電針刺激對單眼形覺剝奪弱視大鼠初級視皮層中多巴胺、γ-氨基丁酸及其受體mRNA表達的影響△

張秀艷 畢愛玲 吳姍姍 徐福如 畢宏生

弱視是一種與初級視皮層發(fā)育有關(guān)的兒童常見眼病[1]，該病是由早期視覺發(fā)育異常(單眼斜視、屈光參差、高度屈光不正及形覺剝奪等)所引起，患兒單眼或雙眼最佳矯正視力低于正常兒童，但眼部檢查無器質(zhì)性病變。近年來，隨著弱視患病率的不斷升高[2-5]，研究弱視的發(fā)病機制及治療方法顯得尤為重要。針灸作為一種治療弱視的輔助方法，在臨床上取得了較好的效果，但關(guān)于針灸治療弱視的分子生物學(xué)機制研究較少。目前，研究顯示多巴胺(dopamine,DA)、γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)是弱視發(fā)病機制中主要的中樞神經(jīng)調(diào)控遞質(zhì)，可參與視覺發(fā)育敏感期初級視皮層突觸的可塑性過程[6-7]。本研究探討電針刺激對單眼形覺剝奪弱視大鼠初級視皮層中DA、GABA的含量及其受體(D1受體和GABAA受體)mRNA表達的影響，初步分析電針治療弱視的分子生物學(xué)機制，為臨床針灸治療弱視提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康SD大鼠36只，體質(zhì)量(12±2)g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0011。實驗動物的飼養(yǎng)和使用得到山東中醫(yī)藥大學(xué)眼科研究所動物管理和使用委員會的批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器DA(德國 Dr.Ehrenstorfer公司)，GABA標(biāo)準(zhǔn)品(美國 Sigma公司)，組織/細胞RNA快速提取試劑盒(北京艾來德生物有限公司)，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SYBR Green I試劑盒(美國 Roche公司)，高效液相色譜-紫外檢測器Dionex UltiMate 3000(德國戴安公司)，ACCLARM120C18色譜柱(美國 Waters公司)，實時熒光定量PCR儀(美國Roche公司)，腦切片模具(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠單眼形覺剝奪弱視模型的建立將鼠齡13 d的大鼠(尚未睜眼)隨機分為3組：正常對照組、弱視模型組、電針治療組，每組12只。正常對照組大鼠不做任何處理，弱視模型組、電針治療組大鼠右眼參照文獻[8]進行單眼形覺剝奪弱視造模。其具體操作方法為：腹腔注射10 g·L-1戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)將大鼠麻醉后，用生理鹽水對右眼進行徹底清潔，剪除上、下眼瞼各0.8～1.0 mm，并用眼科帶線縫合針分層縫合。術(shù)后3 d在縫合處涂氧氟沙星及紅霉素眼膏防止感染，同時，檢查是否出現(xiàn)脫線、漏光及感染等情況，出現(xiàn)上述情況不再納入后續(xù)實驗。三組大鼠均在自然光下飼養(yǎng)45 d后，剪開右眼眼瞼。

1.3.2 電針刺激干預(yù)電針治療組大鼠在生后30～60 d選取左側(cè)太陽、合谷，右側(cè)太陽、攢竹進行電針刺激干預(yù)，百會和右側(cè)合谷僅給予針刺，不通電。每天同一時間段電針刺激干預(yù)30 min，頻率2 Hz，脈沖長度0.1 s，每周至少干預(yù)6 d。

1.3.3 取材將大鼠腹腔注射10 g·L-1戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉后，快速斷頭取腦組織，放于腦切片模具中，參考大鼠腦立體定位圖譜[9]，以海馬附近的胼胝體白質(zhì)為標(biāo)志截取大鼠左側(cè)初級視皮層，轉(zhuǎn)移至EP管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 各組大鼠初級視皮層中DA、GABA含量檢測分別精密稱取適量的DA、GABA標(biāo)準(zhǔn)品，放于10 mL定量瓶中，加0.1 mol·L-1的高氯酸溶解并定容到刻度線，作為儲備液。每組分別取6只大鼠初級視皮層，按質(zhì)量體積比(1 mg10 μL)加蒸餾水，于冰上充分研磨制備成勻漿液。在4 ℃、1500 r·min-1離心20 min，取上清，再以相同的轉(zhuǎn)速離心20 min，取上清進樣測定。

