嚙齒類動物子宮內(nèi)膜異位癥模型的研究進展*

時 光 趙瑞華

(中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院婦科，北京 100053)

子宮內(nèi)膜異位癥(EM，簡稱內(nèi)異癥)是指子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮腔以外的部位，以疼痛、不孕、盆腔包塊為主要臨床表現(xiàn)的疾病[1-2]。5%～10%的育齡期婦女患有內(nèi)異癥，且50%的內(nèi)異癥患者合并不孕[2-3]。目前內(nèi)異癥的發(fā)病機理尚不明確，應(yīng)用有效的動物模型對內(nèi)異癥的發(fā)病機制開展研究，并進行靶向治療尤為重要[4]。目前公認的內(nèi)異癥發(fā)病機制是Sampson的經(jīng)血逆流理論[5]，在此理論基礎(chǔ)上建立了多種內(nèi)異癥模型。

內(nèi)異癥動物模型建立方法包括兩種：一種為自發(fā)的動物模型，多是以非人靈長類動物作為研究對象建立動物模型，因其具有自發(fā)性的月經(jīng)，與人的內(nèi)異癥形成的經(jīng)血逆流學(xué)說較為相似，更加符合內(nèi)異癥的發(fā)病特點，但由于模型建立耗時長，實驗代價較大，且有倫理限制，現(xiàn)很少應(yīng)用；另一種為誘發(fā)的動物模型，主要的動物選擇為嚙齒類動物。本篇文章主要對誘發(fā)性子宮內(nèi)膜異位癥模型進行綜述。

1 造模前準備

在誘導(dǎo)動物模型之前，需要進行陰道分泌物的涂片以確定動情周期，選擇動情周期規(guī)律(至少檢測兩個連續(xù)4 d的動情周期)動物進行模型的誘導(dǎo)[6-8]。不同研究選用動情周期的不同期分別建立模型。研究中有選擇動情前期[6]，動情間期[7]或動情后期[8]進行子宮切除，認為動情后期或間期的內(nèi)膜與人經(jīng)期的內(nèi)膜相似，從而模擬經(jīng)血逆流的理論。另外，在模型建立之前，有些研究將動物進行卵巢去勢手術(shù)并給予雌激素或孕馬血清促性腺激素(PMSG)[9-14]，使大鼠處于統(tǒng)一的標準，且在造模前給予雌激素刺激子宮內(nèi)膜組織的生長[15]，使其處于相同的卵巢周期，如動情期，從而排除個體動物因為不同的性激素水平而導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜病灶發(fā)展過程中的差異[16]。

2 動物模型的建立

2.1 同源模型的建立

同源模型中子宮內(nèi)膜來源于嚙齒類動物的子宮，采用縫合或擴散的方式種植于腹腔。主要包括同種自體移植及同種異體移植。

同源誘導(dǎo)的內(nèi)異癥模型最早為Vernon和Wilson[17]提出，主要為自體移植。腹部切口暴露子宮，切除一側(cè)子宮，縱向剖開，分為5 mm×5 mm的片狀，應(yīng)用(6-0)的非可吸收線將內(nèi)膜面垂直固定于腹壁。并于移植后的2周，剖腹檢查子宮內(nèi)膜的黏附情況及活性。在Celik等[18]的研究中，從子宮角切除0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm的片狀內(nèi)膜黏附于右側(cè)腹壁接近動脈的位置。在Rothmund等[19]的研究中，造模前給予所有的大鼠雌激素(50 μg/kg)每周兩次，開腹后，在子宮輸卵管處及子宮宮頸處結(jié)扎一側(cè)子宮角，縱形切口暴露內(nèi)膜并且將子宮角分為4片，每片6 mm×3 mm。每側(cè)腹壁分別縫2片子宮角，內(nèi)膜面朝向腹腔，關(guān)腹。內(nèi)異癥誘導(dǎo)后14 d進行二次手術(shù)。

