胞外囊泡介導(dǎo)的蟲媒病毒傳播機(jī)制及其應(yīng)用前景*

王 欣 秦 通 張美娜 孫 毅**

(1. 淮安市清江浦區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江蘇淮安 223001；2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市蟲媒病與自然疫源性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100071)

蟲媒病毒病(arbovirus diseases)，是一類借助蚊、蜱、螨、蛉等媒介節(jié)肢動物進(jìn)行傳播、由病毒引起的自然疫源性疾病。這些蟲媒病毒病，盡管可防可控，但依舊是導(dǎo)致人類較高病死率的致病元兇(LaBeaud，2008)。更為重要的是，隨著當(dāng)前全球性的氣候變暖、城鎮(zhèn)化加速和疫源地生境破碎化加劇，蟲媒棲息環(huán)境和數(shù)量的迅速擴(kuò)張，再加上人群活動頻繁造成的暴露機(jī)會激增，使蟲媒病毒病的健康威脅日益加劇，僅登革熱病毒，每年就感染2.5億人，造成5千萬臨床病例和2.5萬人死亡(Gubler，2002)；而新近發(fā)現(xiàn)的發(fā)熱伴血小板減少綜合征及其類似蜱媒病毒造成的人類健康危害、經(jīng)濟(jì)困頓和社會動蕩也引起了全世界的普遍關(guān)注(Silvasetal., 2016)。因此，科學(xué)應(yīng)對蟲媒病毒的危害是當(dāng)前重大傳染病防控工作中的重中之重。

研究表明，細(xì)胞間信息通訊是蟲媒病毒靈活的感染方式和多變的抗免疫策略的生理基礎(chǔ)(Sultanaetal., 2020)。蟲媒病毒在不同的靶標(biāo)細(xì)胞、組織甚至器官之間的靈活穿梭離不開承擔(dān)細(xì)胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信息通訊的重要工具——胞外囊泡。胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)是直徑30～150 nm，由細(xì)胞的末期內(nèi)酶體組件多囊泡體形成的、具有細(xì)胞間通訊、轉(zhuǎn)運(yùn)功能的內(nèi)吞性納米級小體。對胞外囊泡功能的認(rèn)知，最初僅局限于細(xì)胞處理代謝廢物方面，隨著對其內(nèi)含物的系統(tǒng)分析，胞外囊泡在細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)多肽、蛋白、脂肪、DNA、RNA、microRNA、mitochondrial DNA的作用日漸明晰，胞外囊泡作為細(xì)胞間通訊工具的功能也被廣泛接受，并作為抗原提呈、藥物分子精準(zhǔn)遞送的新型工具成功應(yīng)用于臨床治療(Sunetal. 2018; Vanetal., 2018)。然而，相對于哺乳動物胞外囊泡研究與應(yīng)用的飛速發(fā)展，節(jié)肢動物細(xì)胞可能存在的胞外囊泡及其潛在的科學(xué)價值還缺乏系統(tǒng)研究(Meganetal., 2020)。近期，蜱、蚊等節(jié)肢動物細(xì)胞外泌體等胞外囊泡的相關(guān)報道，為明確蟲媒病傳播的內(nèi)在機(jī)制和分子基礎(chǔ)提供了新的思路。為此，本文就蟲媒病毒傳播相關(guān)的胞外囊泡進(jìn)行系統(tǒng)回顧，從病毒、媒介、宿主相互作用的三方關(guān)系總結(jié)蟲媒病毒傳播的共性規(guī)律，探討胞外囊泡介導(dǎo)蟲媒病毒傳播的內(nèi)在機(jī)制和分子基礎(chǔ)。

