基于網(wǎng)絡藥理學探討牛膝對骨關(guān)節(jié)炎的作用機制

董海鵬，孟凱

（1.山東中醫(yī)藥大學碩士研究生，山東 濟南；2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南）

0 引言

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）中醫(yī)屬于學“筋痹”“痹證”等范疇，是一種常見的慢性關(guān)節(jié)疾病[1]，膝關(guān)節(jié)最為常見[2]。原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病原因迄今尚未完全明確，一般認為是多種致病因素包括機械性和生物性因素的相互作用所致。其中年齡是主要高危因素，其他因素包括外傷、肥胖、遺傳、炎癥等。女性發(fā)病率較高，在絕經(jīng)后明顯增加，且與關(guān)節(jié)軟骨中發(fā)現(xiàn)雌激素受體有關(guān)。骨質(zhì)疏松因軟骨下骨小梁變薄變硬時，其承受壓力的能力下降，因此出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎的幾率較高。

中藥牛膝屬多年生草本，根入藥。性味：苦、甘、酸，平。歸肝、腎經(jīng)。具有逐瘀通經(jīng)，補肝腎，強筋骨，利尿通淋，引血下行的功效。《神農(nóng)本草經(jīng)》牛膝味苦、酸。主寒，濕痿痹，四肢拘攣，膝痛不可屈伸，逐血氣傷。臨床上常用牛膝配伍杜仲、桑寄生等治療骨關(guān)節(jié)炎，并有一定功效[3-5]。牛膝具有多成分、多靶點的調(diào)節(jié)的作用。

1 材料與方法

1.1 牛膝化學成分及作用基因靶點、骨關(guān)節(jié)炎基因靶點信息獲取

采用中藥系統(tǒng)藥理學技術(shù)平臺（TCMSP）檢索牛膝的化學成分及靶點。根據(jù)口服生物利用度（OB）＞30% 和類藥性（DL）＞0.18，篩選牛膝中的活性成分及其相關(guān)作用基因靶點。通過Genecard、OMIN 數(shù)據(jù)庫，輸入關(guān)鍵詞“osteoarthritis”獲取與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點。

1.2 網(wǎng)絡的構(gòu)建

利用R 語言繪制將牛膝活性成分相關(guān)的靶點和疾病靶點進行匹配，獲得牛膝活性成的潛對骨關(guān)節(jié)炎有作用的靶點，即兩者共同基因即為牛膝-骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵靶點。采用Cytoscape 軟件（Version3.7.1）構(gòu)建“疾病-藥物-活性成分-基因靶點”關(guān)系網(wǎng)絡圖。網(wǎng)絡圖中藍色節(jié)點代表疾病與藥物活性成分的關(guān)鍵基因靶點，網(wǎng)絡圖中草綠色節(jié)點是藥物活性成分，通過構(gòu)建這一網(wǎng)絡圖探析牛膝對骨關(guān)節(jié)炎的作用機制。

1.3 關(guān)鍵靶點蛋白相關(guān)作用網(wǎng)絡的構(gòu)建

利用STRING 數(shù)據(jù)庫平臺預測的蛋白相互作用關(guān)系。將牛膝-骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵基因靶點導入String 數(shù)據(jù)庫，研究物種為選擇為人類（Homo sapiens），獲得蛋白互作關(guān)系，并將結(jié)果以TSV 格式導出。

1.4 關(guān)鍵基因靶點本體（gene ontology,GO）

富集分析和基因相互作用（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路，分析利用Bioconductor 平臺和R 語言對獲得的基因進行GO 富集分析和KEGG 通路分析。首先在R 中進行安裝包的安裝，安裝包包括"colorspace"、"stringi"、"DOSE"、"clusterProfiler"、"pathview"導出GO 富集分析表格，并繪制dotplot 點圖。KEGG 通路富集分析的安裝語言同上，可導出KEGG 富集分析表格，KEGG 通路圖，并繪制dotplot 點圖。

2 結(jié)果

2.1 牛膝活性成分的通過

TCMSP 平臺數(shù)據(jù)庫檢索，且OB＞30% 和DL＞0.18，篩選得到牛膝潛在活性成分，見表1。

表1 牛膝中潛在活性成分

2.2 牛膝活性成分對骨關(guān)節(jié)炎的潛在作用靶點預測

通過TCMSP 平臺數(shù)據(jù)庫檢索，篩選活性成分對應的潛在作用靶點，去除無效和重復靶點后，得到牛膝潛在活性成分的作用靶點100 個。利用Genecard 數(shù)據(jù)庫、OMIM 數(shù)據(jù)庫平臺，檢索“osteoarthritis”，共得到骨關(guān)節(jié)炎疾病的潛在作用靶點2397 個。利用R 語言獲得共同基因靶點為63 個（表2）。

2.3 疾病-藥物-活性成分-基因靶點網(wǎng)絡構(gòu)建與分析

牛膝與骨關(guān)節(jié)炎作用靶點相關(guān)的藥物的潛在活性成分有16個，為poriferasta-7，22E-dien-3beta-ol、28-norolean-17-en-3-ol、berberine、coptisine、wogonin、delta 7-stigmastenol、baicalein、epiberberine、beta-sitosterol、Inophyllum E、kaempferol、Spinasterol、Stigmasterol、palmatine、beta-daucosterol_qt、quercetin。活性成分、基因靶點導入 Cytoscape 軟件進行網(wǎng)絡構(gòu)建及可視化（圖1）。結(jié)果表明， quercetin、kaempferol、wogonin 等連接度較高，以上成分是牛膝治療骨關(guān)節(jié)炎的重要成分。

