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    一種熒光RPA方法鑒定伊蚊的研究*

    2020-03-26 02:48:10張曉龍劉瑩瑩曹曉梅
    寄生蟲與醫(yī)學昆蟲學報 2020年4期
    關(guān)鍵詞:庫蚊伊蚊埃及

    李 穎 張曉龍 慈 穎 劉瑩瑩 楊 燕 曹曉梅

    (中國檢驗檢疫科學研究院,北京 100176)

    蚊蟲是一類重要的醫(yī)學媒介,不同種屬蚊蟲傳播的病原有差別,伊蚊可傳播登革熱、基孔肯雅熱以及黃熱病等多種疾病(邊長玲等,2009;馬孟哲等,2019),而庫蚊則可傳播流行性乙型腦炎,因此蚊種鑒定對蚊媒疾病的防控有重要意義。目前,用于蚊蟲的分類鑒定的方法主要有形態(tài)學鑒定和分子鑒定。形態(tài)學鑒定目前多限于成蚊和4齡幼蟲的形態(tài)鑒別(孫立新等,2010),并且受采集過程、采集方法及標本運送過程的影響,當專業(yè)人員鑒定時,許多蚊蟲標本已殘缺不全,難以進行準確的形態(tài)學鑒定分類,或者受蚊種鑒定人員的水平所限,鑒定結(jié)果產(chǎn)生偏差。分子生物學鑒別技術(shù)從分子水平上闡明物種間的差別,不受樣本形態(tài)完整程度、齡期等的限制,所需樣本量少,是解決蚊蟲分類難題的有效手段。

    重組酶聚合酶擴增(Recombinase polymerase amplification,RPA)是一種由重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和鏈置換聚合酶參與的恒溫擴增新技術(shù),可實現(xiàn)較低溫度(23℃~45℃)核酸快速(5~20 min)擴增(杜亞楠等,2018)。自2006年RPA技術(shù)問世以來,已取得長足發(fā)展,與不同的檢測方法結(jié)合建立了實時熒光RPA、RPA-LFD(側(cè)流層析試紙條檢測)、RPA-ELISA等技術(shù),在病毒與細菌檢測、動植物檢驗檢疫、食品安全檢測與基因突變等方面得到廣泛應用。

    本研究根據(jù)白紋伊蚊Aedesalbopictus、埃及伊蚊Ae.aegypti的rDNA-ITS2序列,建立了伊蚊實時熒光RPA鑒定方法,實現(xiàn)了對白紋伊蚊、埃及伊蚊的特異性鑒別,可用于常見伊蚊的現(xiàn)場鑒定,并為其他蚊種的分類鑒定研究提供新的思路和依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 蚊蟲樣本

    白紋伊蚊Aedesalbopictus、埃及伊蚊Ae.aegypti、 刺擾伊蚊Ae.vexans、背點伊蚊Ae.dorsalis樣本由大連國際旅行衛(wèi)生保健中心饋贈,三帶喙庫蚊Culextritaeniorhynchus、中華按蚊An.ophelessinensis、常型曼蚊Mansoniauniformis為本實驗室保存樣本。樣本依據(jù)《中國重要醫(yī)學昆蟲分類與鑒別》、《中國國境口岸醫(yī)學媒介生物鑒定圖譜》進行形態(tài)學鑒定。

    1.2 主要試劑與儀器

    熒光RPA反應試劑盒(Twist AmpTMExo Kits)、基礎(chǔ)RPA反應試劑盒(Twist AmpTMBasic Kits)為TwistDx公司產(chǎn)品;PCR擴增試劑(TaqTMVersion 2.0 plus dye)、DNAMarker為TaKaRa公司產(chǎn)品;核酸提取試劑盒(血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒)為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。PCR儀為ABI 7500 Fast熒光PCR儀和ABI 2700 PCR儀。

    1.3 核酸提取

    白紋伊蚊、埃及伊蚊樣本各5只,刺擾伊蚊、背點伊蚊、三帶喙庫蚊、中華按蚊、常型曼蚊樣本各3只,單只蚊蟲樣本整只研磨提取核酸。使用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根)提取單蚊基因組DNA。