1 胞外囊泡參與節(jié)肢動物吸血和對蟲媒病毒傳播的介導(dǎo)作用

蟲媒病毒對媒介節(jié)肢動物的依賴性并不局限于對蟲媒病毒的機(jī)械承載，媒介節(jié)肢動物的涎液、基節(jié)腺等分泌物還存在著促感染、抗免疫的生理功能，涎液輔助傳播(saliva assistant transmission)已成為蟲媒病毒感染恒溫脊椎動物(人)的主要方式，媒介節(jié)肢動物涎腺及其分泌的涎液也成了關(guān)聯(lián)蟲媒病毒、媒介節(jié)肢動物和宿主動物三方的關(guān)鍵性介質(zhì)(Nuttall, 2019; Chowdhuryetal., 2020; Guerreroetal., 2020)。研究表明，蚊、蜱等媒介節(jié)肢動物的涎液，除含有水、鈉、鉀粒子外，還有非肽類分子(腺苷、前列腺素、內(nèi)源性大麻酚)、肽類(變異素、璃眼蜱素)、蛋白(幾丁質(zhì)酶、脂蛋白、金屬蛋白酶、粘蛋白)和宿主源蛋白(免疫球蛋白、珠結(jié)合球蛋白)等，最為重要的是還從涎液中鑒定出外泌體等胞外囊泡(Nuttall, 2019; Sunetal., 2020)。這表明包括外泌體在內(nèi)的胞外囊泡并不單純是蟲媒病毒及其組分的運(yùn)載工具，還能調(diào)控蟲媒病毒的擴(kuò)散(Chvezetal., 2019)。近期研究表明，蜱在吸血過程中，外泌體分子標(biāo)記-熱休克蛋白HSP70的數(shù)量增加，提示蜱類涎液中外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與血餐纖維蛋白原的降解過程(Voraetal., 2017)。同時，另一項(xiàng)研究則展示了蜱類涎腺microRNA在宿主—媒介層面上調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)的情況，并鎖定這些microRNA(miR-8-3p, miR-425 bantam-3p, miR-317-3p和miR-279a-3p)是來源于涎液中的外泌體(Hackenbergetal., 2017)。因此，有理由推測，蜱類涎腺外泌體可攜帶熱休克蛋白和miRNAs, 進(jìn)而參與纖維蛋白原的降解和宿主免疫相關(guān)基因的調(diào)控，進(jìn)而促進(jìn)蜱類吸血和蟲媒病毒的傳播。這些研究表明，媒介節(jié)肢動物的涎液、基節(jié)液等不僅存在調(diào)節(jié)宿主免疫的抑制因子、調(diào)節(jié)因子、抗補(bǔ)體活性成分以及宿主受體識別分子等，還存在著轉(zhuǎn)運(yùn)這些物質(zhì)的外泌體或其他胞外囊泡，它們在蟲媒病毒傳播過程中發(fā)揮著不可替代的關(guān)鍵作用(Sultanaetal., 2020)。

