pH示差法測(cè)定黑小麥全麥粉花色苷及其體外抗氧化性

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(1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,河北邯鄲 056021;2.河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所,河北石家莊 050031;3.河北北方學(xué)院,河北張家口 075000;4.河北工程大學(xué)土木工程學(xué)院,河北邯鄲 056038)

糧食作物是人類賴以生存的寶貴資源,其中小麥?zhǔn)俏覈?guó)主要的糧食作物之一。隨著人們生活水平的不斷提高,人們對(duì)飲食方面的觀念發(fā)生了從量變到質(zhì)變的重大變化,逐漸開始注重食品的營(yíng)養(yǎng)和保健功能[1]。2014年,“全谷物食品與健康國(guó)際研討會(huì)”的召開明確指出要重點(diǎn)“研發(fā)全麥粉及制品相關(guān)技術(shù)”[1-2]。黑小麥作為特殊粒色的小麥,其全麥粉中含有豐富的花色苷?；ㄉ帐且环N水溶性天然食用色素,屬黃酮多酚類化合物,是一種天然良好的抗氧化物質(zhì)。在預(yù)防神經(jīng)細(xì)胞衰老、心腦血管疾病、癌癥、糖尿病和其他疾病中起重要作用[3-5]。

目前,總花色苷定量分析法是依據(jù)其光學(xué)特性進(jìn)行分析,常用的方法有分光光度法中的單一pH法、pH示差法、差減法等。而花色苷單體的定量分析一般應(yīng)用于高效液相色譜法(HPLC法)[4]。張玥等[5]研究表明,單一pH示差法只適用于測(cè)定多個(gè)提取條件下的花色苷,可用于提取工藝化的研究,而差減法操作過程繁瑣,且其線性關(guān)系與精確性均較差。雖然HPLC法精確率高,但該法使用的設(shè)備和樣品昂貴,并且花色苷標(biāo)準(zhǔn)品不穩(wěn)定;而pH示差法操作簡(jiǎn)單,并且該方法與HPLC法有很好的相關(guān)性[6-7]。正是由于pH示差法測(cè)定成本低、精確度高的優(yōu)點(diǎn),近年來越來越多的研究者采用該方法進(jìn)行花色苷含量的定量分析[8]。該法依據(jù)的原理為:花色苷發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)換是pH的函數(shù),而干擾物質(zhì)的特征吸收光譜不隨pH的改變而變化,又因?yàn)閜H示差法主要用于含有較多干擾物質(zhì)的花色苷總含量的測(cè)定,而黑小麥全麥粉花色苷溶液含有較多的干擾物質(zhì)[6-8],所以pH示差法很適合用于測(cè)定黑小麥全麥粉花色苷的含量。

本實(shí)驗(yàn)主要以黑小麥全麥粉為原材料,探究pH示差法測(cè)定黑小麥全麥粉花色苷含量的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)參數(shù),分析黑小麥全麥粉花色苷的體外抗氧化性能,為黑小麥全麥粉的加工提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑小麥LZ-1 遺傳穩(wěn)定的品種(系),于2016年10月種植于河北工程大學(xué)洺關(guān)校區(qū)實(shí)驗(yàn)基地;鹽酸、甲醇、氯化鉀、醋酸鈉、DPPH、無水乙醇、H2O2、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚 以上均為分析純，天津歐博凱化工有限公司。

DZF-6050型真空干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;ZK-FDV-98超微超微粉碎機(jī) 北京中科浩宇科技發(fā)展有限公司;TU-1810紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;MULTIFUGE-X1R冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司;BHS-6恒溫水浴鍋 上海鵬鳴生物科技發(fā)展有限公司;R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長(zhǎng)征儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑的配制 根據(jù)文獻(xiàn)[12-14],配制以下試劑,稍有改動(dòng);

pH1.0緩沖液的配制:精準(zhǔn)量取0.2 mol/L的HCL的溶液335 mL,然后向其中加入125 mL,0.2 mol/L的KCl溶液,充分混勻。

pH4.5緩沖液的配制:稱取27.215 g CH3CO2Na·3H2O于燒杯中,稱取12 mol/L的濃鹽酸(約10 mL),調(diào)整pH至4.5再用蒸餾水定容至500 mL容量瓶中。

pH0.5、0.75、1.5、2.0、3.0、3.5、4.0和5.0的配制方法:將0.1 mol/L的檸檬酸溶液緩慢加到1 mol/L的鹽酸溶液中,調(diào)整至實(shí)驗(yàn)所需的pH。

