圓錐角膜病因?qū)W研究進展△
——遺傳、環(huán)境刺激、表觀遺傳的相互作用

劉曉涵 馬寧 陳彥婷 張鈺 陳躍國

圓錐角膜是一種雙眼不對稱的、進行性的角膜擴張，以角膜中央變薄、向前凸出呈圓錐形為特征，晚期可導(dǎo)致嚴重的視力損害，在一般人群中的患病率約為1/2000[1]。常于青春期發(fā)病，并可進展至40歲，是發(fā)達國家角膜移植最常見的原因[2]。目前圓錐角膜的病因仍不明確，可能與遺傳、表觀遺傳、環(huán)境、氧化應(yīng)激、變態(tài)反應(yīng)、創(chuàng)傷等多種因素相關(guān)。

1 遺傳因素

1.1 圓錐角膜相關(guān)遺傳性疾病盡管大多數(shù)圓錐角膜病例是散發(fā)的，但也常見有家族性發(fā)病的病例報告[3]。大多數(shù)家族性圓錐角膜為常染色體顯性遺傳，表現(xiàn)為不完全性外顯和遺傳異質(zhì)性。圓錐角膜與多種遺傳性疾病有關(guān)，這些疾病大多屬于以下4種類型之一：膠原彈性異常的結(jié)締組織疾病、具有指眼刺激的視網(wǎng)膜功能異常、與特應(yīng)性或濕疹及揉眼相關(guān)的結(jié)締組織疾病以及具有指眼刺激的精神功能低下[4]。

1.1.1 膠原彈性異常的結(jié)締組織疾病包括脆性角膜綜合征、先天性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良、關(guān)節(jié)活動過度綜合征、指甲-髕骨綜合征、成骨不全癥、Ehlers-Danlos綜合征、左室假腱索、Marfan綜合征、二尖瓣脫垂和彈力纖維性假黃瘤。

1.1.2 視網(wǎng)膜功能異常相關(guān)的疾病常見指眼刺激現(xiàn)象，包括白化病、先天性風(fēng)疹、Bardet-Biedl綜合征、Leber先天性黑矇、神經(jīng)纖維瘤病、色素性視網(wǎng)膜炎、Laurence-Moon-Bardet-Biedl綜合征、視錐細胞營養(yǎng)不良、毯層視網(wǎng)膜變性和Kurz綜合征。

1.1.3 特應(yīng)性或濕疹以及揉眼相關(guān)的結(jié)締組織疾病許多與遺傳因素相關(guān)的圓錐角膜患者，特應(yīng)性和濕疹的發(fā)生率較高。如Down綜合征、高IgE綜合征、魚鱗病、眼齒指綜合征、Turner綜合征(結(jié)膜淋巴管擴張癥)、皮膚劃痕癥、Mulvihill-Smith綜合征。以上綜合征均已知與揉眼及圓錐角膜相關(guān)。已知Down綜合征患者經(jīng)常伴發(fā)瞼緣炎，可導(dǎo)致過度及用力揉眼[5]，但尚不清楚揉眼是否會以及如何導(dǎo)致圓錐角膜。另外，氧化應(yīng)激被認為與圓錐角膜的發(fā)病有關(guān)[6]，因此位于第21號染色體上的超氧化物歧化酶1基因(superoxide dismutase 1，SOD1)也可能與Down綜合征患者中圓錐角膜發(fā)病率高有關(guān)[7]。

1.1.4 精神功能低下相關(guān)的疾病指眼刺激也存在于精神功能低下的患者中。 Apert綜合征、Crouzon綜合征、Angelman綜合征、高鳥氨酸血癥和Noonan綜合征均與圓錐角膜，精神功能低下和指眼刺激相關(guān)。

1.2 圓錐角膜相關(guān)基因隨著基因診斷技術(shù)的發(fā)展，全基因組連鎖分析和全基因組關(guān)聯(lián)分析的廣泛應(yīng)用，目前已發(fā)現(xiàn)多個基因與圓錐角膜的發(fā)病有關(guān)。

