中藥對阿爾茲海默癥APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的治療作用研究進展*

徐慧琳 范 震 馮成強

(北京師范大學中藥資源保護與利用北京市重點實驗室,北京師范大學天然藥物教育部工程研究中心，北京 100875)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s diease，AD)，又稱老年癡呆，是慢性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，兩大主要病理特征為腦中β-淀粉樣蛋白 (bate amyloid protein，Aβ) 沉積成斑塊 (senile plaques，SP) 和tau蛋白過度磷酸化導致神經(jīng)原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)，并伴隨著神經(jīng)元突觸缺失，中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、氧化應激反應等特征[1]。患者臨床表現(xiàn)為腦萎縮、認知能力減退、記憶力下降、生活不能自理，最后死亡。隨著人口老齡化加劇，AD發(fā)病率不斷上升，嚴重危害老年人身體健康，已經(jīng)成為神經(jīng)醫(yī)學亟需解決的難題。

1 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠模型的特點

APP/PS1 轉(zhuǎn)基因模型是小鼠體內(nèi)表達突變的β淀粉樣蛋白前體swe 基因(β-amyloid precursor protein swe，APP swe) 和人類早老素1基因(presenilin 1246E，PS1246E)[2]。β淀粉樣蛋白前體(amyloid precursor protein，APP)經(jīng)β裂解酶、γ分泌酶水解生成Aβ，而突變的APP基因會加劇Aβ的沉積。該模型鼠能較早地表現(xiàn)出AD癥狀，其在4月齡時大腦皮層和海馬體中便出現(xiàn)了老年斑，在6～8月齡時能觀察到明顯老年斑的形成，在12月齡時斑塊沉積進一步增加[3]。除此之外該小鼠還具有tau蛋白過度磷酸化、小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞過度活化、中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應、神經(jīng)元結構改變、突觸缺失及認知功能障礙等方面的表型特點，與AD患者有著較高的一致性，是國內(nèi)外防治AD藥物篩選常用的動物模型，近年來該模型已廣泛應用到中醫(yī)藥防治AD的研究領域。

2 中藥對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的治療作用

2.1 與Aβ斑塊相關的作用

2.1.1減少Aβ斑塊沉積：Aβ在腦中過度積累形成斑塊，具有神經(jīng)毒性，能夠產(chǎn)生級聯(lián)反應，加劇AD。這種神經(jīng)毒性作用，屬于中醫(yī)“毒”的范疇，其中醫(yī)病理機制為“毒損腦絡”。故很多清熱解毒的中藥被應用于降低Aβ的研究。如出自唐代王燾《外臺秘要》的黃連解毒湯，由黃連、黃柏、黃芩、梔子4味苦寒藥物制成，是清熱解毒的經(jīng)典方劑，馮佩用高、中、低三個劑量的黃連解毒湯給3月齡小鼠連續(xù)灌胃6個月，并用RT-PCR檢測腦中β-淀粉樣前體蛋白基因表達量，發(fā)現(xiàn)各劑量的黃連解毒湯均能降低模型小鼠腦內(nèi)β-APP基因表達水平，其中中劑量組(433 mg/kg·d-1)效果顯著優(yōu)于西藥安理申對照組[4]。而楊文育等通過western blot和硫磺素 T 染色發(fā)現(xiàn)具有清心解毒、涼血開竅功效的清心開竅方能夠促進APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)AKT的表達， 并減少Aβ、GSK3α、βAPP的表達， 減少APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)皮質(zhì)及海馬區(qū)的老年斑數(shù)量[5]，其中GSK3α是GSK3的亞型，是γ分泌酶的關鍵激活劑，AKT 和 GSK3α 是 βAPP 和 Aβ 的上游調(diào)控蛋白，表達增加的AKT能使GSK3磷酸化，抑制其活化[6]，從而進一步抑制APP前體被分解為Aβ，降低其在腦中的含量。藏藥七十味珍珠丸(ratanasampil，RNSP)能夠改善大腦功能，具有安神、促進學習記憶的功效，閆清偉等通過給3月齡的APP/PS1小鼠連續(xù)灌胃12周，發(fā)現(xiàn)RNSP能夠延緩小鼠腦萎縮的進程，減少腦內(nèi)老年斑的沉積，降低腦內(nèi)BACE1裂解酶的表達量和Aβ1-42水平，改善小鼠認知能力[7]。

2.1.2改善Aβ的毒性作用:Aβ的毒性作用主要包括：使腦中膠質(zhì)細胞過度活化，炎癥因子大量釋放，誘發(fā)神經(jīng)炎癥；自由基及過氧化損傷導致的氧化應激反應；損傷神經(jīng)元突觸的傳導功能，神經(jīng)元結構變性等[8]。