    1.4 引物和探針設(shè)計篩選

    參考文獻(耿藝介等,2008;師永霞等,2008;劉飛等,2015;尹小平等,2016)選擇白紋伊蚊和埃及伊蚊的第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS2序列為目的基因,在GenBank中查找相關(guān)序列,按Twistamp-assay-design技術(shù)要求應用Oligo7軟件設(shè)計引物和探針,通過Blast比對確定其特異性,然后用基礎(chǔ)RPA對引物進行初篩,確定使用表1中所列的引物和探針進行后續(xù)實驗。引物和探針均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

    表1 本實驗所用候選引物和探針

    將基礎(chǔ)RPA擴增產(chǎn)物送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序,測序結(jié)果登錄NCBI進行Blast比對分析。同時,依據(jù)參考文獻(Folmeretal.,1994;廉國勝等,2015)以相同樣本的DNA為模板進行COI序列擴增,然后進行測序、Blast比對分析,比較兩種方法的結(jié)果,以驗證RPA鑒定結(jié)果的準確性。

    1.5 反應體系和條件

    熒光RPA反應體系(50 μL):Primer Free Rehydration buffer 29.5 μL,無核酸酶水 11.2 μL,正向引物(10 μmol/L)2.1 μL,反向引物(10 μmol/L)2.1 μL,探針(10 μmol/L)0.6 μL,模板2 μL,將上述溶液加至熒光RPA凍干酶粉反應管中,再加入280 mmol/L MgOAc 2.5 μL。混合均勻后,分裝20 μL至0.1 mL PCR反應管中,立即置于熒光PCR中開始反應。反應條件為39℃,30 s(收集熒光),40個循環(huán)(反應時間共20 min)。

    基礎(chǔ)RPA反應體系(50 μL):Primer Free Rehydration buffer 29.5 μL,無核酸酶水 11.2 μL,正向引物(10 μmol/L)2.4 μL,反向引物(μmol/L)2.4 μL,模板2 μL,將上述溶液加至基礎(chǔ)RPA凍干酶粉反應管中,再加入280 mmol/L MgOAc 2.5 μL,混勻后立即放入39℃恒溫金屬浴中開始反應,反應時間20 min。

    COI擴增反應體系:白紋伊蚊COI序列擴增所用引物參考廉國勝等(2015)文獻,埃及伊蚊COI序列擴增所用引物參考Folmer等(1994)文獻(表1)。PCR反應體系25 μL,包括2×Master Mix 12.5 μL,無核酸酶水 9 μL,上下游引物各0.5 μL,模板2.5 μL。

    1.6 特異性試驗

    采用篩選的引物和探針,分別以白紋伊蚊、埃及伊蚊、刺擾伊蚊、背點伊蚊、三帶喙庫蚊、中華按蚊、常型曼蚊DNA為模板,用RPA Exo試劑盒進行熒光RPA檢測,驗證其特異性。

    1.7 靈敏度試驗

    測定DNA樣本濃度,經(jīng)過適當稀釋,稀釋至1、10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL,進行熒光RPA檢測,測試該方法的靈敏度。