視覺系統(tǒng)同源框1(visual system homeobox，VSX1)基因是圓錐角膜中研究最多的候選基因之一，其編碼的蛋白質(zhì)在顱面和眼部細胞分化和發(fā)育中發(fā)揮作用，在很多國家的散發(fā)性和家族性病例中都曾發(fā)現(xiàn)各種VSX1基因的突變體[8-9]。圓錐角膜中存在高水平的氧化應(yīng)激[10]，而SOD1基因編碼一種細胞質(zhì)抗氧化酶，在機體氧化與抗氧化平衡中起關(guān)鍵作用，許多研究都曾在圓錐角膜患者中檢測到該基因的突變[11-12]，但也有數(shù)據(jù)不支持該基因的致病作用[13-15]。miR-184是角膜和晶狀體上皮細胞中表達最豐富的微小RNA，并且已知與角膜中蛋白質(zhì)水平的調(diào)節(jié)有關(guān)，大量文獻曾報道圓錐角膜中存在該基因突變[16-18]。賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)基因編碼一種細胞外銅胺氧化酶，能使膠原蛋白和彈性蛋白形成共價鍵，其分布的變化及其活性降低可能是圓錐角膜膠原交聯(lián)不足的潛在原因[19-20]。一項涉及1467例圓錐角膜眼和4490例對照眼的薈萃分析表明，LOX基因的2個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)rs2956540和rs10519694，可能會影響個體對圓錐角膜的易感性[21]。胞質(zhì)分裂供體9(dedicator of cytokinesis 9，DOCK9)為基因編碼DOCK蛋白家族中的一個成員，該蛋白可以激活G蛋白CDC42，參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其突變位點最初在厄瓜多爾的圓錐角膜家族中[22]被發(fā)現(xiàn)。IL-1α和IL-1β基因的多個SNP與圓錐角膜的風(fēng)險有關(guān)[23-24]。COL4A3和COL4A4基因編碼角膜的主要結(jié)構(gòu)蛋白Ⅳ型膠原α3/4，也被認為是圓錐角膜發(fā)病的候選基因[25-26]。中央角膜厚度(central corneal thickness，CCT)與某些眼部疾病如圓錐角膜和青光眼相關(guān)，全基因組關(guān)聯(lián)分析已確定圓錐角膜與CCT的SNP相關(guān)[27]。 轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)蛋白(transforming growth factor-beta-induced ，TGFBI)是角膜基質(zhì)中含量第二高的蛋白，具有細胞黏附功能，可能在組織損傷修復(fù)中起重要作用[28]，在我國[29]和波蘭[30]的圓錐角膜患者中均有該基因突變的報道。鋅指蛋白469(zinc finger protein 469，ZNF469)基因的突變體也與圓錐角膜的發(fā)病有關(guān)[31-32]。Yu等[33]首次證明該基因在中國圓錐角膜患者中有致病作用，并拓寬了中國人群圓錐角膜的突變譜。鈣蛋白酶抑素(calpastatin，CAST)基因編碼鈣蛋白酶的內(nèi)源性抑制劑鈣蛋白酶抑素在哺乳動物眼中廣泛存在。白種人群[34]和漢族人群[35]中均已發(fā)現(xiàn)CAST基因與圓錐角膜的遺傳易感性有關(guān)。微管蛋白A3D(tubulin α-3D，TUBA3D)基因編碼α微管蛋白家族成員在正常人角膜中高表達，可能在維持角膜結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用。Hao等[36]研究發(fā)現(xiàn)TUBA3D基因是與圓錐角膜相關(guān)的新基因，占病例的1%。

