樹鼩的標(biāo)準(zhǔn)化研究與應(yīng)用進(jìn)展*

王文廣 匡德宣 仝品芬 李 娜 陸彩霞 罕園園 孫曉梅 代解杰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心、云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、云南省眼科疾病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)樹鼩標(biāo)準(zhǔn)化與應(yīng)用研究省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì), 昆明 650118)

樹鼩(TupaiaBelangeris， Tree Shrew)是一種形似松鼠、吻部較長(zhǎng)的小型哺乳動(dòng)物，目前在分類學(xué)上屬于攀鼩目，介于靈長(zhǎng)目與食蟲目之間。樹鼩主要分布于南亞、東南亞及我國南部如云南、貴州、廣西、廣東、海南等省區(qū)，其中應(yīng)用最為廣泛的是中緬樹鼩滇西亞種。樹鼩與靈長(zhǎng)類動(dòng)物的進(jìn)化關(guān)系比嚙齒類動(dòng)物更接近，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域有很大的應(yīng)用潛力，世界衛(wèi)生組織在20世紀(jì)90年代就建議用樹鼩代替大型靈長(zhǎng)類動(dòng)物進(jìn)行科學(xué)實(shí)驗(yàn)。

早期研究中使用的樹鼩大多來自野外，它們的遺傳背景不清，健康狀況未知，且個(gè)體差異較大，不利于科學(xué)研究的順利進(jìn)行，因此需要大力開展樹鼩的標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)。我國從20世紀(jì)70-80年代就開始了樹鼩人工馴養(yǎng)繁殖研究，研究力量主要集中在昆明，如中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所和昆明醫(yī)科大學(xué)等科研院校。在國家和地方科技項(xiàng)目的不斷大力支持下，科研人員對(duì)樹鼩的標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)工作進(jìn)行了系統(tǒng)性研究，并取得了突破性成果。

1 樹鼩的主要生物學(xué)特性

1.1 樹鼩的體型特征

樹鼩形似松鼠，但吻部較長(zhǎng)，耳朵較短，尾毛發(fā)達(dá)向兩側(cè)分散。成年樹鼩一般體長(zhǎng)14～19 cm，體質(zhì)量120～180 g。前后足均有五趾，每趾都有尖爪。犬齒細(xì)小，前臼齒寬大。頭骨的眶后突發(fā)達(dá)，形成一骨質(zhì)眼球，腦室較大。體毛粟黃色，頜下及腹部為淺灰色。

1.2 樹鼩的野外習(xí)性

野生樹鼩多在丘陵、平原近農(nóng)舍旁的灌木丘林里活動(dòng)，在土丘中挖洞作穴，亦有在樹上筑巢，雌雄成對(duì)生活，不群居。常見單個(gè)出沒于叢林或村落，行動(dòng)靈活，善于攀緣。樹鼩是雜食性動(dòng)物，常以昆蟲、小鳥、五谷野果為食，更喜甜食如蜂蜜。

1.3 樹鼩的籠養(yǎng)特性

樹鼩常在籠內(nèi)作翻滾竄跳活動(dòng)，以黎明和黃昏時(shí)最為活躍。樹鼩好動(dòng)能耗大，飼料中應(yīng)有足夠的蛋白質(zhì)，并搭配合適的水果，以保證營養(yǎng)。兩雄好斗，不宜同籠，宜將雌雄樹鼩1∶1配對(duì)。樹鼩生性膽小，易受驚，如長(zhǎng)時(shí)間處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致采食量下降、生長(zhǎng)受阻、繁育率下降等。因此，籠養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意控制噪聲，溫度維持在20～28 ℃為宜，濕度應(yīng)控制在40%～70%之間。