2.1.2.1 抗炎癥的作用：近年來越來越多的研究表明，AD 患者腦中持續(xù)存在著慢性炎癥反應，表現(xiàn)為小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞過度活化、炎癥因子大量釋放[9]。淫羊藿次苷Ⅱ(ICS Ⅱ)是淫羊藿的活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗癌的作用，曾令榮等通過連續(xù)灌胃7個月的方法，發(fā)現(xiàn)ICS Ⅱ可顯著降低APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中APP、Aβ1-42、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)蛋白表達水平，降低炎癥因子COX-2、TNF-α蛋白表達水平，增加抗炎因子IL-10蛋白表達水平，其中Aβ與RAGE結合后可激活小膠質(zhì)細胞加速炎癥反應，因此ICS Ⅱ具有減輕APP/PS1小鼠炎癥反應的作用[10]。姜黃素是從姜黃屬中藥姜黃、莪術、郁金等的根莖中提取出的酚類色素，屬活血藥，具行氣祛風、活血止痛之效，韓園等用含姜黃素的飼料持續(xù)喂養(yǎng)4月齡轉(zhuǎn)基因小鼠5個月，發(fā)現(xiàn)該時期的給藥組小鼠腦中尚未出現(xiàn)相關病理學和相應的行為學改變，說明口服姜黃素可以用于早期預防性治療，改善轉(zhuǎn)基因小鼠的學習和記憶能力，并下調(diào)海馬中高遷移率族蛋白1(high mobility group box protein-1，HMGB1)水平，減少其下游晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor foradvanced glycationendproducts，RAGE)和Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)的表達，進而使下游核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Bnuclear factor kappaB，NF-κB)表達量減少，抑制其調(diào)控的炎癥信號轉(zhuǎn)導通路，緩解了AD病癥[11]。作為治風劑之首的小續(xù)命湯具有宣通玄府、開發(fā)郁結的功效，毛敬潔等研究發(fā)現(xiàn)小續(xù)命湯改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠的認知功能作用，減少其大腦海馬區(qū)Aβ的沉積、抑制星形膠質(zhì)細胞的過度活化[12]。

2.1.2.2 抗氧化應激的作用：AD患者和APP/PS1小鼠體內(nèi)會發(fā)生氧化應激反應，即過氧化作用與抗氧化作用失衡， 導致自由基產(chǎn)生增多，氧化物超過體內(nèi)的抗氧化能力，過多的自由基進一步造成神經(jīng)組織和細胞損傷，加重AD。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠腦內(nèi)SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增高，而用補腎化痰益智方給藥干預后，其抗氧化作用和認知能力得到了顯著的改善[13]。類葉升麻苷(Acteoside，AS) 是從肉蓯蓉中提取出的一種苯乙醇苷類活性成分，肉蓯蓉有延緩衰老、提高免疫力的功效，其降低 APP /PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠的超氧化物歧化酶 SOD 抑制率，明顯升高丙二醛MDA 含量以及提高谷胱甘肽二氧化氫酶GSH-Px 活性，改善腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)匱乏狀態(tài)，具有改善 AD 焦慮癥狀、提高學習記憶能力、延緩衰老、提高抗氧化能力等效用[13]。

2.1.2.3 神經(jīng)元保護的作用：AD患者腦中會出現(xiàn)神經(jīng)元突觸缺失、神經(jīng)元結構損傷等病癥，嚴重阻礙了腦內(nèi)神經(jīng)信號傳遞，導致患者學習記憶能力減退，出現(xiàn)癡呆癥狀。故許多益智養(yǎng)心的中藥復方被應用于AD的研究，如由遠志、人參、茯苓、菖蒲制成的開心散， 始見于唐代孫思邈《備急千金要方》，是中醫(yī)安神定志、益智養(yǎng)心的基礎方劑，能促進APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠長時程增強LTP形成，增強突觸可塑性，可能與調(diào)節(jié)突觸后致密物PSD-95蛋白表達有關，其中，海馬長時程增強是反映神經(jīng)突觸可塑性和在空間學習記憶過程中神經(jīng)元的生理活動客觀電生理指標；PSD是接受與傳導突觸信號的分子裝置，PSD-95則是含量最豐富的腳手架蛋白，與突觸信號傳導密切相關[14]。具有開竅安神功效的洗心湯可以改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學習記憶功能，提高小鼠海馬突觸功能蛋白及受體表達，具有保護神經(jīng)元突觸的功能[15]。王健等的電鏡結果顯示，通過調(diào)心方灌胃治療之后，轉(zhuǎn)基因小鼠海馬 CA1 區(qū)突觸小泡、突觸數(shù)量明顯增加，突觸結構、神經(jīng)元結構能保持完整，突觸功能得到保護，同時調(diào)心方具有多靶點、遠期療效更穩(wěn)定的優(yōu)勢，且對 AD 患者有效[16]。