迄今為止的遺傳學(xué)研究表明圓錐角膜的遺傳與多個染色體區(qū)域相關(guān)，涉及多個基因參與。但有些基因的突變僅與特定人群的發(fā)病有關(guān)，缺乏不同地理區(qū)域人群之間的一致性。如希臘的圓錐角膜患者中VSX1基因并未發(fā)揮主要致病作用[11]；miR-184突變并不是伊朗圓錐角膜患者的主要病因[37]；波蘭人群中的DOCK9基因突變位點與厄瓜多爾家族中的不完全一致[30]；澳大利亞人群中的研究發(fā)現(xiàn)21個圓錐角膜的候選基因不發(fā)揮主要作用[13]；伊朗人群中COL4A3 rs55703767基因多態(tài)性降低了圓錐角膜的風(fēng)險[38]； ZNF469基因與波蘭[39]和沙特阿拉伯[40]的圓錐角膜患者發(fā)病無關(guān)。這種不同亞群之間的遺傳異質(zhì)性使得圓錐角膜的遺傳學(xué)發(fā)病機制變得更為復(fù)雜。目前所篩選出的這些候選基因也需要更多的證據(jù)進一步確認。

2 環(huán)境因素

2.1 揉眼大量文獻曾報道揉眼和圓錐角膜相關(guān)，并將其視為危險因素[3]。曾有一系列的病例報告了因揉眼導(dǎo)致圓錐角膜在兩眼的不對稱出現(xiàn)[41-42]。Bawazeer等[43]通過Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)揉眼和圓錐角膜顯著相關(guān)。其他人通過Logistic回歸分析也證實了這一點[44-45]。

圓錐角膜的經(jīng)典定義是非炎癥性疾病，因患者往往不會有紅腫熱痛的炎癥表現(xiàn)。但最新研究提出揉眼時，炎癥因子可引起角膜微環(huán)境的特定變化。揉眼會導(dǎo)致淚液中基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)、IL-6和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平增加。Balasubramanian等[46]研究發(fā)現(xiàn)，正常研究對象揉眼60 s后，其淚液MMP-13、IL-6和TNF-α的水平即可增加。而圓錐角膜患者在持續(xù)而用力地揉眼后，其淚液中蛋白酶、蛋白酶活性和炎癥介質(zhì)的增加更為顯著，從而導(dǎo)致圓錐角膜的進一步發(fā)展。另外，揉眼產(chǎn)生的機械損傷也可能在圓錐角膜的發(fā)病中發(fā)揮作用。McMonnies[47]描述了許多可能的機制，包括揉眼使溫度升高，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)和酶的活性增加，眼壓增加與酶活性增加共同使角膜變?。唤悄ろ旤c處的膠原原纖維之間的滑動；以及摩擦創(chuàng)傷誘導(dǎo)的細胞凋亡。

瞼緣炎是揉眼最常見的原因之一，與健康人相比，圓錐角膜患者中瞼緣炎更為常見，可能與其引發(fā)的炎癥反應(yīng)和揉眼有關(guān)[48]。

2.2 特應(yīng)性特應(yīng)性即變態(tài)反應(yīng)，包括過敏、哮喘、濕疹等。但關(guān)于圓錐角膜和特應(yīng)性之間存在一些相互矛盾的報道。許多作者報道了特應(yīng)性與圓錐角膜具有相關(guān)性[49-51]，Thyssen等[52]發(fā)現(xiàn)與對照組相比，特應(yīng)性皮炎患者圓錐角膜的患病率更高；而Jeon等[53]在韓國人群中的研究發(fā)現(xiàn)特應(yīng)性皮炎不是圓錐角膜的危險因素。Bawazeer等[43]使用多元Logistic回歸分析得出結(jié)論，特應(yīng)性與圓錐角膜無關(guān)，但與揉眼密切相關(guān)，而特應(yīng)性引起瘙癢是導(dǎo)致揉眼的一個因素。目前特應(yīng)性與圓錐角膜發(fā)病的關(guān)系還需要進一步研究。

2.3 日曬紫外線可以誘發(fā)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，大量的自由基和活性氧造成細胞和組織的損傷，同時紫外線也可以直接損傷DNA，從而啟動角膜上皮細胞的凋亡程序，導(dǎo)致角膜降解、變薄，視力喪失[54]。圓錐角膜在炎熱、陽光充足的國家發(fā)病率相對較高[55]。在沙特阿拉伯、印度和以色列人群中普遍存在；而在日曬較少和平均氣溫較低的區(qū)域，其患病率要低得多，如芬蘭、丹麥、烏拉爾、明尼蘇達州和日本。動物實驗已證明紫外線可以誘導(dǎo)角膜細胞凋亡，使角膜細胞水平下降[56]。