    1.8 重復性試驗

    將上述稀釋的DNA樣本進行重復性實驗,每個濃度進行3次重復檢測,分析該方法的穩(wěn)定性。

    2 結(jié)果

    2.1 rDNA-ITS2序列基礎(chǔ)RPA擴增結(jié)果和COI序列擴增結(jié)果比較

    圖1 篩選引物基礎(chǔ)RPA擴增結(jié)果

    用大連國際旅行衛(wèi)生保健中心提供的白紋伊蚊和埃及伊蚊樣本提取DNA,以此為模板,以篩選出的引物進行基礎(chǔ)RPA擴增,同時進行COI序列擴增。白紋伊蚊用5個樣本進行了重復實驗,結(jié)果如圖1、2。篩選出的白紋伊蚊引物擴增目標片段大小為219 bp,篩選出的埃及伊蚊引物擴增目標片段大小為132 bp。從圖1看出,5個白紋伊蚊和埃及伊蚊均有目標大小條帶?;A(chǔ)RPA擴增產(chǎn)物經(jīng)測序,測序結(jié)果登錄NCBI進行Blast比對,白紋伊蚊擴增序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中白紋伊蚊rDNA-ITS2序列相似性均>98%,可判斷為白紋伊蚊;埃及伊蚊RPA擴增序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中埃及伊蚊rDNA-ITS2序列相似性均>98%(王剛,2011;Cywinskaetal., 2006),可判斷為埃及伊蚊。COI序列PCR擴增結(jié)果如圖2,5個白紋伊蚊和埃及伊蚊樣本均有目標條帶,PCR產(chǎn)物測序后登錄NCBI進行Blast比對,結(jié)果分別與白紋伊蚊COI序列相似性>99%、與埃及伊蚊COI序列相似性>99%,可判斷分別為白紋伊蚊和埃及伊蚊。RPA方法蚊種鑒定結(jié)果與COI序列分析結(jié)果一致。

    圖2 COI序列PCR結(jié)果

    2.2 特異性試驗結(jié)果

    伊蚊熒光RPA鑒定方法特異性實驗結(jié)果見圖3、4。白紋伊蚊熒光RPA特異性實驗結(jié)果如圖3所示,僅有白紋伊蚊樣本有擴增曲線,其他蚊種和空白對照均沒有擴增曲線,表明篩選出的白紋伊蚊引物和探針與埃及伊蚊、刺擾伊蚊、背點伊蚊、三帶喙庫蚊、中華按蚊、常型曼蚊DNA均無交叉反應。埃及伊蚊熒光RPA特異性實驗結(jié)果如圖4所示,僅有埃及伊蚊產(chǎn)生了擴增曲線,其他蚊種和空白對照均未產(chǎn)生擴增曲線,表明篩選出的埃及伊蚊引物和探針與白紋伊蚊、刺擾伊蚊、背點伊蚊、三帶喙庫蚊、中華按蚊、常型曼蚊DNA均無交叉反應。

    2.3 靈敏度實驗結(jié)果

    檢測樣本DNA的濃度,進行適當稀釋,稀釋至1、10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL,進行熒光RPA檢測,結(jié)果如圖5、6。白紋伊蚊和埃及伊蚊樣本濃度在10-3~1 ng/μL范圍內(nèi)均可產(chǎn)生擴增曲線,10-4ng/μL和空白對照均無擴增曲線。但當濃度稀釋至10-3ng/μL時雖有擴增曲線,但結(jié)果不穩(wěn)定(見2.4部分),因此,將0.01 ng/μL作為本方法的檢出限。

    圖3 白紋伊蚊熒光RPA特異性檢測

    圖4 埃及伊蚊RPA特異性實驗結(jié)果

    圖5 白紋伊蚊熒光RPA靈敏度實驗結(jié)果

    圖6 埃及伊蚊熒光RPA靈敏度試驗結(jié)果

    圖7 白紋伊蚊熒光RPA重復性實驗結(jié)果

    圖8 埃及伊蚊熒光RPA重復性實驗結(jié)果

    表2 重復性實驗結(jié)果

    2.4 重復性實驗結(jié)果

    選取上述稀釋濃度的DNA樣本,進行重復性實驗,每個濃度3個平行,結(jié)果如圖7、8和表2。濃度在10-2~1 ng/μL時,相同濃度的檢測結(jié)果一致,變異系數(shù)均小于5%。當稀釋至10-3ng/μL時,雖有擴增曲線,但熒光信號與空白接近,而且變異系數(shù)較大,尤其白紋伊蚊在10-3ng/μL時變異系數(shù)達到14.08%。實驗結(jié)果表明,當模板濃度在方法檢出限0.01 ng/μL以上時檢測結(jié)果穩(wěn)定,重復性良好。