2.2 減少tau蛋白過度磷酸化的作用

Tau蛋白是分布在神經(jīng)元內(nèi)的微管相關蛋白，對維持細胞骨架完整性、突觸間信號傳遞具有重要的作用，在AD患者腦中過度磷酸化，進而神經(jīng)纖維纏結，導致細胞骨架異常及細胞死亡[17]。葛根素(puerarin，PU) 是從葛根中提取出的異黃酮類化合物，具有改善心肌收縮、降低心肌耗氧量、擴張冠脈和腦血管促進血液循環(huán)等作用，其能夠改善APP/PS1小鼠的認知和記憶功能障礙，降低大腦皮層中 Aβ的水平，通過抑制GSK3β 信號通路活性，阻止 tau 蛋白過磷酸化[18]。

2.3 改善膽堿能系統(tǒng)的作用

六味地黃丸是傳統(tǒng)滋補腎陰的經(jīng)典名方，功效是滋補腎陰，填精補益現(xiàn)代藥理學研究表明，六味地黃丸具有抗氧化，抗細胞凋亡等作用，六味地黃丸可提高轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶Ch AT活性，增加乙酰膽堿脂酶ACh含量，影響中樞神經(jīng)膽堿能系統(tǒng)，進一步改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學習記憶能力[19]。

2.4 改善認知能力的作用

認知能力障礙是AD患者的常見病癥。服用復方丹參片的APP/PS1小鼠，腦組織中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和γ-氨基丁酸(GABA)的含量增加，通過Morris水迷宮實驗、高架十字迷宮實驗和新奇抑制攝食實驗等方法發(fā)現(xiàn)該藥具有改善轉(zhuǎn)基因小鼠的焦慮樣行為和學習記憶損傷的功能[20]。

2.5 調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的作用

越來越多的證據(jù)顯示，老年性癡呆和晝夜節(jié)律的紊亂密切相關，改善晝夜節(jié)律紊亂可以改善老年癡呆的認知障礙[21]。丁莉等研究發(fā)現(xiàn)生慧湯可以調(diào)節(jié)APP /PS1 小鼠Per1、Cry1、Clock、Bmall等節(jié)律基因 mRNA 的表達，可以改善 AD 模型小鼠的晝夜節(jié)律紊亂[22]，其中生慧湯是由熟地，山茱萸、遠志、酸棗仁、去油柏子仁、茯神、人參、石菖蒲、白芥子組成的中藥復方，具有益氣養(yǎng)血，心腎兼補之功效，主治心腎不足，老年健忘。

3 總結與展望

目前，大量的研究結果表明，AD的發(fā)生與發(fā)展是多個因素綜合作用的結果，其致病機制復雜且尚不明確，缺乏有效藥物，而中藥防治AD作為一個研究熱點，能從抑制Aβ過表達、減少突觸缺失、保護神經(jīng)元、抗氧化應激反應、抗炎、抑制tau蛋白過度磷酸化、調(diào)節(jié)生物節(jié)律、抗衰老等多個方面改善APP/PS1小鼠病癥，對于研究人類AD病理發(fā)揮著極為重要的作用。

在中醫(yī)藥防治AD研究中，實驗動物模型的選擇是至關重要的，而APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠在病理、行為等多方面均與 AD 病人臨床疾病的發(fā)展過程高度相似[23]，且積累老年斑塊時間早，癡呆癥狀隨著年齡增長而加劇[24]，大大地優(yōu)于其他非轉(zhuǎn)基因的動物模型。同時，該種小鼠模型Aβ表達量是同齡APP單轉(zhuǎn)基因小鼠模型表達量的20～40倍[25]，能較早地表現(xiàn)出AD癥狀，便于根據(jù)實驗目的靈活地選擇研究月齡，即可選擇患病早、中或晚期某一特定的時期進行研究，也可以進行動態(tài)持續(xù)性地長期觀察。其給藥方式多為灌胃，給藥方法是設置不同濃度的中藥，連續(xù)給藥3周至7個月不等。在行為學研究方面，Morris水迷宮實驗、高架十字迷宮實驗和新奇抑制攝食實驗等方法都能很好地應用于APP/PS1小鼠的認知能力的研究。常用的檢測技術手段有免疫熒光法、免疫組化技術、western blot、RT-PCR、ELISA等方法，對小鼠腦中各種成分含量進行檢測。

盡管APP/PS1小鼠在中藥干預研究中有著廣泛的應用，但是針對這一較先進的動物模型，中醫(yī)界的研究尚不夠系統(tǒng)、不夠微觀，還需要進一步從其細胞水平、分子水平、基因水平等各方面對AD的致病機制進行深入系統(tǒng)的研究。