1.4 樹鼩的繁育特性

樹鼩性成熟時(shí)間約為6個(gè)月，懷孕期42 d左右，每胎產(chǎn)仔2～4只，每年3-8月為生殖季節(jié)。母樹鼩懷孕后應(yīng)盡早分籠單養(yǎng)，保證溫和的孕育環(huán)境，受刺激后易流產(chǎn)或產(chǎn)后食仔和拒養(yǎng)。子樹鼩初生時(shí)體質(zhì)量約10 g，頭身長(zhǎng)(6.4±0.4) cm，尾長(zhǎng)(3.8±0.29) cm，全身無毛，皮膚粉紅，眼閉，只會(huì)蠕動(dòng)，5～6 d皮膚變黑，開始長(zhǎng)毛，14～21 d開眼，3周開始走動(dòng)，4周可跳動(dòng)，5～6周斷奶而獨(dú)立生活。

2 樹鼩的標(biāo)準(zhǔn)化研究

樹鼩的標(biāo)準(zhǔn)化工作一直是在國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源發(fā)展規(guī)劃的戰(zhàn)略指導(dǎo)下有序推進(jìn)的，持續(xù)受到科技部科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目和云南省科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)計(jì)劃項(xiàng)目的大力支持，尤其是在國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“實(shí)驗(yàn)用樹鼩的標(biāo)準(zhǔn)化研究和人類重大疾病樹鼩模型創(chuàng)建與應(yīng)用集成示范”順利實(shí)施后，樹鼩種質(zhì)資源基地建設(shè)已經(jīng)完成，樹鼩質(zhì)量技術(shù)體系日趨完善，樹鼩團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)也得以頒布實(shí)施，其標(biāo)準(zhǔn)化研究水平得到空前提高。

樹鼩標(biāo)準(zhǔn)的制定是推動(dòng)樹鼩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化的有力保證，早在2010年11月云南省就發(fā)布了地方標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)樹鼩(DB53/T328.1-328.5-2010)》，并于2011 年3月1日正式實(shí)施，主要由昆明醫(yī)科大學(xué)制定，其內(nèi)容共分為5個(gè)部分：1. 實(shí)驗(yàn)樹鼩(第1部分)：微生物學(xué)等級(jí)及檢測(cè)(DB53/T 328.1); 2. 實(shí)驗(yàn)樹鼩(第2部分)：寄生蟲學(xué)等級(jí)及檢測(cè)(DB53/T 328.2); 3. 實(shí)驗(yàn)樹鼩(第3部分)：遺傳學(xué)質(zhì)量控制(DB53/T 328.3); 4.實(shí)驗(yàn)樹鼩(第4部分)：配合飼料(DB53/T 328.4); 5.實(shí)驗(yàn)樹鼩(第5部分)：環(huán)境及設(shè)施(DB53/T 328.5)。2012年5月又發(fā)布了由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所和昆明理工大學(xué)制定的實(shí)驗(yàn)樹鼩云南省地方標(biāo)準(zhǔn)第6～10部分，即飼養(yǎng)管理、生物學(xué)特性數(shù)據(jù)測(cè)定、實(shí)驗(yàn)基本操作技術(shù)、HCV病毒感染樹鼩原代肝細(xì)胞模型制作和 HCV病毒感染樹鼩模型制作。云南省樹鼩地方標(biāo)準(zhǔn)的頒布填補(bǔ)了當(dāng)時(shí)我國實(shí)驗(yàn)樹鼩無質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的空白，為樹鼩人工繁殖和實(shí)驗(yàn)研究提供了有力的技術(shù)支持。

近年來，隨著大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的積累，人們也不斷地對(duì)樹鼩的地方標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂和完善，并努力向著應(yīng)用范圍更廣的樹鼩國家標(biāo)準(zhǔn)靠近，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所制定的6項(xiàng)樹鼩團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)于2017年5月獲得全國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)頒布，分別是(1)T/CALAS 08-2017 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 樹鼩微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)；(2)T/CALAS 09-2017 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 樹鼩寄生蟲學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)；(3)T/CALAS 10-2017 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 樹鼩環(huán)境與設(shè)施；(4)T/CALAS 11-2017 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 樹鼩遺傳質(zhì)量控制；(5)T/CALAS 12-2017 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 樹鼩配合飼料；(6)T/CALAS 13-2017 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 樹鼩病理學(xué)診斷規(guī)范。該團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的頒布實(shí)施，為樹鼩作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)化提供更科學(xué)的技術(shù)支持，并有力推動(dòng)了樹鼩在全國范圍的推廣和應(yīng)用。