酸化乙醇:乙醇濃度60%,pH為3的酸化乙醇溶液。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)樣品制備 參照文獻(xiàn)[15-16],稍有改動(dòng)。

1.2.2.1 黑小麥全麥粉花色苷提取液 稱取黑小麥全麥粉50 g,60%的酸化乙醇溶液在60 ℃下浸提2 h,浸提3次至為無色,得黑小麥全麥粉浸提液,將該浸提液以轉(zhuǎn)速5000 r/min,離心10 min,取上清液為黑小麥全麥粉花色苷提取液。

1.2.2.2 黑小麥全麥粉花色苷濃縮液 使用0.05%的α-中溫淀粉酶、0.05%的果膠酶以及0.02%的乙酰甲殼素,溫度60 ℃澄清上清液1 h,去除可溶性固形物;55 ℃,100 r/min下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)真空濃縮,得到粗花色苷色素濃縮液。

1.2.2.3 黑小麥全麥粉花色苷純化干燥 向該花色苷色素濃縮液中加入5倍體積乙醇,采用AB-8大孔樹脂吸附解析,90%乙醇為洗脫劑,上樣流速為1.0 BV/h,解吸流速為 2.0 BV/h[16],低溫真空濃縮得花色苷濃縮液,再經(jīng)過大孔吸附樹脂純化的黑小麥全麥粉花色苷冷凍干燥48 h,得花色苷粗品。

1.2.2.4 樣品的制備 稱取1 mg黑小麥全麥粉花色苷粗品,用pH3.0的檸檬酸緩沖液定容至100 mL容量瓶?jī)?nèi),用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 pH示差法測(cè)定黑小麥全麥粉中花色苷含量的條件

1.2.3.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定 吸取一定量的樣品,用紫外-可見光譜儀在250～650 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)該樣品進(jìn)行掃描,測(cè)定黑小麥全麥粉花色苷粗品的最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.3.2 pH確定 根據(jù)文獻(xiàn)[12,17-18],稍有改動(dòng),分別吸取2 mL(注:取樣量為所測(cè)總體積的20%,不影響緩沖溶液緩沖能力的取樣量最大限)樣品于10個(gè)試管中,在最大吸收波長(zhǎng)下,分別測(cè)定黑小麥全麥粉花色苷提取液,使其處于pH=0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0緩沖液中時(shí)的吸光度,以去離子水為空白對(duì)照,以排除待測(cè)液的干擾。

1.2.3.3 平衡時(shí)間和平衡溫度的確定 將樣品于吸光度最大與最小的兩組緩沖溶液環(huán)境中進(jìn)行平衡,分別在平衡溫度為20、40和60 ℃下每平衡5 min測(cè)一次其吸光度,當(dāng)吸光度最終趨于穩(wěn)定時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)束,并記錄其結(jié)果。得到最短平衡時(shí)間以及最適宜平衡溫度[12-14]。

1.2.3.4 pH示差法的精密度考察 取2 mL樣品,分別加入pH為1.0和4.5的緩沖液8 mL,結(jié)合比爾定律,平行測(cè)定6次,計(jì)算得出黑小麥全麥粉花色苷的含量[19-20]。

式(1)

式中,A0-pH1.0時(shí)花色苷的吸光度;A1-pH4.5時(shí)花色苷的吸光度;V-提取液總體積(mL);n-稀釋倍數(shù);M-矢車菊-3-葡萄糖苷(Cy-3-Glu)相對(duì)分子質(zhì)量(449);ε-Cy-3-Glu的消光系數(shù)(29600);m-樣品質(zhì)量(mg)。