多種病毒存在籠絡(luò)胞外囊泡或外泌體生成途徑的傳播形式(Laietal., 2015)。登革病毒II和III型病毒感染可導(dǎo)致白紋伊蚊AedesalbopictusC6/36細(xì)胞、埃及伊蚊AedesaegyptiAag-2細(xì)胞產(chǎn)生含有病毒RNA和病毒蛋白的外泌體，該外泌體還通過含糖蛋白的四跨膜蛋白(tetraspanin)結(jié)構(gòu)域Tsp29Fb感染人上皮成角質(zhì)細(xì)胞(skin keratinocytes, HaCaT)和血管內(nèi)皮細(xì)胞(human vascular endoepithelial, HUVEC)(Voraetal., 2017)。皮質(zhì)神經(jīng)元(cortical neurons)外泌體通過對寨卡病毒 (Zika virus, ZIKV) RNA和病毒蛋白的包裝和胞外轉(zhuǎn)運(yùn)，介導(dǎo)著ZIKV在蚊蟲細(xì)胞間的擴(kuò)散和傳播(Zhouetal., 2019; Kobayashietal., 2020)。此外，新布尼亞病毒SFTSV感染可誘導(dǎo)Hela與Vero細(xì)胞早期內(nèi)酶體特異性標(biāo)記分子Rab-5及自噬因子標(biāo)記LC3與布尼亞病毒在囊泡膜上的共定位，并借此將該布尼亞病毒釋放至宿主細(xì)胞間隙(Silvasetal., 2016)。同時，肩突硬蜱Ixodesscapularis細(xì)胞ISE6培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)含有蘭加特病毒(LGTV)RNA及其非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的外泌體，這些外泌體使LGTV以網(wǎng)格蛋白依賴方式感染上皮成角質(zhì)細(xì)胞HaCaT和鼠神經(jīng)母細(xì)胞N2a (Neuro-2a, N2a) (Zhouetal., 2019)。這些雖是局限于離體細(xì)胞的初步研究，但我們有理由相信，外泌體等胞外囊泡介導(dǎo)的蟲媒病毒傳播模式是極可能存在的。這是因?yàn)?1)多種類型的媒介節(jié)肢動物和脊椎動物的宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生外泌體等胞外囊泡，并且胞外囊泡廣泛分布在涎液、血淋巴、乳汁、血漿、羊水和尿液等體液或分泌物中。Zhou等(2018)在蜱卵細(xì)胞ISE6培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)外泌體等胞外囊泡的存在，并且外泌體中的熱休克蛋白HSP70被證實(shí)同宿主動物在蜱叮咬部位的纖維化凝集過程相關(guān)。(2)外泌體等胞外囊泡所具備的脂質(zhì)雙層膜含有鞘磷脂、磷脂酰絲氨酸、膽固醇、神經(jīng)酰胺等成分，可保護(hù)包括病毒蛋白或病毒顆粒等在內(nèi)的內(nèi)含物不受中和降解或侵蝕(Santianaetal., 2018)，使蟲媒病毒通過長時間、長距離的胞外運(yùn)輸，仍能保持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性和感染力(Févrieretal., 2004)。(3)外泌體等胞外囊泡的膜蛋白除了包含膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白flotillin-1、flotillin-2、融合蛋白(GTP激酶、膜聯(lián)蛋白、Rab蛋白家族等)、跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82等)、熱休克蛋白家族(HSP60、HSP70、HSP90等)等必需的結(jié)構(gòu)蛋白外，還可插組感染病毒的相關(guān)蛋白，如糖蛋白glycoproteins(Gn/Gc) 或非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structuralproteins，NS)(Silvasetal., 2016)以及受體復(fù)合物等，從而幫助病毒將病毒核酸復(fù)制體準(zhǔn)確定殖在囊泡系統(tǒng)的內(nèi)膜表面，然后通過囊泡外膜的表面蛋白或多糖等配體識別受體細(xì)胞。(4)外泌體等胞外囊泡在運(yùn)輸病毒或病毒元件的同時，還通過轉(zhuǎn)運(yùn)功能蛋白、核酸(DNA、lncRNA、miRNA、mRNA、cirRNA、miRNA等)或轉(zhuǎn)錄因子等活性分子，向受體細(xì)胞傳送病毒入侵所需的調(diào)控信息，進(jìn)而刺激受體細(xì)胞，調(diào)控機(jī)體免疫或細(xì)胞凋亡，實(shí)現(xiàn)免疫逃逸和成功入侵。Lenassi等(2010)和Arenaccio等 (2014)發(fā)現(xiàn)，外泌體中錨定蛋白Nef可以促進(jìn)T細(xì)胞凋亡，使HIV病人的CD4+T急劇消耗(Lenassietal., 2010; Arenaccioetal., 2014)。Ahsan等(2016)也發(fā)現(xiàn)外泌體可通過誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡的方式促進(jìn)裂谷熱病毒RVFV對機(jī)體細(xì)胞的感染(Ashanetal., 2016)。而人皰疹病毒6型(human herpesviruse 6, HHV-6)感染細(xì)胞后，其外泌體對于MHC-Ⅰ的轉(zhuǎn)運(yùn)上調(diào)，從而下調(diào)受體細(xì)胞對于病毒的遞呈，協(xié)助病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)(Kotsyfakisetal., 2006; Otaetal., 2014；Masoudetal., 2020)。(5)同時，在形成外泌體等胞外囊泡的過程中，蟲媒病毒非結(jié)構(gòu)蛋白泛素化位點(diǎn)激活的囊泡分揀蛋白復(fù)合物(如endosomal sorting complex required for transport, ESCRT)及其介導(dǎo)的分揀包裝途徑，也為病毒實(shí)現(xiàn)其個性化定制包裝提供了條件(Fengetal., 2013;Yuetal., 2016)。由此可見，外泌體等胞外囊泡生成途徑可能在介導(dǎo)蟲媒病毒傳播中發(fā)揮關(guān)鍵作用(tibrániováetal., 2019)。