3 實(shí)驗(yàn)用樹鼩的應(yīng)用研究

3.1 感染性疾病模型的研究

先后有人甲肝、乙肝、丙肝和丁肝病毒感染樹鼩，均在樹鼩體內(nèi)發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制，并觀察到一定的臨床癥狀，其中以乙肝病毒和丙肝病毒模型研究成果較為突出。 Glebe等發(fā)現(xiàn)HBV 可有效感染成年樹鼩原代肝細(xì)胞，證明pre-S1結(jié)構(gòu)域是樹鼩肝細(xì)胞感染HBV必需的抗原，這一點(diǎn)與HBV感染人肝細(xì)胞的方式相似[1]。Yan等以人類HBV感染樹鼩原代肝細(xì)胞模型為基礎(chǔ)，成功證明了靈長(zhǎng)類動(dòng)物的鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白為HBV 感染肝細(xì)胞的特異性受體[2]。謝春志等[3]、馮悅[4]通過含HCV的人血清感染樹鼩，均發(fā)現(xiàn)樹鼩可感染人HCV。Barth等[5]研究發(fā)現(xiàn)樹鼩肝細(xì)胞上I型清道夫受體、CD81分子在HCV包膜粘合到樹鼩肝細(xì)胞中起了重要作用。隨后，Tong等[6]報(bào)道了樹鼩CD81分子、SR-BI分子和Claudin-1分子可介導(dǎo)HCV感染。就目前的研究資料看，除人和黑猩猩外，樹鼩是經(jīng)證實(shí)能感染人乙、丙型肝炎病毒的小型哺乳類動(dòng)物，可以彌補(bǔ)其他動(dòng)物如嚙齒類動(dòng)物和禽類動(dòng)物病毒性肝炎模型的不足。

流感病毒亦可感染樹鼩，研究發(fā)現(xiàn)H1N1流感病毒可能在樹鼩的上呼吸道復(fù)制，使其表現(xiàn)出輕微或中度的呼吸道癥狀及呼吸道的病理變化，發(fā)現(xiàn)廣泛分布于氣管和鼻黏膜的受體是sialic acid (SA)a2，6-gal，而肺組織中的主要受體是(SA)a2，3-gal[7]。

樹鼩還有望成為手足口病動(dòng)物模型，王文廣等[8]對(duì)3個(gè)月齡的樹鼩進(jìn)行EV71感染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其體溫、白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞水平均有升高趨勢(shì)；感染后2周，部分樹鼩表現(xiàn)出急性松弛性癱瘓癥狀，并伴有尿潴留，組織病理學(xué)檢查在腦、心、肺、脾、腎等部位發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的病理變化，表明EV71 病毒可感染幼齡樹鼩。Li等[9]用CA16 感染樹鼩后，在其多種器官以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)和糞便中發(fā)現(xiàn)高載量病毒，同時(shí)肺、腎等組織中也出現(xiàn)細(xì)胞損傷和炎性細(xì)胞侵潤(rùn)等病理反應(yīng)，說明樹鼩對(duì)CA16 具有敏感性，適合發(fā)展為研究CA16的潛在動(dòng)物模型。

另外，人們還發(fā)現(xiàn)登革病毒[10]、HSV病毒[11]、EB病毒[12]可感染樹鼩，可用來建立感染模型開展研究。

3.2 神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型

何保麗等[13]用β-淀粉樣蛋白(Aβ)側(cè)腦室注射建立樹鼩老年癡呆模型，從模型制作后第8天開始，治療組樹鼩連續(xù)30 d灌胃給予天麻素，通過RT-PCR檢測(cè)海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示天麻素能在一定程度上上調(diào)樹鼩海馬BDNF的表達(dá)。