1.2.4 黑小麥全麥粉花色苷DPPH·清除率測(cè)定 參照雷月等[21]的稍有改動(dòng),將2mL 10×10-4mol/L DPPH無水乙醇溶液加入具塞試管中,再加入2 mL不同質(zhì)量濃度的黑小麥全麥粉花色苷粗品溶液,搖勻,反應(yīng)在室溫下進(jìn)行30 min,在517 nm下測(cè)量吸光度,并通過下式計(jì)算分析物對(duì)DPPH自由基的抑制率。

式(2)

式中,A0-2 mL DPPH溶液與2 mL乙醇溶液的混合液的吸光度;A-2 mL樣品溶液和2 mL DPPH溶液的混合液吸光度;Ai-2 mL樣品溶液和2 mL乙醇溶液的混合液的吸光度。

1.2.5 黑小麥全麥粉花色苷羥自由基(·OH)清除率測(cè)定 按照[21-22],稍有改動(dòng)。在具塞管中加入1 mL 10 mmol/L的FeSO4溶液，2 mL 10 mmol/L水楊酸溶液(水楊酸溶液的溶劑為乙醇),然后加入不同濃度的黑小麥全麥粉花色苷粗品溶液2 mL,最后加入2 mL 8.8 mol/L H2O2溶液,將具塞管放入37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min,在510 nm處檢測(cè)各個(gè)樣品的吸光度,以蒸餾水作參比,計(jì)算其清除率。

式(3)

式中:A1-對(duì)照液的吸光度;A2-加入花色苷溶液后的吸光度;A3-不加顯色劑H2O2其溶液的吸光度。

式(4)

式中:B0-為空白對(duì)照液吸光度;B1-為樣品的吸光度;B2-為樣品本身的吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

3次平行實(shí)驗(yàn)后,采用SPSS 19.0和Excel 2010多重比較pH示差法測(cè)定黑小麥全麥粉花色苷含量與其測(cè)定條件之間的關(guān)系及其抗氧化性能的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑小麥全麥粉花色苷吸收光譜測(cè)定

通常情況下,?；幕ㄉ昭苌镌谧贤鈪^(qū)域主要有兩個(gè)吸收帶,一個(gè)是在240～280 nm,是由A環(huán)上的苯甲?；鶊F(tuán)引發(fā)的,另一個(gè)是在300～400 nm處,主要是由B環(huán)上的?；鶊F(tuán)引發(fā)的。在可見光區(qū)500～550 nm區(qū)會(huì)有一個(gè)花色苷的特征峰,峰位置會(huì)受糖基數(shù)目和位置、花色苷母核、溶劑等因素影響[24]。由圖1可知,在pH為3.0的條件下,黑小麥全麥粉花色苷在紫外光區(qū)的吸收峰分別為280和320 nm,可見光區(qū)的最大吸收波長(zhǎng)為531 nm,說明黑小麥全麥粉有花色苷特征吸收峰,且其花色苷色素中有?；鶊F(tuán),而被?；幕ㄉ盏姆€(wěn)定性遠(yuǎn)高于未被?；幕ㄉ誟25-26]。由此得出,黑小麥全麥粉花色苷較穩(wěn)定,適用于pH示差法測(cè)定黑小麥全麥粉花色苷的含量。

圖1 黑小麥全麥粉花色苷紫外可見吸收光譜圖Fig.1 UV-Vis absorption spectrum wavelength of anthocyanins in whole wheat flour of black wheat

2.2 兩個(gè)最適pH的確定

根據(jù)pH示差法原理,所選的兩個(gè)特定pH,必須符合其吸光度在這兩個(gè)特定pH下的吸光度差值最大,同時(shí)又對(duì)花色苷有極高相對(duì)穩(wěn)定性的緩沖溶液pH[17]。

由圖2可知,在最大吸收波長(zhǎng)531 nm處,分別測(cè)定樣品處于pH=0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 緩沖液中的吸光度,得出兩個(gè)吸光度差值最大且相對(duì)穩(wěn)定的pH分別是pH1.0和pH4.5,這與王少波等[27]測(cè)定黑豆皮花色苷含量和楊萍等[12]測(cè)定黑枸杞花色苷含量分析出的兩個(gè)最適pH一樣。

