長鏈非編碼RNA與卵泡發(fā)育相關(guān)性的研究進(jìn)展

陳亞楠，李瑞梅，陳曉麗，李澤武，代會(huì)穎，韓瀟，顧玉婷，楊愛軍*

(1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)寧 272067；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，濟(jì)寧 272029)

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs，LncRNAs)是一類長度大于200個(gè)核苷酸且無編碼蛋白質(zhì)功能的RNA。近年來，越來越多的研究表明，LncRNAs幾乎在基因表達(dá)的每一個(gè)階段都發(fā)揮了廣泛的調(diào)節(jié)作用，這些調(diào)節(jié)作用包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)分化等[1]。目前許多證據(jù)顯示了LncRNAs在人類各種疾病中的重要性，并指出它們的失調(diào)和突變是一些疾病的基礎(chǔ)[2]。LncRNAs不僅在感染、腫瘤和細(xì)胞凋亡等生物過程中起調(diào)控作用[3-6]，而且具有作為治療靶點(diǎn)和診斷標(biāo)記物的潛力[7-8]，且其在卵泡成熟、胚胎發(fā)育等生殖過程中的作用也在不斷地被發(fā)現(xiàn)[9-11]。目前，已確定了大量與生殖相關(guān)的LncRNAs。Karlic等[12]使用二代測(cè)序和從頭轉(zhuǎn)錄組裝技術(shù)定義了由卵母細(xì)胞向胚胎轉(zhuǎn)變過程(OET)中表達(dá)的1 600個(gè)LncRNAs的核心群體，解釋了OET中已分化的配子轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄苈蚜亚蚣澳阁w-受精卵RNA交換過程中涉及到的LncRNAs重塑。而卵泡發(fā)育過程本質(zhì)上就是卵母細(xì)胞和周圍的顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞相互之間的調(diào)控，LncRNAs可能參與其中。本文就LncRNAs對(duì)卵泡發(fā)育過程中不同階段的影響進(jìn)行了總結(jié)，為進(jìn)一步研究LncRNAs在輔助生殖技術(shù)中的機(jī)制和作用提供理論基礎(chǔ)。

一、LncRNAs影響生殖干細(xì)胞的增殖和發(fā)育

Li等[13]通過高通量測(cè)序研究了雄性和雌性小鼠生殖干細(xì)胞中mRNAs、LncRNAs和CircRNAs的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了18 573個(gè)新的LncRNAs和18 822個(gè)新的CircRNAs，并通過實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)一步證實(shí)了這些新的LncRNAs和CircRNAs的存在，并且有8 115個(gè)mRNAs、3 996個(gè)LncRNAs和921個(gè)CircRNAs存在性別差異性表達(dá)，此研究還發(fā)現(xiàn)LncRNA Gm11851、LncRNA Gm12840、LncRNA 4930405O2 2Rik和LncRNA Atp10d等在小鼠生殖干細(xì)胞中存在性別差異，這表明LncRNAs可能參與生殖干細(xì)胞的調(diào)控及發(fā)育過程。

哺乳動(dòng)物基因組轉(zhuǎn)錄的LncRNA生長停滯特異性轉(zhuǎn)錄本5(Gas5)在多種發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)LncRNA Gas5在新生小鼠卵巢中高表達(dá)，并且定位于雌性生殖系干細(xì)胞(FGSCs)和卵母細(xì)胞，可促進(jìn)FGSCs增殖、延長FGSCs在體外存活的時(shí)間、抑制體外培養(yǎng)中FGSCs的凋亡。所以我們可以認(rèn)為LncRNA Gas5可能參與調(diào)控FGSCs生長及其向卵母細(xì)胞發(fā)育的過程。

Penkala等[15]從X染色體中鑒定出一個(gè)新的LncRNA，命名為LncRHOXF1，是一種長約1kb的剪接多聚腺苷酸，存在于體外分化的人滋養(yǎng)外胚祖細(xì)胞的胞核和胞漿中，在人類囊胚的滋養(yǎng)外胚層和原始內(nèi)胚層細(xì)胞中大量表達(dá)，在缺乏LncRHOXF1 的人類胚胎干細(xì)胞中進(jìn)行的功能獲得性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LncRHOXF1抑制了胚胎干細(xì)胞增殖，而有利于其細(xì)胞的分化。