黃病毒屬的蟲媒病毒，包括蚊媒傳播的寨卡病毒(ZIKV)、登革病毒(DENV)、西尼羅病毒 (WNV)、黃熱病毒(YFV)等以及蜱媒傳播的波瓦桑病毒熱(POWV)、蘭加特病毒(LGTV)、森林腦炎(TBEV)等感染細(xì)胞的方式大多是通過網(wǎng)格蛋白clathrin受體介導(dǎo)的內(nèi)吞方式(endocytosis)。這種內(nèi)吞式感染方式使蟲媒病毒利用胞外囊泡的可能性大大增加(Voraetal., 2018)。蘭加特病毒的感染可促進(jìn)受體細(xì)胞的胞外囊泡的分泌，這些囊泡直徑大多在30～150 nm之間(Zhouetal., 2019)。此外，蘭加特病毒、登革病毒的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體包含著病毒的RNA、包膜蛋白E以及非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，這表明，蟲媒病毒利用宿主細(xì)胞外泌體進(jìn)行細(xì)胞間的信息和物質(zhì)傳遞。更有趣的是，DENV2的全長RNA和發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒SFTSV的全長RNA分別在其宿主細(xì)胞的胞外囊泡中檢出(Voraetal., 2018; Silvasetal., 2016；Goldetal., 2020)。因此，胞外囊泡也可能轉(zhuǎn)運(yùn)完整病毒粒子，有人推測胞外囊泡介導(dǎo)的蟲媒病毒傳播可能以隨時出發(fā)的快餐車方式，加速病毒基因組的復(fù)制、翻譯和糖蛋白的合成。鑒于黃病毒顆粒一般在40～60 nm之間，外泌體可包含2～3個黃病毒顆粒，大的胞外囊泡甚至可攜帶6～8個病毒粒子。從蘭加特病毒感染的蜱細(xì)胞和登革病毒感染的蚊細(xì)胞來看，利用攜帶病毒遺傳信息及蛋白信息的外泌體或胞外囊泡比病毒直接感染更加有效(Taanketal., 2017; 2018; Zhouetal., 2019)。此外，攜帶病毒組分的感染性外泌體可有效感染人上皮成角質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，表明蜱和蚊類的外泌體可以同宿主的靶標(biāo)細(xì)胞以融合內(nèi)吞的方式，促進(jìn)蟲媒病毒的傳播。同時，寨卡病毒(ZIKV)和西尼羅病毒(WNV)病毒RNA在神經(jīng)元外泌體的存在，也為蟲媒病毒的嗜神經(jīng)擴(kuò)散提供了依據(jù)(Kobayashietal.，2020)。