圖2 不同pH對(duì)花色苷吸光度的影響Fig.2 Effect of different pH on the absorption of anthocyanins

綜上所述,利用pH示差法測(cè)定黑小麥全麥粉花色苷含量時(shí),選擇pH1.0和pH4.5來測(cè)定黑小麥全麥粉花色苷的吸光度是可行的。

2.3 平衡時(shí)間和平衡溫度的確定

將處于pH1.0與pH4.5的兩組緩沖溶液環(huán)境下的樣品進(jìn)行平衡,結(jié)果如圖3和圖4。

由圖3可知,黑小麥全麥粉花色苷樣品在pH=1.0時(shí),當(dāng)其分別處于20和40 ℃時(shí),其吸光度會(huì)隨著時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)而逐漸趨于穩(wěn)定,且均呈逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)。其中,當(dāng)平衡溫度為到40 ℃時(shí),平衡時(shí)間只需25 min,且此情況下,體系達(dá)到最穩(wěn)定狀態(tài);當(dāng)溫度為20 ℃時(shí),樣品需要平衡的時(shí)間較長(zhǎng),且其峰值較低于40 ℃,這也許是受熱時(shí)間過長(zhǎng),使花色苷發(fā)生水解或者去糖基開環(huán)反應(yīng),導(dǎo)致花色苷降解率大,從而使其峰值較低于40 ℃時(shí)的峰值[28-29]。但當(dāng)平衡溫度為60 ℃,雖然樣品的吸光度迅速達(dá)至峰值,但是吸光度極其不穩(wěn)定,達(dá)到峰值后,瞬間出現(xiàn)下降的趨勢(shì),這是因?yàn)闇囟仍礁?花色苷降解越快,且保持的平衡時(shí)間越短[29]。因此,在pH1.0的緩沖液中時(shí),最適宜的平衡溫度為40 ℃,最適宜的平衡時(shí)間為25 min。

表1 黑小麥全麥粉花色苷精密度實(shí)驗(yàn)Table 1 Precision experiment of anthocyanin in black wheat whole wheat flour

圖3 樣品在pH1.0的緩沖液中平衡情況Fig.3 The sample equilibrium in a pH1.0 buffer solution

圖4 樣品在pH4.5的緩沖液中平衡情況Fig.4 The sample equilibrium in a pH4.5 buffer solution

如圖4所示,當(dāng)樣品在pH=4.5時(shí),其吸光度會(huì)隨著時(shí)間的推移而逐漸趨于平緩,且均呈逐漸降低的趨勢(shì)。當(dāng)溫度為 40 ℃時(shí),其吸光度在很短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡,平衡在35 min時(shí)已經(jīng)完成;當(dāng)溫度為 20 ℃時(shí),需要較長(zhǎng)的平衡時(shí)間。在60 ℃時(shí),吸光度迅速下降,且一直處于變化的狀態(tài),極其不穩(wěn)定。這是因?yàn)闇囟仍礁?花色苷越不穩(wěn)定,且其降解速率越快。在相同溫度下,與圖3有不一樣的變化趨勢(shì),因?yàn)椴煌琾H會(huì)對(duì)花色苷的熱降解途徑產(chǎn)生不同的影響[30-31]。所以,樣品在pH4.5的緩沖液中時(shí),最適宜的平衡溫度為40 ℃,最適宜的平衡時(shí)間為35 min。

綜上,pH1.0緩沖液最適平衡時(shí)間為25 min,pH4.5緩沖液最適平衡時(shí)間為35 min,其最適溫度均為40 ℃。

2.4 黑小麥全麥粉花色苷含量測(cè)定的精密度

結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)分析得出最佳優(yōu)化條件,最大吸收波長(zhǎng)531 nm,最適兩個(gè)pH分別是pH1.0和pH4.5,最佳平衡溫度40 ℃,最佳平衡時(shí)間分別為25和35 min,進(jìn)行黑小麥全麥粉花色苷精密度實(shí)驗(yàn)。