但是，紫外線也可以通過誘導(dǎo)角膜膠原蛋白的交聯(lián)而產(chǎn)生有益的作用。Wollensak等[57]發(fā)現(xiàn)使用紫外線和光敏劑核黃素可以對膠原纖維進行光聚合，避免角膜不斷擴張，從而有效阻止圓錐角膜的進一步發(fā)展，即目前用于治療圓錐角膜的角膜膠原交聯(lián)技術(shù)。

3 表觀遺傳學(xué)

目前遺傳學(xué)仍不足以解釋大多數(shù)散發(fā)病例和某些家族性病例。圓錐角膜固有的環(huán)境關(guān)聯(lián)，如揉眼、隱形眼鏡磨損、紫外線暴露等提示，部分圓錐角膜病例可能具有表觀遺傳學(xué)的基礎(chǔ)。表觀遺傳學(xué)涉及的分子機制主要包括DNA甲基化修飾、組蛋白的修飾、染色質(zhì)重塑及非編碼RNA的調(diào)控，是基因與環(huán)境相互作用的基礎(chǔ)。與其他多基因病(如腫瘤)相似，表觀遺傳學(xué)極可能構(gòu)成了遺傳學(xué)、疾病和環(huán)境之間的主要聯(lián)系。這種表觀遺傳關(guān)聯(lián)還可以解釋在遺傳學(xué)研究中所觀察到的不同地區(qū)圓錐角膜患者間的遺傳異質(zhì)性。因此闡明表觀遺傳學(xué)的調(diào)控路徑可能是明確病因的關(guān)鍵。

環(huán)境刺激可通過表觀遺傳學(xué)修飾影響基因的表達。DNA甲基化通常在細胞分裂后仍被保留，因此組織中甲基化狀態(tài)的改變會隨時間積累，所產(chǎn)生的異常表型會應(yīng)對環(huán)境刺激而持續(xù)變化，這反映了基因和環(huán)境的相互作用[58]。揉眼是影響圓錐角膜發(fā)病的環(huán)境刺激之一，揉眼后淚液中IL-6和TNF-α水平升高[59]。這2種蛋白質(zhì)已被證明能夠誘導(dǎo)DNA甲基化，影響基因表達[60-61]。同時遺傳因素影響角膜對環(huán)境刺激的易感性。Udar等[7]報道，可能是由于角膜中SOD1基因的缺陷，導(dǎo)致角膜對紫外線誘導(dǎo)的氧化損傷更為敏感；研究已證實中央角膜厚度相關(guān)基因與圓錐角膜的發(fā)病有關(guān)，較薄的角膜更容易受到揉眼、隱形眼鏡摩擦和紫外線等環(huán)境刺激的影響。遺傳、表觀遺傳學(xué)和環(huán)境因素之間的相互作用通過這種方式得以實現(xiàn)。

一些常見眼部疾病(如糖尿病視網(wǎng)膜病變、老年性黃斑變性和白內(nèi)障)的發(fā)病已被證實與表觀遺傳學(xué)機制相關(guān)[62]，目前圓錐角膜的表觀遺傳學(xué)研究仍較少。有學(xué)者曾研究組織金屬蛋白酶抑制因子3(tissue inhibitors of metalloproteinase 3，TIMP-3)啟動子的甲基化狀態(tài)。TIMP-3的過表達在角膜基質(zhì)細胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)凋亡，這可能是圓錐角膜的病因之一[63]。但目前在少數(shù)受試患者中，沒有證據(jù)表明TIMP-3有任何致病性突變或啟動子甲基化[64]。Kabza等[1]為了驗證DNA甲基化是否可能在圓錐角膜的發(fā)展中起作用，對5例圓錐角膜患者的角膜和5份正常角膜進行了亞硫酸氫鹽還原法測序，檢測到多個圓錐角膜特異性差異甲基化區(qū)域，并將其與先前發(fā)現(xiàn)的易感基因座以及在圓錐角膜中觀察到的Wnt信號通路的轉(zhuǎn)錄組破壞相關(guān)聯(lián)。