采用高效液相色譜-紫外檢測器及WatersC18(2.1 mm×150.0 mm,3 μm)色譜柱進行檢測。流動相A為925 mL醋酸鈉緩沖液(0.15 mol·L-1)，加醋酸調(diào)制pH為6.5，然后加乙腈75 mL混勻；流動相B為乙腈、甲醇、水的混合液，體積比為 311。柱溫為30 ℃，流速為1 mL·min-1，檢測波長為254 nm。梯度洗脫：0 min、100% A，6 min、94% A，15 min、91% A，20 min、55% A，30 min、0% A，35 min、100% A；根據(jù)色譜圖峰面積計算各組大鼠初級視皮層中DA、GABA含量。

1.3.5 各組大鼠初級視皮層中D1受體、GABAA受體 mRNA表達的檢測每組分別取6只大鼠初級視皮層組織，根據(jù)組織/細胞RNA快速提取試劑盒說明書進行總RNA的提取，使用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA的合成。采用實時熒光定量PCR儀檢測D1受體、GABAA受體 mRNA的表達，以β-actin作為反應(yīng)的內(nèi)參。利用DNA Star軟件設(shè)計引物序列并由上海生工生物工程股份有限公司進行合成，相關(guān)引物序列見表1。采用2-△△Ct方法對各組結(jié)果進行分析，將正常對照組的目的基因相對表達量設(shè)為1。

表1 實驗所用引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠初級視皮層中DA、GABA的含量檢測結(jié)果顯示，弱視模型組大鼠初級視皮層中DA、GABA的含量均低于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)；電針治療組DA的含量低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而GABA的含量與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。電針治療組大鼠初級視皮層中DA、GABA的含量均高于弱視模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(見圖1)。由此可見，單眼形覺剝奪弱視可造成大鼠大腦初級視皮層中DA、GABA的分泌異常，電針治療后可顯著改善這種異常的表達。

圖1 各組大鼠初級視皮層中DA、GABA的含量 NC：正常對照組；AM：弱視模型組；AM+EA：電針治療組。與正常對照組相比，*P<0.05；與弱視模型組相比，#P<0.05

2.2 各組大鼠初級視皮層中D1受體、mRNA、GABAA受體 mRNA的表達檢測結(jié)果顯示，弱視模型組和電針治療組大鼠初級視皮層中D1受體、GABAA受體 mRNA的表達均低于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)；電針治療組GABAA受體 mRNA的表達高于弱視模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而D1受體 mRNA的表達與弱視模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖2)。提示電針可正向調(diào)節(jié)GABAA受體 mRNA的表達，提高大鼠初級視皮層突觸的可塑性，從而起到治療弱視的作用。

圖2 各組大鼠初級視皮層中D1受體mRNA、GABAA受體 mRNA的表達 NC：正常對照組；AM：弱視模型組；AM+EA：電針治療組。與正常對照組相比，*P<0.05；與弱視模型組相比，#P<0.05

3 討論

人和哺乳動物的視覺發(fā)育不僅受自身因素的影響[10]，還與外部環(huán)境刺激有關(guān)。在視覺發(fā)育的敏感期，視覺系統(tǒng)可根據(jù)視覺環(huán)境的刺激調(diào)整和改變初級視皮層神經(jīng)元之間的連接，即突觸結(jié)構(gòu)[11]。在此階段，若兩眼接受相同程度的視覺信號輸入，則雙側(cè)初級視皮層內(nèi)的神經(jīng)元和突觸可保持平衡；反之，這種平衡將被打破，從而表現(xiàn)出兩眼視覺上的差異，此時眼優(yōu)勢柱向接受信號多的一眼轉(zhuǎn)移。本實驗在大鼠視覺發(fā)育關(guān)鍵期進行單眼縫合，這種異常的視覺經(jīng)驗削弱了光線對視網(wǎng)膜的刺激，使視覺通路不能有效地將神經(jīng)沖動傳遞到縫合眼的初級視皮層，引起縫合眼對側(cè)視皮層神經(jīng)元及突觸結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[12]，從而導(dǎo)致與視覺發(fā)育相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)質(zhì)分泌出現(xiàn)異常[13]。以往的研究顯示，弱視可導(dǎo)致初級視皮層結(jié)構(gòu)和功能的異常，因此，深入研究初級視皮層在弱視發(fā)生過程中的作用意義重大，且可為臨床防治弱視提供一定的理論依據(jù)。