同種異體移植的方法主要是切除同源供體鼠的子宮，移植于受體鼠腹腔。研究中切除大鼠子宮，并將內(nèi)膜層與肌層分開，子宮內(nèi)膜碎片縫合在腹壁近血管處。術(shù)后3 d連續(xù)皮下注射雌激素[20]。在Taniguchi等[21]的研究中，供體鼠及受體鼠均行卵巢去勢手術(shù)并且皮下注射雌激素，在卵巢去勢2周后，切除供體鼠的子宮，縱向切開并切碎，切碎后加入500 μL鹽水，以1∶2供體子宮與受體子宮比例移植，并注入腹腔，每只鼠約注射50 mg的子宮組織。在Li等[11]的研究中，注射PMSG 48 h后，取供體鼠的子宮，分離子宮肌層后，將子宮內(nèi)膜細胞懸液注入卵巢去勢的受體CD-1小鼠，輕柔的按摩使組織碎片擴散。術(shù)后2周及造模前4 d，受體小鼠皮下注射雌二醇，之后每4 d注射一次，維持內(nèi)異癥的發(fā)展。

2.2 異源模型的建立

異源內(nèi)異癥動物模型中，應(yīng)用人子宮內(nèi)膜組織腹腔或皮下注射到免疫缺陷的小鼠體內(nèi)[22]。在Perelló等[23]的研究中，取婦科良性疾病手術(shù)婦女的子宮內(nèi)膜種植于裸鼠體內(nèi)。在Yesildaglar的研究中，內(nèi)異癥患者的內(nèi)膜細胞經(jīng)皮下種植于嚴重的結(jié)合性免疫缺陷(SCID)的小鼠體內(nèi)[24]。在Delgado-Rosas等[25]的研究中，將60 d緩釋的無菌雌激素膠囊植入36只卵巢去勢的裸鼠頸部。4 d后，取自然月經(jīng)周期捐贈卵母細胞的無內(nèi)異癥者新鮮的子宮內(nèi)膜。將子宮內(nèi)膜切成3 mm×3 mm的碎片，應(yīng)用黏合劑將內(nèi)膜碎片貼于每只小鼠的腹壁。在Herington等[12]的研究中，在無胸腺的裸鼠進行卵巢去勢手術(shù)后5～10 d，將人的內(nèi)膜組織腹腔注射建立動物模型。提供者取增殖期的內(nèi)膜樣本[26]。提供內(nèi)膜的女性需要有規(guī)律的月經(jīng)周期，無藥物治療史或手術(shù)分離黏連或內(nèi)膜疾病或內(nèi)異癥病史，血清孕激素<1.5 ng/mL，并排除近3個月內(nèi)有激素治療的或其他的可能影響研究結(jié)果者[12]。

3 新型的子宮內(nèi)膜異位癥模型建立

3.1 熒光標記子宮內(nèi)膜異位癥模型

一些模型應(yīng)用綠色熒光蛋白GFPcDNA作為供體或受體在位內(nèi)膜組織的標記物[7, 13, 15, 27-30]。應(yīng)用綠色熒光蛋白小鼠移植的內(nèi)膜碎片移植到腹腔，可以幫助分析形態(tài)學(xué)改變及血管生成的過程。病灶多為囊性和血管生成，形態(tài)學(xué)標志如子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)[28]。在異源的模型也應(yīng)用熒光作為標記物，卵巢去勢及激素替代的裸鼠注射熒光標記的人子宮內(nèi)膜碎片[31]。