與此同時，媒介節(jié)肢動物體內(nèi)的胞外囊泡也在蟲媒病毒的擴(kuò)散和應(yīng)對節(jié)肢動物的天生免疫中發(fā)揮重要作用。通過網(wǎng)格蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞方式，蟲媒病毒E蛋白與膜表面的受體融合進(jìn)而感染媒介節(jié)肢動物。正如前述，節(jié)肢動物的圍食膜、中腸上皮、涎腺以及卵泡細(xì)胞的外泌體都可能介導(dǎo)蟲媒病毒在媒介節(jié)肢動物體內(nèi)的擴(kuò)散和傳播。這些靶標(biāo)細(xì)胞都可分泌產(chǎn)生胞外囊泡(Laietal., 2015)，胞外囊泡表面的四聚穿膜蛋白Tsp29Fb編碼基因的沉默或抗體封閉可顯著降低蚊類細(xì)胞的登革病毒載量和外泌體數(shù)量(Voraetal., 2017)，同時，感染細(xì)胞分泌的外泌體顯著大于未感染細(xì)胞分泌的外泌體(Reyes-Ruizetal., 2019)，這表明Tsp29Fb介導(dǎo)的登革病毒在節(jié)肢動物體內(nèi)復(fù)制和擴(kuò)散作用不容忽視。因此，胞外囊泡介導(dǎo)的蟲媒病毒在節(jié)肢動物和脊椎動物細(xì)胞間的傳播和擴(kuò)散是普遍存在的。

2 胞外囊泡對蟲媒病毒傳播介導(dǎo)的主要途徑

2.1 蟲媒病毒的水平傳播

蚊、蜱等媒介節(jié)肢動物對蟲媒病毒的水平傳播，通常以經(jīng)期傳播和和共同吸血傳播的(cofeeding transmission, CFT)方式進(jìn)行，以中腸、涎腺、血淋巴等為靶標(biāo)的經(jīng)期傳播，可促使蟲媒病媒逃避媒介節(jié)肢動物變態(tài)發(fā)育過程中的組織溶解和再生過程的脅迫，從而使蟲媒病毒在媒介節(jié)肢動物體內(nèi)得以長期保存。蚊類的水、陸階段性生活習(xí)性以及蜱類的耐饑、壽命長等特點(diǎn)賦予了蟲媒病毒在自然界長期保存的基礎(chǔ)條件(Boothetal., 1991)。媒介體內(nèi)多樣化的受體細(xì)胞及其胞外囊泡可為蟲媒病毒提供多樣化的存貯方式，并通過不同的外泌體等胞外囊泡在靶標(biāo)細(xì)胞、組織或器官之間進(jìn)行信息通訊。同時，在涎液協(xié)助下，通過叮咬同一寄主，蟲媒病毒可從感染的媒介節(jié)肢動物個體傳播到未感染個體，而不引起宿主動物的感染(Gordonetal., 1993; Labudaetal., 1997)。這種共同吸血傳播模式可能與外泌體隨時可用快餐車式的傳播方式及宿主初級免疫細(xì)胞的快速擴(kuò)散密切相關(guān)，可有效避免脊椎動物宿主的次級免疫脅迫，無疑是蟲媒病毒自然適應(yīng)積極策略之一。盡管對于媒介節(jié)肢動物靶標(biāo)細(xì)胞的胞外囊泡的研究才剛剛起步，但已有的研究表明，和其他病毒類似，大多蟲媒病毒(黃病毒屬等)非結(jié)構(gòu)蛋白域存在E3-ubiquitin-ligase泛素化功能位點(diǎn)(Bharajetal., 2016; Preetietal., 2017)，該位點(diǎn)可與細(xì)胞及其胞外囊泡的囊膜表面特異性結(jié)合，并通過泛素化修飾、啟動由ESCRT(轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)體分選復(fù)合物)執(zhí)行的病毒及其傳播相關(guān)組分的分選、外泌體生成和轉(zhuǎn)運(yùn)過程(Jeremyetal., 2010；J?rgetal., 2013)。通過類似的機(jī)制，蟲媒病毒及其傳播相關(guān)組分可識別宿主細(xì)胞，并通過宿主細(xì)胞CC亞族趨化因子受體(cysteine-cysteine chemokine receptor 5, CCR5)通路或RANTES(激活T淋巴細(xì)胞表達(dá)與分泌調(diào)控因子)誘導(dǎo)單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及嗜酸性細(xì)胞的分化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)免疫抑制或逃逸目的(Arenaccioetal., 2014)。