由表1可知,在所選定的pH1.0和pH4.5的緩沖液中,通過對(duì)黑小麥全麥粉花色苷吸光度的6次平行測(cè)定,計(jì)算得出,黑小麥全麥粉花色苷的含量為567.06 mg/kg,計(jì)算得到6次平行測(cè)定的花色苷含量的相對(duì)偏差(RSD)為1.34%。所以,pH示差法能很好的消除樣品溶液中其雜質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響,從而使其重復(fù)性更強(qiáng)。

2.5 黑小麥全麥粉花色苷DPPH·清除率測(cè)定

由圖5可知,黑小麥全麥粉花色苷對(duì)DPPH·具有很強(qiáng)的清除能力。在一定的濃度范圍內(nèi),花色苷的DPPH·清除率隨著其質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大,且增長(zhǎng)速度逐漸趨于平緩。當(dāng)濃度為0.25 mg/mL時(shí),其花色苷DPPH·的清除率為91.00%,而抗壞血酸的DPPH·的清除率為80.34%,因此,該花色苷體外清除DPPH·的能力較高于抗壞血酸。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與張鏡等[10]研究結(jié)果較一致,即陰香果實(shí)花色苷體外清除DPPH·的能力同樣高于抗壞血酸,劉國(guó)凌等[32]同樣發(fā)現(xiàn)崗稔花色苷對(duì)DPPH·的清除能力明顯高于抗壞血酸。但黑小麥全麥粉花色苷體外清除DPPH·的能力低于陰香果實(shí)花色苷和崗稔花色苷。而冷梅等[11]研究表明,紫葉稠李果實(shí)花色苷體外清除DPPH·的能力低于抗壞血酸。呂春茂等[33]指出,北春越橘花色苷清除DPPH·的能力與抗壞血酸無明顯差異。這也許是不同來源的植物花色苷,其體外清除DPPH·的能力也有所不同,或者花色苷濃度不同導(dǎo)致其體外清除DPPH·的能力也不同[34-35]。

圖5 黑小麥全麥粉花色苷DPPH·清除率Fig.5 DPPH· clearance rate of anthocyanins from black wheat whole wheat

2.6 黑小麥全麥粉花色苷·OH清除率測(cè)定

由圖6分析可知,黑小麥全麥粉花色苷具有很強(qiáng)的體外清除·OH的能力,并且隨著花色苷質(zhì)量濃度的不斷增加,清除能力逐漸增強(qiáng)。在0.1～0.3 mg/mL濃度范圍內(nèi),花色苷的濃度與其·OH清除率呈一定的線性函數(shù)關(guān)系。當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時(shí),花色苷的·OH的清除率為90.54%,而抗壞血酸·OH的清除率僅為52.30%,兩者差異明顯,且花色苷清除·OH的能力是抗壞血酸的1.73倍。因此,黑小麥全麥粉花色苷的體外清除·OH的活性遠(yuǎn)高于抗壞血酸。

圖6 黑小麥全麥粉花色苷·OH清除率Fig.6 ·OH clearance rate of anthocyanins from blackwheat whole wheat

張鏡等[10]表明,陰香果實(shí)清除·OH的能力是抗壞血酸的16倍。李偉[36]研究指出,黑小麥麩皮花色苷體外清除·OH能力是抗壞血酸的1.5倍。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與大多數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果較一致,即一般情況下,花色苷清除·OH的能力高于抗壞血酸。這可能由于花色苷分子結(jié)構(gòu)中羥基的個(gè)數(shù)不同,或者其分子結(jié)構(gòu)中有無3位羥基,致使其對(duì)·OH的清除能力存在一定差異,但聶芊等[37]研究顯示,不同植物來源的花色苷對(duì)·OH的清除能力也存在一定差異。

2.7 黑小麥全麥粉花色苷清除率測(cè)定

圖7 黑小麥全麥粉花色苷的清除率 clearance rate of anthocyanins from black wheat whole wheat flour

綜上分析可知,黑小麥全麥粉花色苷具有很強(qiáng)的體外抗氧化能力,且高于抗壞血酸。

3 結(jié)論