二、LncRNAs調(diào)節(jié)卵丘擴(kuò)張和發(fā)育

卵丘細(xì)胞(CCs)在位置上比壁層顆粒細(xì)胞更靠近卵母細(xì)胞，對(duì)卵母細(xì)胞的成熟有極其重要的作用，主要體現(xiàn)在CCs參與了阻滯卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程的恢復(fù)、支持卵母細(xì)胞質(zhì)的成熟等過程[16]。并且有研究發(fā)現(xiàn)，CCs對(duì)卵母細(xì)胞和卵泡發(fā)育的同步性是至關(guān)重要的[17]。

Bouckenheimer等[11]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)人卵母細(xì)胞周圍的CCs可為卵母細(xì)胞運(yùn)輸大量的營養(yǎng)物質(zhì)，包括 mRNA和LncRNAs，說明LncRNAs 可以通過CCs影響卵母細(xì)胞的成熟。后來Yerushalmi等[18]從體外成熟(IVM)患者的生發(fā)泡期卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)中獲得致密型的CCs，從試管受精(IVF)/卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)患者的中期(MII)COCs中獲得擴(kuò)張型的CCs，通過使用RNA測(cè)序技術(shù)獲得樣本的整體轉(zhuǎn)錄組圖譜，從致密型和擴(kuò)張型CCs中發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)基因多達(dá)1 746個(gè)，且大多與細(xì)胞增殖、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)和相互作用、細(xì)胞外基質(zhì)和類固醇合成有關(guān)。差異表達(dá)的基因中包含89個(gè)LncRNAs，其中12個(gè)LncRNAs編碼在已知的參與顆粒細(xì)胞生長發(fā)育進(jìn)程的基因的內(nèi)含子中，這表明LncRNAs可能參與卵丘擴(kuò)張和卵母細(xì)胞成熟的調(diào)節(jié)。

Xu等[19]比較了3對(duì)可形成高質(zhì)量胚胎的成熟卵母細(xì)胞的CCs(H-CCs)和可導(dǎo)致低質(zhì)量胚胎的成熟卵母細(xì)胞的CCs(P-CCs)中LncRNA的表達(dá)譜，共有20 563個(gè)LncRNAs在人CCs中表達(dá)，與H-CCs比較，P-CCs中有124個(gè)LncRNAs持續(xù)上調(diào)，509個(gè)LncRNAs持續(xù)下調(diào)(折疊變化≥2.0，P<0.05)，LncRNAs在P-CCs和H-CCs中的表達(dá)存在差異，提示LncRNAs可能通過調(diào)節(jié)卵丘細(xì)胞來參與卵母細(xì)胞的發(fā)育過程。

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡婦女無排卵性不孕的最常見原因之一，Huang等[20]首次用基因芯片技術(shù)確定了PCOS患者CCs的全基因組LncRNAs。研究者使用微陣列描述了10名志愿者(5名PCOS患者和5名正常女性)的CCs中的LncRNAs圖譜，觀察到623個(gè)LncRNAs和260個(gè)mRNAs表達(dá)顯著上調(diào)或下調(diào)(≥2倍變化)，選取其中5個(gè)差異表達(dá)的LncRNAs(XLOC_011402、ENST00000432431、ENST00000433673、ENST00000450294和ENST00000454271)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致。進(jìn)一步的分析結(jié)果表明2號(hào)染色體轉(zhuǎn)錄了大量的差異表達(dá)的LncRNAs，有作為增強(qiáng)子來調(diào)節(jié)其鄰近蛋白編碼基因的可能性。這些結(jié)果表明，與正常婦女相比，PCOS患者CCs中的LncRNAs表達(dá)異常，這些差異可以用來區(qū)分PCOS患者和正常婦女的CCs。提示LncRNAs會(huì)影響卵母細(xì)胞的發(fā)育。