目前，絕大多數(shù)研究者認為，DA及GABA存在于初級視皮層中，并調(diào)控視覺發(fā)育敏感期內(nèi)初級視皮層突觸的可塑性。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)，弱視貓初級視皮層中存在DA減少的現(xiàn)象，增加DA的含量可改善初級視皮層的結(jié)構(gòu)，并抑制皮層組織內(nèi)神經(jīng)元的損傷。Razeghinejad等[15]研究發(fā)現(xiàn)，單劑量的左旋多巴可穿過血-腦屏障轉(zhuǎn)換為DA，從而治療弱視，改善弱視患者的雙眼視功能。

在大腦初級視皮層的發(fā)育過程中，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)保持相對平衡是控制視覺發(fā)育敏感期開始和結(jié)束的關(guān)鍵。GABA是最早被發(fā)現(xiàn)的與初級視皮層可塑性有密切關(guān)系的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[16]，且廣泛分布于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)。研究顯示，缺乏GABA合成酶的小鼠初級視皮層不具備可塑性，在初級視皮層內(nèi)注射GABA激動劑可使GABA合成酶基因缺失的小鼠重新表現(xiàn)出初級視皮層的可塑性。與上述結(jié)果一致，Leventhal等[17]研究發(fā)現(xiàn)，使用GABAA受體拮抗劑可抑制青壯年猴的視覺功能，而GABA、GABAA受體激動劑可提高老年猴的視覺功能。同時，邵立功等[18]對單眼形覺剝奪貓進行研究發(fā)現(xiàn)，剝奪眼對側(cè)視皮層GABA神經(jīng)元數(shù)量較正常眼明顯減少。此外，GABA受體還可能參與視皮層眼優(yōu)勢柱的轉(zhuǎn)移[19-20]。

針灸治療弱視在臨床上已取得肯定療效，但其治療機制尚不清楚[21]。本研究對弱視大鼠進行電針刺激干預(yù)，結(jié)果顯示，建模后弱視大鼠初級視皮層中DA、GABA的含量及其受體mRNA表達均下調(diào)，而在電針治療組中兩者的含量及其GABAA受體mRNA表達均呈恢復(fù)性上調(diào)，提示弱視的發(fā)生、發(fā)展確實與初級視皮層中DA、GABA及其GABAA受體 mRNA的表達關(guān)系密切，電針治療弱視可能是通過提高DA、GABA及其GABAA受體 mRNA表達來發(fā)揮作用的。由上述結(jié)果我們可以得出，視覺發(fā)育過程中若遭遇異常的視覺經(jīng)驗(如單眼形覺剝奪)，可引起初級視皮層接收到的視覺刺激減少，導(dǎo)致神經(jīng)沖動減弱甚至喪失[22]，造成與視覺發(fā)育有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)分泌出現(xiàn)異常，如初級視皮層DA、GABA含量降低，長期的視覺剝奪使視覺系統(tǒng)的傳輸能力逐漸處于休眠狀態(tài)[23]，最終形成弱視。而采用針刺干預(yù)可使初級視皮層中DA和GABA表達上調(diào)，進而激活休眠狀態(tài)下的視覺通路及神經(jīng)傳輸系統(tǒng)，改善視覺轉(zhuǎn)導(dǎo)狀態(tài)，恢復(fù)視覺發(fā)育的可塑性[24]，使弱視眼視功能得到改善。