2.2 蟲媒病毒的垂直傳播

除水平傳播外，蟲媒病毒還具有通過卵巢感染傳播至子代的經(jīng)卵傳播，亦稱垂直傳播。在媒介節(jié)肢動物體內(nèi)，卵巢發(fā)育與卵子成熟都離不開血淋巴中的營養(yǎng)與氧氣供應(yīng)，在此過程中，蟲媒病毒隨血淋巴的流動進(jìn)入卵巢(Vlastaetal., 2019)。目前，蟲媒病毒進(jìn)入卵巢的分子機(jī)制尚不清楚，推測其可能的途徑主要包括基于肌動蛋白的微管活動機(jī)制(actin based tubule motility)、卵黃蛋白原(vitellogenin，Vg)介導(dǎo)的病毒入侵機(jī)制和卵黃蛋白吸收入侵機(jī)制(endocytic yolk uptake mechanism)等。研究發(fā)現(xiàn)，蟲媒病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structural proteins, NSs)可與肌動蛋白、肌球蛋白(myosin)、卵黃蛋白原、水孔蛋白(tropomoduli)以及攜脂蛋白前體(lipophorin precursor)等特異性互作(Chotiwanetal., 2018; Santianaetal., 2018)，進(jìn)而誘導(dǎo)卵巢微纖管(microvilli)的生成和卵黃蛋白的吸收，這一過程促使蟲媒病毒進(jìn)入卵泡細(xì)胞繼而感染卵子(Bronsomsetal., 2011; Brackneyetal., 2016; Cabezasetal., 2017; Chávezetal., 2019)。其中，蟲媒病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其分子轉(zhuǎn)運(yùn)是否同卵巢細(xì)胞的外泌體或胞外囊泡有關(guān)，尚不得而知，至于能否歸因于蟲媒病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的泛素化受體結(jié)合機(jī)制(Bharajetal., 2016; Preetietal., 2017)，還需進(jìn)一步研究。

3 胞外囊泡在未來蟲媒病毒病防控中的應(yīng)用前景

由于蚊、蜱等媒介節(jié)肢動物可以向其涎液中釋放具有轉(zhuǎn)運(yùn)和信息通訊功能的外泌體等胞外囊泡，因而，涎液中胞外囊泡的深入研究將為揭示蟲媒病毒傳播的內(nèi)在機(jī)制和分子基礎(chǔ)提供全新的研究思路(Manningetal., 2018)。然而，由于媒介節(jié)肢動物涎腺、血淋巴等體液的體量限制，從這些體液或分泌物中分離胞外囊泡或外泌體的工作具有很大的挑戰(zhàn)性。隨著轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組高通量測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，這些限制條件勢必得以顯著改善。通過高通量技術(shù)對媒介節(jié)肢動物外泌體等胞外囊泡的系統(tǒng)分析，將可以明確這些囊泡體或外泌體所攜帶的活性成分的組成全貌，明確參與蟲媒病毒的擴(kuò)散與傳播的活性組分，以及參與媒介節(jié)肢動物天生免疫調(diào)節(jié)和宿主動物被動免疫逃逸機(jī)制的具體組分，進(jìn)而揭示這些囊泡或外泌體參與蟲媒病毒傳播的具體機(jī)制。在未來一段時間內(nèi)，集中解析媒介節(jié)肢動物的胞外囊泡或特定外泌體與靶標(biāo)細(xì)胞的結(jié)合機(jī)制及其對蟲媒病毒傳播的調(diào)控作用，將是該領(lǐng)域研究的關(guān)鍵科學(xué)問題。鑒于針對蚊、蜱等媒介節(jié)肢動物的傳播阻斷疫苗的空白，利用外泌體等胞外囊泡抗原研發(fā)新型傳播阻斷疫苗也將是未來蟲媒傳染病防控的有效手段(Jungbauer, 2018)。這些工作也將為未來發(fā)展基于胞外囊泡或外泌體的蟲媒病治療對策提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。