三、LncRNA參與顆粒細(xì)胞增殖、分化與凋亡

卵巢中的顆粒細(xì)胞(GC)的重要性不言而喻，從原始卵泡生長啟動(dòng)到增殖、分化，再到閉鎖/排卵，直至最終黃體形成整個(gè)過程中，既有卵母細(xì)胞對(duì)GC增殖與分化的調(diào)控，也有GC對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響。

抗苗勒管激素(AMH)對(duì)以下細(xì)胞有作用：成年動(dòng)物的卵巢顆粒細(xì)胞、睪丸間質(zhì)細(xì)胞及睪丸支持細(xì)胞。AMH通過其AMH Ⅱ型受體(Amhr2)實(shí)現(xiàn)其特異性的作用，但目前研究尚未明晰Amhr2基因被特異性激活機(jī)制。Kimura等[21]在睪丸支持細(xì)胞與卵巢顆粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)從Amhr2基因上游轉(zhuǎn)錄而來的LncRNA，LncRNA-Amhr2，分析得出LncRNA-Amhr2激活可提高Amhr2啟動(dòng)子活性。在小鼠顆粒細(xì)胞OV3121細(xì)胞中，Tet-on系統(tǒng)誘導(dǎo)的 LncRNA-Amhr2轉(zhuǎn)錄可顯著提高Amhr2啟動(dòng)子的活性。以上研究可知，通過增強(qiáng)啟動(dòng)子活性，LncRNA-Amhr2在卵巢顆粒細(xì)胞Amhr2基因的激活中發(fā)揮作用。

脯氨酰寡肽酶(POP)是一種多功能蛋白酶，參與多種生理活動(dòng)，為了鑒定POP基因新的調(diào)控元件，Matsubara等[22]比較了人類和小鼠POP基因的序列，在基因間隔區(qū)相鄰處找到了6個(gè)保守非編碼序列(CNS)，有4個(gè)LncRNAs是從位于小鼠POP基因的CNS轉(zhuǎn)錄的，其中一個(gè)LncRNA(LncPrep+96kb)的表達(dá)模式與POP基因的表達(dá)模式相關(guān)。研究者在原代卵巢GC和肝細(xì)胞系中將LncPrep+96kb敲除，這兩種細(xì)胞中POP的mRNA表達(dá)水平都降低了，但過表達(dá)LncPrep+96kb，只增加GC中POPmRNA的表達(dá)。由于LncPrep+96kb在激素處理的卵巢中上調(diào)的時(shí)間與POP的時(shí)間相同，說明LncPrep+96kb可能在GC的POP基因激活中發(fā)揮作用。

Liu等[23]研究了LncRNAs在PCOS發(fā)病機(jī)制中的潛在作用。通過微陣列比較了7名PCOS患者和7名正常女性GC中的LncRNAs表達(dá)譜，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了53例PCOS患者和50例對(duì)照組GC中LncRNA HCG26的表達(dá)水平，并敲除了KGN細(xì)胞中的HCG26基因，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、芳香化酶和卵泡刺激素受體基因表達(dá)以及雌二醇產(chǎn)生的影響。與對(duì)照組相比，PCOS患者 GC中共有862個(gè)LncRNAs轉(zhuǎn)錄本和998個(gè)信使RNA轉(zhuǎn)錄本差異表達(dá)(P<0.05)。PCOS患者HCG26水平升高，并與竇卵泡計(jì)數(shù)相關(guān)。KGN細(xì)胞敲除了HCG26基因后，細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程受到抑制，芳香化酶基因的表達(dá)和雌二醇的產(chǎn)生增加，提示失調(diào)的LncRNAs可能在GC增殖和類固醇生成中起重要作用。

