還原的先決條件[72]。硫氧還蛋白是一種普遍存在的對二硫鍵氧化還原穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要的還原酶,研究發(fā)現(xiàn)它可以高效還原mCRP,而且mCRP還與硫氧還蛋白在AS斑塊中共存[58],說明mCRP的還原可能發(fā)生在局部炎癥中。在半胱氨酸突變的mCRP中,人們也得到了相似的結(jié)果[58]。這些結(jié)果表明,亞基間二硫鍵是調(diào)節(jié)mCRP活性的重要開關(guān)。

FcγRⅢ(CD16)是mCRP的受體。mCRP通過與CD16的相互作用,可以延緩中性粒細(xì)胞凋亡,并誘導(dǎo)其活化、黏附和遷移;也可以激活HAECs細(xì)胞,刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生活性氧。然而,研究發(fā)現(xiàn)添加CD16的阻斷劑僅能少部分抑制mCRP的活性[62,73],這說明細(xì)胞上還存在有其他更重要的mCRP受體。脂筏是細(xì)胞膜上特有的信號傳遞平臺,細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)的許多重要組成部分,如G蛋白偶聯(lián)受體、表皮生長因子受體和T細(xì)胞受體等,要么是組成性地駐留在脂筏中,要么是在特定的刺激下迅速被募集到脂筏中。研究報(bào)道,mCRP可以直接插入內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜富含膽固醇的脂筏微區(qū)[57]并與之結(jié)合,繼而激活內(nèi)皮細(xì)胞;通過MβCD(methylβ-cyclodextrin)和制霉菌素破壞脂筏的結(jié)構(gòu),能有效地抑制mCRP對內(nèi)皮細(xì)胞的活化[57]。因此,脂筏可能是mCRP在細(xì)胞膜上的主要受體,與脂筏的相互作用,可以給予mCRP特有的優(yōu)勢去激活各種信號元件。上述結(jié)論在一些實(shí)驗(yàn)研究中得到證實(shí)。例如:mCRP可以通過脂筏介導(dǎo)其與單核細(xì)胞以及血小板的結(jié)合[56];脂筏的破壞可以逆轉(zhuǎn)mCRP在內(nèi)皮細(xì)胞纖維蛋白凝塊形成中的促進(jìn)作用[74]。

進(jìn)一步的深入研究發(fā)現(xiàn),mCRP上存在一段在進(jìn)化中非常保守的序列——膽固醇結(jié)合基序35～47(cholesterol binding sequence,CBS;aa 35～47),而且該序列是負(fù)責(zé)介導(dǎo)mCRP與多種配體結(jié)合的關(guān)鍵序列[57,75]。例如:mCRP與脂蛋白ApoB、補(bǔ)體成分C1q以及膜脂成分膽固醇等多種配體的結(jié)合,都可以被合成的CBS多肽抑制,而其他CRP的多肽序列則沒有此功能[75]。除此之外,mCRP的C-端八肽(aa 199～206)被認(rèn)為是mCRP插入脂筏的主要決定因素[57]。結(jié)構(gòu)分析顯示,在pCRP中,CBS位于亞基的疏水核心,而C-端八肽位于亞基之間相互作用的界面。隨著pCRP在細(xì)胞膜上的解離,CBS序列暴露出來。然后,mCRP通過CBS與膽固醇結(jié)合,并通過其C-端八肽插入脂筏,激活對應(yīng)的下游信號分子,進(jìn)而發(fā)揮其相應(yīng)的生物學(xué)功能[57]。

5 總結(jié)

CRP在AS中的作用其實(shí)是非常復(fù)雜的。在炎癥微環(huán)境中,pCRP通過各種途徑解聚為mCRP[54～56,66]。在AS的早期,CRP 水平只有少量升高,mCRP的含量也相對較少,這時(shí),mCRP通過調(diào)節(jié)補(bǔ)體途徑[15～16,61]和LDL的代謝[13,22,35,60],促進(jìn)損傷物質(zhì)的清除,起到保護(hù)以及緩解AS的作用;隨著AS的進(jìn)展,血液中的pCRP濃度急劇升高,病灶處大量的壞死細(xì)胞也為CRP提供了足量的變構(gòu)配體,同時(shí)CRP亞基間的二硫鍵進(jìn)一步還原,使其暴露出更多的CBS位點(diǎn),導(dǎo)致單核細(xì)胞、血小板以及補(bǔ)體等的過度活化,從而發(fā)揮其促炎作用,最終促進(jìn)AS的發(fā)展以及血栓的形成(圖1)。這種多層次的級聯(lián)機(jī)制使CRP可以通過其構(gòu)象變化,完成其對炎癥的精細(xì)調(diào)控。但是,對于mCRP在AS整個(gè)進(jìn)程中的作用及具體分子機(jī)制,目前還沒有一個(gè)完整的、清晰的以及系統(tǒng)的認(rèn)識。需要指出的是,CRP不同構(gòu)型的研究可為我們提供一種新的思路,也可為我們構(gòu)建新的AS動(dòng)物模型提供幫助與指導(dǎo),這對于理解CRP不同亞型在AS發(fā)展過程中的確切功效也有很大幫助。除此之外,通過干預(yù)CRP的構(gòu)象轉(zhuǎn)換以及mCRP發(fā)揮作用的途徑,也許能夠幫助人們找到治療CVD的有效方法。