3.2 腹腔鏡輔助子宮內(nèi)膜異位癥模型建立

近年來有學(xué)者通過使用腹腔鏡的方法建立子宮內(nèi)膜異位癥模型。在Peterse等的研究中，從小鼠腹部尾端到劍突的3.5 mm切口，置入內(nèi)鏡，在腹腔鏡引導(dǎo)下從動物的左右兩側(cè)置入兩個14 G的靜脈內(nèi)導(dǎo)管，將1 mm3內(nèi)膜片植入腹腔。左，右側(cè)腹壁各植入4片內(nèi)膜，子宮底與遠端結(jié)腸之間植入2片內(nèi)膜。操作持續(xù)時間為20 min[8]。Peterse的另一個實驗，通過錄像將腹腔鏡誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜異位癥的步驟展現(xiàn)出來。卵巢去勢的C57BL/6JRj小鼠模仿人的雌孕激素序貫(皮下注射100 ng 17β雌二醇3 d，休息3 d后，背部植入孕酮聯(lián)合皮下注射5 ng 17β雌二醇)人工周期的方法，后應(yīng)用芝麻油的刺激誘導(dǎo)內(nèi)膜的蛻膜化。孕激素撤退4 d后月經(jīng)來潮[32]，取經(jīng)期的子宮內(nèi)膜，應(yīng)用腹腔鏡的方法[8]將經(jīng)期內(nèi)膜種植于同源的受體小鼠的腹腔誘導(dǎo)內(nèi)異癥產(chǎn)生[33]，該方法較準確地模擬了Sampson的經(jīng)血逆流理論[5]。

3.3 嵌合人類/小鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型

在Brunertran的研究中，為了證明人免疫細胞在內(nèi)異癥中的作用建立了嵌合人類/小鼠的實驗?zāi)Ｐ汀Ｈo內(nèi)異癥月經(jīng)規(guī)律的捐獻者的增生期子宮內(nèi)膜組織，同時要求捐獻者滿足子宮內(nèi)膜厚≥9 mm(經(jīng)陰道彩超確定)，血清孕激素≤1.5 ng/mL。將獲得的內(nèi)膜組織放入培養(yǎng)液中培養(yǎng)[34]，并從捐贈者50 mL的血樣本中分離人外周血單核細胞及中性粒細胞。在Rag2γ(c)小鼠進行卵巢去勢手術(shù)后迅速在皮下種植緩釋的雌激素膠囊。子宮內(nèi)膜組織培養(yǎng)24 h后，注射小鼠體內(nèi)。部分小鼠在人的內(nèi)膜組織注射到腹腔前，注射單獨做過標記的人類淋巴細胞。通過實驗證明在小鼠體內(nèi)，免疫細胞具有限制腹膜內(nèi)疾病的能力，表明嚙齒類動物的免疫系統(tǒng)是具有防止內(nèi)異癥發(fā)展的能力[14]。

3.4 其他部位的子宮內(nèi)膜異位癥模型

內(nèi)異癥的誘導(dǎo)模型中，除了將內(nèi)膜組織縫合或注射進入腹腔外，還可以將內(nèi)膜組織種植于其他部位誘導(dǎo)內(nèi)異癥的模型。如將子宮內(nèi)膜組織移植在腓腸肌建立肌肉內(nèi)異癥模型。同時也可以將子宮組織縫于小腸系膜手術(shù)誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜異位癥[35-38]。

4 嚙齒類動物誘導(dǎo)內(nèi)異癥模型的結(jié)果分析

在對動物進行模型誘導(dǎo)后，需要二次手術(shù)以確定模型建立是否成功。因研究不同兩次手術(shù)之間的間隔時間以1周、2周、3周、4周、6周、8周各異[8，16，18，22，39-40]。在Bruner-tran等[41]的研究中，不同時間人的內(nèi)膜碎片觀察結(jié)果如下：人的內(nèi)膜碎片在第4小時會與小鼠腹壁松散黏連，輕輕地用鑷子可以將組織分開。到第16小時內(nèi)膜組織與小鼠的間皮緊密黏連，在組織不損傷的情況下不能將其分離。顯微鏡檢查表明小鼠間皮細胞與人體組織的明顯包裹，可能影響異位人內(nèi)膜與小鼠腹壁表面穩(wěn)定性。到第24小時，來源于人類組織的鼠源性新生血管生成明顯，到第5天病灶的血供建立。第10天大體觀察表明血管生成繼續(xù)發(fā)展，顯微鏡分析表明異位內(nèi)膜組織重塑。