Ma等[14]對(duì)樹鼩連續(xù)腹腔注射MPTP[3 mg/(kg·d-1)]，5 d后出現(xiàn)典型的帕金森運(yùn)動(dòng)癥狀，且紋狀體DA和DOPA水平顯著降低，腦中α-synuclein mRNA水平升高，提示樹鼩可能是研究PD 發(fā)病機(jī)制的潛在動(dòng)物模型。鄧苙等[15]的研究指出樹鼩MPTP模型與6-OHDA模型相比，PD 行為學(xué)特征更明顯，樹鼩的TH陽性神經(jīng)細(xì)胞呈雙側(cè)性減少，提示MPTP 經(jīng)腹腔注射是制備樹鼩PD 模型的理想方法。

有學(xué)者注射不同劑量嗎啡到樹鼩體內(nèi)以研究其耐受性和依賴性，注射嗎啡后同時(shí)使用納洛酮(1.25 mg/kg體質(zhì)量)，發(fā)現(xiàn)樹鼩出現(xiàn)誘導(dǎo)條件性位置厭惡和戒斷癥狀[16]。Shen等[17]使用樹鼩開展嗎啡成癮性研究，結(jié)果顯示肌肉注射嗎啡(5或10 mg/kg)30～60 min后樹鼩的運(yùn)動(dòng)活性顯著增加；條件性位置偏愛/厭惡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，樹鼩偏愛有嗎啡的盒子，而納洛酮誘導(dǎo)條件性位置厭惡；以上研究表明樹鼩可以成為成癮行為和神經(jīng)機(jī)制研究的候選者。

Meng等[18]利用樹鼩先后建立了社交挫敗模型、習(xí)得性無助模型及慢性溫和應(yīng)激模型，通過藥物抗抑郁實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氯丙咪嗪能夠逆轉(zhuǎn)抑郁動(dòng)物的社交退縮行為，氟西汀對(duì)習(xí)得性無助行為具有翻轉(zhuǎn)作用，而卡貝縮宮素則對(duì)興趣下降、社交退縮及習(xí)得性無助行為均具有顯著的治療效果[19]。

3.3 眼科疾病模型研究

樹鼩眼球解剖及視覺系統(tǒng)與人類有高度相似性，感光細(xì)胞以視錐細(xì)胞為主，對(duì)形覺剝奪環(huán)境極為敏感，是研究形覺剝奪性近視的極佳動(dòng)物模型。Siegwart和Norton[20]將自然睜眼后7 d、15 d、21 d、33 d、48 d、63 d樹鼩分別用半透明遮光板單眼剝奪12 d觀察眼軸的延長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)樹鼩近視的易感期的高峰時(shí)段大約發(fā)生在睜眼后15～45 d之間。周廣龍等[21]通過單眼形覺剝奪建立樹鼩弱視模型，發(fā)現(xiàn)形覺剝奪引起的神經(jīng)元損傷具有可恢復(fù)性，C-fos基因和蛋白可能參與了形覺剝奪視皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷及可塑性，結(jié)果顯示樹鼩有潛力成為良好的形覺剝奪弱視模型。

李妍等[22]采用基質(zhì)注射茄病鐮刀菌孢子的方法首次成功建立茄病鐮刀菌性角膜炎樹鼩模型，并發(fā)現(xiàn)促炎因子IL-1β和IL-6及抑炎因子IL-10在樹鼬茄病鐮刀菌性角膜炎炎癥反應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮重要作用。Samuels 等[23]向成年樹鼩眼睛前房中注射25 mg/mL的磁珠溶液，從而誘發(fā)青光眼，視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(RNFL)顯著減少，視神經(jīng)表現(xiàn)出與青光眼性視神經(jīng)病變相一致的組織病理學(xué)變化。

3.4 代謝疾病模型研究

Li等[24]采用高糖脂肪飲食與地塞米松聯(lián)合誘發(fā)了樹鼩2型糖尿病。Wu等[25]使用不同劑量的STZ (60、70和80 mg/kg)也建立了類似的2型糖尿病樹鼩模型。此外，有人通過高糖高脂肪飲食和4次STZ 注射成功建立了糖尿病腎病樹鼩模型，并通過實(shí)驗(yàn)證明骨髓移植也可以提高胰島素抵抗性[26]。