與遺傳異常不同，表觀遺傳由于保留了正常的DNA序列，其變化是可逆的，這表明受影響基因具有恢復(fù)其原本功能的潛在可能。甲基化抑制劑是目前腫瘤治療的研究熱點，例如口服阿扎胞苷是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，可從表觀遺傳學(xué)的層面調(diào)節(jié)基因的表達，治療急性髓系白血病[65]。因此，表觀遺傳學(xué)方面的干預(yù)措施可以為圓錐角膜和個性化治療提供新思路。若研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化是準確而敏感的表觀基因組標記，則它還可能有助于圓錐角膜的早期診斷[66]。

4 圓錐角膜體外模型進展

圓錐角膜是一種相對常見的角膜疾病，但其病因錯綜復(fù)雜，目前其發(fā)病機制仍不明確。阻礙其研究進展的重要因素之一是可用于研究的角膜組織稀缺，只能在角膜移植手術(shù)和驗尸期間獲得。同時，圓錐角膜仍沒有較為合適的動物模型。曾有學(xué)者開發(fā)了一種自突變小鼠的近交系，其表型一定程度上模擬了人類圓錐角膜，表現(xiàn)出角膜細胞凋亡和c-fos蛋白表達增加[67]，但該表型具有雄激素依賴性，連鎖分析將易感基因定位于小鼠17號染色體的MHC區(qū)，該區(qū)域包括性別限制蛋白基因的基因座。之后該小組又發(fā)現(xiàn)了日本圓錐角膜小鼠，相關(guān)基因位于小鼠的13號染色體上，但該小鼠與人類相比也顯示出了一些差異，比如角膜尖端常有紅色斑點，并且與人圓錐角膜相反，組織學(xué)檢查顯示出該小鼠角膜中的炎癥變化，如毛細血管和血細胞的浸潤[68]。

目前基于人體細胞的體外3D細胞培養(yǎng)的圓錐角膜模型是一個較好選擇。Karamichos等[69]使用3D培養(yǎng)下的健康人角膜成纖維細胞(human corneal fibroblasts，HCFs)和人圓錐角膜相關(guān)成纖維細胞(human keratoconus fibroblasts，HKCs)比較細胞外基質(zhì)成分的表達和分泌。研究顯示2種不同的TGF-β亞型可誘導(dǎo)產(chǎn)生更多正常的角膜基質(zhì)。該小組還使用體外2D培養(yǎng)模型和3D培養(yǎng)模型證明了HKCs氧化應(yīng)激的水平更高[70]。Sharif等[71-72]認為3D培養(yǎng)系統(tǒng)提供了與天然組織結(jié)構(gòu)更為相似的特征，可以進一步誘導(dǎo)細胞和組織的發(fā)育，在此基礎(chǔ)上他們使用三維培養(yǎng)模型，確定并量化了角膜膠原蛋白交聯(lián)(corneal collagen cross-linking,CXL)在細胞和分子水平的作用，并進一步研究了CXL對角膜微環(huán)境的影響[73]。

3D培養(yǎng)系統(tǒng)提供和人體組織結(jié)構(gòu)更為相似的特征，因此3D培養(yǎng)模型可以用于探索圓錐角膜的發(fā)病機制和代謝改變，以及評價治療方法的功效和作用。

5 小結(jié)

圓錐角膜的病因復(fù)雜，尚未明確，可能是遺傳、表觀遺傳和環(huán)境刺激之間復(fù)雜相互作用的結(jié)果。目前為止的遺傳學(xué)研究說明圓錐角膜的遺傳涉及多個基因參與，存在異質(zhì)性，缺乏不同地理區(qū)域人群之間的一致性，僅靠遺傳學(xué)尚不能解釋圓錐角膜的發(fā)病機制。闡明表觀遺傳學(xué)的調(diào)控路徑可能是明確病因的關(guān)鍵，表觀遺傳極可能構(gòu)成了遺傳學(xué)、疾病和環(huán)境之間的主要聯(lián)系和相互作用。