卵巢早衰(POF)是一種典型的老年女性生殖系統(tǒng)病理性疾病。感染、炎癥、免疫異常、基因突變、放療和化療均可引起POF。卵巢顆粒細(xì)胞(OGC)功能障礙直接影響卵巢早衰的發(fā)生。Liu等[24]發(fā)現(xiàn)雷公藤多甙可通過促進(jìn)p53磷酸化和激活絲氨酸/蘇氨酸激酶11-p53-p21信號(hào)通路誘導(dǎo)大鼠卵巢早衰。Xiong等[25]進(jìn)行的一項(xiàng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺可導(dǎo)致小鼠卵巢萎縮、抑制OGC增殖。環(huán)磷酰胺處理組的p53、p66Shc和p16的蛋白表達(dá)水平顯著增高。Northern blot雜交結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺處理組的LncRNA-Meg3雜交信號(hào)強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組。芯片結(jié)果證實(shí)，經(jīng)環(huán)磷酰胺處理的OGC的 p66Shc啟動(dòng)子DNA片段顯著增加，且富含p53蛋白。這個(gè)實(shí)驗(yàn)說明，環(huán)磷酰胺可以通過激活LncRNA-Meg3-p53-p66Shc通路促進(jìn)卵巢早衰、抑制OGCs增殖，也說明可能存在LncRNAs對(duì)GC內(nèi)部調(diào)控的機(jī)制。

四、LncRNAs調(diào)控卵母細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的成熟

卵母細(xì)胞成熟過程包括細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的成熟。細(xì)胞核成熟包括染色體復(fù)制過程、生發(fā)泡破裂過程、同源染色體分離過程等。而細(xì)胞質(zhì)的成熟又分為細(xì)胞器的形態(tài)成熟過程、卵母細(xì)胞骨架成熟過程以及成熟過程中需要的RNA轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)合成等。付蕾等[26]的研究表明卵母細(xì)胞成熟率低可能影響受精及胚胎發(fā)育，導(dǎo)致可供移植的胚胎數(shù)減少，妊娠率下降。

Huang等[27]通過實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)卵丘細(xì)胞中PWRN2的表達(dá)水平，以確定其在PCOS患者的卵母細(xì)胞核成熟過程中的潛在作用。發(fā)現(xiàn)在PCOS患者的卵母細(xì)胞成熟過程中，LncRNA PWNR2通過減少miR-92b-3p與TMEM120B靶結(jié)合的可能性，進(jìn)而在PCOS患者的卵母細(xì)胞核成熟過程中發(fā)揮重要作用。

Karlic等[12]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNAs對(duì)卵母細(xì)胞的成熟過程產(chǎn)生了非常大的影響，當(dāng)mRNA在卵母細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能、調(diào)控細(xì)胞質(zhì)聚腺苷酸化時(shí)，卵母細(xì)胞內(nèi)處于休眠狀態(tài)的LncRNAs會(huì)被激活，在促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)聚腺苷酸化的過程中與mRNA起到協(xié)同作用，所以LncRNAs在調(diào)控卵母細(xì)胞成熟特別是胞質(zhì)成熟過程中可能會(huì)發(fā)揮重要的作用。Bouckenheimer等[11]對(duì)公開的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在中期(MII)卵母細(xì)胞和CCs中有豐富的LncRNAs，例如：C3orf56、BCAR4、Tunar、OOEP-AS1、CASC18和LINC01118存在于MII卵母細(xì)胞，MALAT1、NEAT1、ANXA2P2、MEG3、IL6STP1和VIM-AS1存在于CCs。該研究還發(fā)現(xiàn)MII卵母細(xì)胞中的LncRNAs可能參與了染色質(zhì)重塑和胞質(zhì)成熟。

五、LncRNAs參與排卵和黃體形成

Neat1是一種長鏈非編碼RNA，它是paraspeckles核體的架構(gòu)組件之一。研究發(fā)現(xiàn)，排卵正常的小鼠在Neat1基因敲除后不能懷孕，而且Neat1在黃體中高表達(dá)，近一半的Neat1基因敲除小鼠黃體組織的形成嚴(yán)重受損，說明Neat1對(duì)于黃體的形成至關(guān)重要[28]。