Xing等配置不同濃度的食用酒精溶液供樹鼩飲用，2周后引發(fā)酒精代謝酶改變和脂肪肝樣病理改變[27]，而Meng等人發(fā)現(xiàn)羅格列酮可以預(yù)防樹鼩的脂肪肝發(fā)育[28]。Zhang等[29]使用高脂肪、膽固醇和膽酸鹽飲食，成功地在樹鼩中誘發(fā)了非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，發(fā)現(xiàn)Poloxamer 407對(duì)脂蛋白脂肪酶的抑制改善了脂肪病的嚴(yán)重程度，減輕了炎癥，與小鼠脂肪肝病模型相比，樹鼩模型發(fā)病時(shí)間較短且癥狀更為明顯。

3.5 樹鼩細(xì)胞的開發(fā)和應(yīng)用

樹鼩細(xì)胞也是樹鼩資源的有機(jī)組成部分，同時(shí)也是重要的體外實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，目前文獻(xiàn)報(bào)道已經(jīng)成功分離培養(yǎng)的有樹鼩肺成纖維細(xì)胞[30]、脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞[31]、胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞[32]、小腸上皮細(xì)胞[33]、角膜內(nèi)皮細(xì)胞[34]、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[35]和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞等[36]。其中比較有示范性的應(yīng)用是干細(xì)胞治療，在國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAI01B00)支持下，解放軍昆明總醫(yī)院已建立樹鼩臍帶和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和鑒定技術(shù)體系及規(guī)范，建成可儲(chǔ)存10 000份的干細(xì)胞種子資源庫，制備儲(chǔ)存樹鼩臍帶和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞2 000份；建立了樹鼩臍帶和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外轉(zhuǎn)GFP基因標(biāo)記、BrdU標(biāo)記、DAPI標(biāo)記和順磁標(biāo)記，為研究間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的生物學(xué)行為提供了分析測(cè)試方法；以樹鼩代謝綜合征[37]、糖尿病[38]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型[39]為研究對(duì)象，進(jìn)行了樹鼩臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的療效評(píng)價(jià)，為干細(xì)胞臨床療法提供了技術(shù)參考。

4 樹鼩標(biāo)準(zhǔn)化研究的意義與展望

樹鼩是我國特色動(dòng)物資源，開展樹鼩的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化和種質(zhì)資源保存是一項(xiàng)國家戰(zhàn)略性任務(wù)，而建立標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?；臉潼毞N質(zhì)資源基地，是實(shí)現(xiàn)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化、生產(chǎn)規(guī)?；?、供應(yīng)商品化和服務(wù)社會(huì)化的根本前提，具有重要應(yīng)用價(jià)值和戰(zhàn)略意義。建立標(biāo)準(zhǔn)化樹鼩種質(zhì)資源，可有力促進(jìn)其在生命科學(xué)領(lǐng)域的推廣應(yīng)用，可為探討人類疾病致病機(jī)制和開發(fā)新型治療藥物等提供良好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，滿足生命科學(xué)和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求，促成相關(guān)科學(xué)研究的重大突破。樹鼩種質(zhì)資源基地的建立及標(biāo)準(zhǔn)化研究技術(shù)體系和成果，可為我國其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新品種的研發(fā)、保存和共享提供借鑒，共同促進(jìn)我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種質(zhì)資源保存工作的專業(yè)化和系統(tǒng)化。

未來樹鼩的標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)，要在地方樹鼩種質(zhì)資源基地的基礎(chǔ)上，逐步提升其規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化水平，不斷完善樹鼩標(biāo)準(zhǔn)并制定其國家標(biāo)準(zhǔn)，力爭(zhēng)建成國家級(jí)樹鼩種質(zhì)資源中心，同時(shí)積極開發(fā)適用于樹鼩實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)技術(shù)體系和試劑盒，加快推進(jìn)樹鼩細(xì)胞資源庫的建設(shè)和轉(zhuǎn)基因樹鼩的研究。