內(nèi)異癥病灶進一步通過病灶的大小表現(xiàn)，較大的標記為“a”，較小的標記為“b”及總體的量，通過標準的公式進行計算：V=a×b2×0.5[42]。在人體組織腹腔內(nèi)誘導(dǎo)5 d后，判斷腹腔黏連的有無及異位病灶的內(nèi)膜增長的出現(xiàn)及發(fā)展。通過Lauder等[43]所描述的方法對黏連的數(shù)量、強度及分布進行評分。0分：無黏連；1分：薄型黏連；2分：多于1個的薄型黏連；3分：厚的黏連帶；4分：厚的表面附著黏連；5分：非常厚的血管生成的黏連或者多于1個表面附著黏連[41]。Quereda等對種植物的生長及內(nèi)異癥的階段進行分級，分為4級。0級:無種植物體，或種植物較小未形成囊腫；Ⅰ級:種植物形成直徑<2 mm囊泡，或大于2 mm的堅實的組織；Ⅱ級:種植物形成直徑≥2 mm但<4.5 mm(小于種植最初的大小)的液性囊泡；Ⅲ級:囊泡的直徑與種植物最初大小相似，或比原始的種植物更大(≥4.5 mm)。實驗性子宮內(nèi)異癥階段：微小，三種移植物的總的生長等級≤2；輕度，總的生長等級為3或4；中度，總的生長等級為5或6；重度，總的生長等級≥7。

5 嚙齒類動物誘導(dǎo)內(nèi)異癥模型的評價

嚙齒類動物子宮內(nèi)膜異位癥模型的優(yōu)點是嚙齒類動物的成本相對較低并且比非人靈長類動物更容易獲得。同源模型中，選擇具有相似基因特點的近交系動物，避免異位組織的排斥反應(yīng)[16]，有利于進行長期的研究，且具有可重復(fù)性。同源內(nèi)異癥手術(shù)誘導(dǎo)模型具有完整的免疫系統(tǒng)，適合進行內(nèi)異癥機制的研究，包括在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜，并且可用在研究藥物的功能和內(nèi)異癥的免疫及炎癥反應(yīng)。異源內(nèi)異癥小鼠模型，一些裸鼠是以人類子宮內(nèi)膜為基礎(chǔ)，沒有完整的免疫系統(tǒng)的，它們可以被用來評價疾病的病因及用于藥物和激素調(diào)節(jié)的治療性檢測[44]。

應(yīng)用嚙齒類動物誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜異位癥模型最大的缺點是人與嚙齒類動物屬于不同物種，具有不同的生理特點，通過嚙齒類動物得到的結(jié)果是否適用于人仍然是具有爭議的。此外，部分手術(shù)步驟是值得懷疑的。嚙齒類動物沒有月經(jīng)，內(nèi)異癥必須通過自體移植子宮組織進行誘導(dǎo)，在大部分嚙齒類動物研究中，子宮碎片包括肌層，這樣可能會影響病灶的發(fā)展，并且當評價異位病灶的重量及大小的時候，肌層占一定比例。另外手術(shù)后產(chǎn)生的炎癥及可能存在其他的潛在的影響，未來研究中需要對腹腔手術(shù)步驟進行規(guī)范以確保造模方式的可信性[12]。

鑒于傳統(tǒng)剖腹手術(shù)中的問題，創(chuàng)新的應(yīng)用腹腔鏡輔助造模的方法正在發(fā)展，與傳統(tǒng)的剖腹手術(shù)或盲目的腹腔內(nèi)注入子宮內(nèi)膜組織相比，創(chuàng)新的方法創(chuàng)傷更小，成功率更高[8]。同時通過腹腔鏡引導(dǎo)可進行可視化操作。子宮內(nèi)膜碎片組織可以種植在內(nèi)異癥病人典型的發(fā)病位置，增加了模型的比較醫(yī)學(xué)價值[45]。

6 結(jié)論

動物模型對于研究人類子宮內(nèi)異癥的病理生理機制、疾病的發(fā)展和疾病的治療方法尤為重要。本綜述介紹了不同的建立子宮內(nèi)膜異位癥模型的方法，并且介紹了不同方法的步驟及模型的結(jié)果，評價。當選擇一種動物模型的時候，應(yīng)該考慮具體的影響因素，包括時間、花費、研究目的與使用的方法，視情況而定。