2.4 基因靶點蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析

將牛膝- 骨關(guān)節(jié)炎的63 個潛在的關(guān)鍵基因靶點導入String數(shù)據(jù)庫平臺，選擇物種為人類，獲取蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系并繪制蛋白關(guān)系網(wǎng)絡（圖2）。排除2 個游離的無相互作用蛋白，該網(wǎng)絡圖共包括63 個節(jié)點，578 個邊。其中綜合數(shù)值最高，評分＞0.99 的相互作用蛋白為IKBKB、CASP8、RELA、CASP9、CYP1A1、IKBKB、IGF2、VEGFA、BCL2、BIRC5、CASP3、CASP8、CAV1、VEGFA、CAV1，這些蛋白之間的相互作用在網(wǎng)絡中具有重要地位，這些基因靶點在牛膝對骨關(guān)節(jié)炎治療中具有重要意義。

2.5 基因靶點生物功能及通路分析

GO 富集分析結(jié)果顯示，牛膝的63 個潛在關(guān)鍵基因靶點的GO富集排名靠前的生物學功能主要為DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性，RNA 聚合酶II 特異性（15 個靶點PGR、ESR1、AR、RELA、TP63、FOS、HIF1A、FOSL1、NR1I3、ELK1、MYC、NFE2L2、PARP1、RUNX2、IRF1），RNA 聚合酶II 近端啟動子序列特異性DNA 結(jié)合（14 個靶點PGR、ESR1、AR、PPARG、RELA、HIF1A、FOSL1、AHR、ESR2、ELK1、MYC、HSF1、RUNX2、IRF1），近端啟動子序列特異性DNA 結(jié)合（14 個靶點PGR、ESR1、AR、PPARG、RELA、HIF1A、FOSL1、AHR、ESR2、ELK1、MYC、HSF1、RUNX2、IRF1），蛋白質(zhì)異二聚活性（13 個靶點PPARG、RELA、BCL2、MCL1、VEGFA、FOS、HIF1A、AHR、IKBKB、EGFR、ERBB2、CAV1、HSF1），核受體活性（7 個靶點PGR、ESR1、AR、PPARG、AHR、ESR2、NR1I3）轉(zhuǎn)錄因子活性（7 個靶點PGR、ESR1、AR、PPARG、AHR、ESR2、NR1I3）RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（7 個靶點ESR1、AR、GSK3B、FOS、AHR、ELK1、NFE2L2）等（圖3），表明牛膝就可以通過參與調(diào)控多種生物學過程而發(fā)揮抗骨關(guān)節(jié)炎作用。

KEGG 通路富集分析顯示，牛膝的關(guān)鍵基因靶點主要富集的通路為卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染，人巨細胞病毒感染，乙型肝炎，細胞凋亡，流體剪切應力與動脈粥樣硬化，糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路，麻疹，前列腺癌，TNF 信號通路等。牛膝的活性成分分布于多個通路，可通過各通路協(xié)調(diào)發(fā)揮抗骨關(guān)節(jié)炎作用（圖4）。

3 討論

牛膝是臨床治療骨關(guān)節(jié)炎的常用中藥，其提取物具有保護軟骨細胞作用[6,7]。牛膝總皂苷能有效抑制OA 滑膜炎癥，改善關(guān)節(jié)粘連度，降低滑膜組織β-catenin 蛋白表達以及減少關(guān)節(jié)液TNF-1，IL-1β，MMP-3 因子含量[8]。牛膝總皂苷含藥關(guān)節(jié)液能有效提高細胞活力、促進軟骨細胞增殖、提高Ⅱ型膠原蛋白表達，且降低軟骨細胞早期、晚期凋亡率[9]。牛膝醇提物能有效刺激軟骨細胞增殖，修復軟骨損傷，降低軟骨[10]。本研究旨在對牛膝治療骨關(guān)節(jié)炎的分子機制作初步探討，為臨床治療提供依據(jù)。研究表明牛膝與骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)成分16 個，共同作用靶點63 個，主要通過調(diào)控PGR、PPARG、PTGS1、AR、BCL2、CASP3、ESR1 等靶基因，通過卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染，人巨細胞病毒感染，乙型肝炎，細胞凋亡，流體剪切應力與動脈粥樣硬化，糖尿病并發(fā)癥中的AGERAGE 信號通路，麻疹，前列腺癌，TNF 信號通路等調(diào)節(jié)。研究表明，其中活性成分黃連素（coptisine）對骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解因子MMP-13 及ADAMTS-5 的表達有抑制作用，對骨關(guān)節(jié)炎軟骨結(jié)構(gòu)具有一定的改善作用[11]。槲皮素（quercetin）能夠顯著促進IL-1β 體外誘導兔軟骨細胞的增殖[12]，可顯著降低MMP-13/TIMP-1 的比例，促進抑制軟骨細胞外基質(zhì)的降解[13]，促進對關(guān)節(jié)軟骨的保護。綜上所述，本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法，對牛膝藥治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機制進行初步探討，結(jié)果表明了牛膝的主要潛在活性成分及作用靶基因與骨關(guān)節(jié)炎作用通路的關(guān)系，為進一步深入探討其作用機制提供了新思路。

表2 骨關(guān)節(jié)炎-牛膝基因靶點

圖1 疾病-藥物-活性成分-基因靶點網(wǎng)絡圖

圖2 牛膝治療骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡

圖3 牛膝活性成分治療骨關(guān)節(jié)炎基因靶點的GO 生物學過程富集分析

圖4 牛膝活性成分治療骨關(guān)節(jié)炎基因靶點的KEGG 代謝通路富集分析