    3 討論

    蚊蟲是重要的醫(yī)學昆蟲,對其進行分類鑒定研究對防控蚊媒傳染病具有重要的意義。長期以來,蚊種的分類鑒定以傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定為主,但對于形態(tài)相似的近緣種、形體不完整的樣本以及幼蟲,利用形態(tài)學很難進行準確的種類鑒定。分子生物學方法是從DNA水平進行蚊種鑒定,是解決上述問題的有效手段,現(xiàn)有的分子鑒別技術(shù)有DNA探針技術(shù)、PCR和測序技術(shù)、RAPD技術(shù)、RFLP技術(shù)等(孫立新等,2010;彭淑瓊等,2010),但由于上述技術(shù)中有些需要特定設(shè)備,有的操作繁雜,有的還需要進行生物信息學分析,因此在現(xiàn)場快速檢測中的應用受到一定限制。熒光RPA技術(shù)是一種新型的等溫快速檢測技術(shù),該方法可在恒溫條件下進行核酸擴增,操作簡單,無需熱循環(huán)過程,縮短了檢測時間,同時減少了能量和成本,特異性好,靈敏度高(杜亞楠等,2018),已在病毒檢測(馬磊等,2019;林彥星等,2019)、細菌檢測(李軻等,2019;劉婧文等,2020)、食品安全(林霖等,2018;謝實龍等,2019)等方面得到很好應用。

    內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)不參與核糖體形成,受到的選擇壓力小,進化速度快,適合于屬間、種間的系統(tǒng)發(fā)育和種群分化方面的研究,尤其是ITS2種內(nèi)相對保守,而種間存在一定的差異,可應用于近緣種的鑒定和種群間分化程度研究(江世宏等,2008)。師永霞等(2008)等利用rDNA-ITS2對致倦庫蚊、三帶喙庫蚊、白紋伊蚊、騷擾阿蚊和中華按蚊進行了分子鑒定,其結(jié)果與形態(tài)學鑒定一致,說明rDNA-ITS2的分子鑒定可成功應用于成蚊和幼蚊的亞科、屬和種的區(qū)分。郭秀霞(2020)等利用rDNA-ITS2對淡色庫蚊、三帶喙庫蚊、二帶喙庫蚊、白紋伊蚊、刺擾伊蚊、中華按蚊、騷擾阿蚊、常型曼蚊和黃色柯蚊成蚊進行了分子鑒定,分子鑒定結(jié)果與形態(tài)學鑒定吻合率100%,說明rDNA-ITS2基因可用于蚊蟲屬和種的鑒定。

    本研究對熒光RPA伊蚊鑒定方法進行了初探,初步建立白紋伊蚊和埃及伊蚊的熒光RPA鑒定方法,特異性良好,與伊蚊屬部分蚊種以及三帶喙庫蚊、中華按蚊、常型曼蚊DNA均無交叉反應。在39℃,20 min即可完成檢測。對目的DNA的檢測限為0.01 ng/μL,3個平行的變異系數(shù)值均<5%,顯示了良好的重復性。本研究還用相同的引物,采用基礎(chǔ)RPA方法進行了擴增、測序、BLAST比對分析,其鑒定結(jié)果顯示與COI序列分析鑒定結(jié)果一致,進一步驗證了建立的熒光RPA方法的準確性。而且,熒光RPA方法和基礎(chǔ)RPA的方法相比,省去了DNA純化和凝膠電泳的繁瑣步驟而更加簡便,可實時觀察檢測結(jié)果,為病媒生物鑒定提供了新的技術(shù)方法,非常適合于蚊蟲的現(xiàn)場快速檢測,對蚊媒病的防控具有重要意義。

    本研究僅以白紋伊蚊和埃及伊蚊為例進行了熒光RPA伊蚊鑒定方法的初探,其他伊蚊的熒光RPA鑒定方法的建立及優(yōu)化需要進行后續(xù)研究,并且在后續(xù)研究中會考慮以所鑒定蚊種的近緣種作為對照,進一步驗證方法的特異性。

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