李加宇等[29]研究找到了3個(gè)在小鼠卵巢中具有相對(duì)特異性高表達(dá)的LncRNAs(LncRNA147、LncRNA274和LncRNA647)，而且LncRNA647、LncRNA147和LncRNA274在不同卵巢狀態(tài)下的表達(dá)豐度存在差異。分別檢測(cè)了這3個(gè)LncRNAs在小鼠不同發(fā)育時(shí)期和不同發(fā)情時(shí)期卵巢中的表達(dá)水平，不同發(fā)育期分別是5日齡、3周齡、5周齡、8周齡，不同的發(fā)情時(shí)期包括發(fā)情間期、發(fā)情前期、發(fā)情期和發(fā)情后期。結(jié)果顯示LncRNA147和LncRNA 274在8周齡小鼠卵巢中的表達(dá)水平達(dá)到最高，在其它3個(gè)發(fā)育階段卵巢中的表達(dá)水平由5日齡、5周齡和3周齡依次遞減；LncRNA647較高表達(dá)水平出現(xiàn)在5周齡和8周齡卵巢中，5日齡和3周齡卵巢中的表達(dá)水平依次降低；在不同發(fā)情時(shí)期的卵巢中，3個(gè)LncRNAs的表達(dá)水平均按發(fā)情間期、發(fā)情前期、發(fā)情期和發(fā)情后期的順序逐漸升高，而發(fā)情后期的表達(dá)水平顯著高于其它3個(gè)發(fā)情時(shí)期。體內(nèi)轉(zhuǎn)染LncRNA274基因后，與對(duì)照組相比較，卵泡發(fā)育相關(guān)基因LHR升高了約18倍，F(xiàn)SHR的表達(dá)水平升高了約7倍，BMP-15升高了約7.5倍，EGFR升高了約7.5倍，GDF-9升高了約11倍；黃體的數(shù)量(13.3±4.9)顯著增加(P<0.05)，而腔前卵泡、有腔卵泡數(shù)量沒有顯著變化。構(gòu)建LncRNA274轉(zhuǎn)基因小鼠并進(jìn)行表型分析，發(fā)現(xiàn)小鼠產(chǎn)仔數(shù)顯著增加，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果表明LncRNAs可促進(jìn)黃體形成和排卵。

六、LncRNA與卵巢發(fā)育

β晶體蛋白B2(CRYBB2)基因敲除小鼠的卵巢出現(xiàn)形態(tài)和功能異常。Gao等[30]對(duì)野生型和CRYBB2基因敲除小鼠的卵巢組織進(jìn)行了LncRNA和mRNA微陣列分析。野生型和CRYBB2基因敲除小鼠卵巢組織間有157個(gè)差異表達(dá)的LncRNAs和1 085個(gè)差異表達(dá)的mRNAs。實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)，在CRYBB2基因敲除小鼠的卵巢組織中，LncRNA A-30-P010 19163的表達(dá)下調(diào)，配體門控離子通道7(P2rx7)的表達(dá)相應(yīng)下調(diào)。綜上所述，CRYBB2調(diào)控不同的LncRNAs的表達(dá)，從而影響卵巢的發(fā)育，LncRNA A-30-P01019163可能通過調(diào)節(jié)卵巢P2rx7的表達(dá)而影響卵巢發(fā)育。

研究卵母細(xì)胞質(zhì)量的重要意義之一是提高卵母細(xì)胞體外成熟的臨床效果，所有提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的方法都能用于提高臨床體外成熟卵母細(xì)胞的妊娠率，進(jìn)而為不孕癥的治療帶來新的可能性?，F(xiàn)在科學(xué)研究在不斷探索和發(fā)現(xiàn)LncRNAs的作用及機(jī)制，在卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟以及早期胚胎發(fā)育過程之中，已經(jīng)有研究成果逐步證實(shí)了LncRNAs的調(diào)控功能。希望在不遠(yuǎn)的將來，可以通過檢測(cè)LncRNAs直接預(yù)測(cè)卵母細(xì)胞的成熟狀態(tài)，從而為卵子受精和胚胎發(fā)育提供更有力的技術(shù)支持，推進(jìn)生殖技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。