神經(jīng)性疼痛的治療新方向：光遺傳學(xué)

王倩文綜述 王龍，王晞審校

大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，具有神經(jīng)病理特征的慢性疼痛患病率估計為7 %～10%[1]。由于全球人口老齡化、糖尿病發(fā)病率增加和癌癥化療后存活率提高，神經(jīng)性疼痛的發(fā)病率可能會進一步增加。此外，神經(jīng)性疼痛患者常伴有嚴(yán)重的睡眠障礙、焦慮和抑郁，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[2]。神經(jīng)性疼痛的發(fā)生與多基因起源、多細胞和分子靶點有關(guān)，難以診斷引起持續(xù)疼痛癥狀的確切原因，且尚無適宜的治療方案。值得注意的是，神經(jīng)性疼痛主要歸因于神經(jīng)元或免疫細胞的異?；顒?，高度選擇性的光遺傳技術(shù)有望抑制異常疼痛信號的傳遞，達到治療目的。文章介紹了光遺傳學(xué)、神經(jīng)性疼痛的發(fā)病機制，并闡述了光遺傳學(xué)在治療神經(jīng)性疼痛中的應(yīng)用，討論了其優(yōu)勢和可能性，旨在為以后的研究提供理論依據(jù)和治療方向。

1 光遺傳學(xué)概述

光遺傳學(xué)是一種利用光控制或監(jiān)測神經(jīng)活動的技術(shù)，通過光敏離子通道(視蛋白)調(diào)節(jié)特定神經(jīng)元亞群的活動。如利用通道視紫紅質(zhì)(ChR)、鹽視紫紅質(zhì)(NpHR)等光發(fā)生激活劑來控制神經(jīng)元。嵌合離子通道在特定的細胞類型中表達，通過轉(zhuǎn)基因方法選擇性地刺激特定神經(jīng)元群，將光纖插入到所需的位置從而將光傳遞給神經(jīng)元。由于神經(jīng)性疼痛是由復(fù)雜的、整合的神經(jīng)元通路及電路介導(dǎo)調(diào)節(jié)，因此光遺傳學(xué)有望成為研究神經(jīng)元機制和神經(jīng)基質(zhì)的一個有價值的工具。

1.1 光遺傳激活 光遺傳學(xué)的激活是指視蛋白捕獲光并以此主動泵送離子穿過細胞膜或打開通道，使得離子被動地穿過細胞膜從而調(diào)節(jié)特定神經(jīng)元活動。工程化地將視蛋白表達到非光敏細胞中能夠快速實現(xiàn)光學(xué)控制特定的細胞過程。因此光遺傳學(xué)可提供高速激活和沉默。

微生物視蛋白是主要類別的光敏蛋白，根據(jù)膜電位進行分類。來自萊茵衣藻的ChR被設(shè)計成對陽離子進入具有選擇性，而NpHR對陰離子通量具有選擇性，引起超極化。質(zhì)子泵如細菌視紫紅質(zhì)、蛋白質(zhì)視紫紅質(zhì)和古視紫紅質(zhì)也通過從細胞質(zhì)中釋放出質(zhì)子而影響超極化。它們照射模式的差異允許去極化和超極化的視蛋白在細胞系統(tǒng)中共表達并使系統(tǒng)雙向化[3]。另一類光激活視蛋白是嵌合受體，其模擬各種信號傳導(dǎo)級聯(lián)。例如光活化膜整合的G蛋白偶聯(lián)受體，與視紫紅質(zhì)的細胞外結(jié)構(gòu)域和特定腎上腺素能受體的細胞內(nèi)區(qū)域的雜合受體，如Gq偶聯(lián)的人α1a-腎上腺素能受體和Gs偶聯(lián)的倉鼠b2-腎上腺素能受體，分別制造optoa1AR和optob2AR[4]。簡單的結(jié)構(gòu)、快速的動力學(xué)和單個細胞內(nèi)雙向控制的可能性使這些蛋白質(zhì)成為光遺傳學(xué)中新穎和經(jīng)典的工具。簡而言之，視蛋白具有獨特的性質(zhì)，如特定離子的選擇性、吸收光譜、亞細胞定位和對光的敏感性。

1.2 光遺傳特異性調(diào)節(jié) 光遺傳學(xué)技術(shù)最有利的方面之一是高度的細胞特異性。這是通過戰(zhàn)略性地使用細胞特異性啟動子來調(diào)節(jié)視蛋白基因在轉(zhuǎn)基因動物中的轉(zhuǎn)錄，或使用病毒載體和位點特異性顯微注射來實現(xiàn)的。常見的啟動子包括人類突觸素1或細胞表面抗原Thy1的啟動子等。對于抑制性神經(jīng)元的特異性表達，可以使用在所有GABA能神經(jīng)元中表達的谷氨酸脫羧酶啟動子或使用生長抑素和parvalbumin啟動子靶向抑制性神經(jīng)元亞型。而鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱα啟動子可以用來限制視蛋白表達神經(jīng)元興奮性,特別是大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)。目前開發(fā)的一種新系統(tǒng)允許Fos陽性神經(jīng)元中視蛋白的表達，稱為活性人群中的靶向重組[5]。該系統(tǒng)可只對在特定事件中活躍的神經(jīng)元進行操作，進一步提高了光遺傳學(xué)的特異性。此外非神經(jīng)元細胞類型也可通過光遺傳學(xué)進行靶向，包括當(dāng)啟動子受到膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子調(diào)控時的星形膠質(zhì)細胞。這種對特定細胞進行特異性操作的能力，能夠更好地理解神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞在神經(jīng)性疼痛中的作用。

2 神經(jīng)性疼痛發(fā)病機制

神經(jīng)性疼痛是指由軀體感覺系統(tǒng)的損傷或疾病引起的疼痛。病因多種多樣，包括創(chuàng)傷、炎性反應(yīng)、代謝性疾病，如糖尿病、毒素、病毒感染或惡性腫瘤等。在神經(jīng)損傷形成后，痛覺神經(jīng)纖維在多個水平發(fā)生劇烈變化，如細胞膜上新的受體和離子通道的基因輪廓改變，外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)傷害性信號處理的改變等，使感覺信號進入脊髓和大腦發(fā)生改變及紊亂，最終導(dǎo)致神經(jīng)性疼痛。疼痛信號的傳遞受興奮性和抑制性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)及配體—受體的巨大復(fù)雜性調(diào)節(jié)[6]。在疾病中，即使沒有有害刺激，長時間的組織損傷或炎性反應(yīng)也會引起基因表達和膜蛋白修飾的改變，從而導(dǎo)致某些痛覺受器的異常激活。

2.1 神經(jīng)元活動異常 原發(fā)性傳入神經(jīng)纖維的異位活動在周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)性疼痛的病理生理學(xué)中可能起關(guān)鍵作用。實驗人員通過探究無神經(jīng)損傷、慢性壓迫損傷和脊髓神經(jīng)結(jié)扎等多種動物模型后，報道了傳入神經(jīng)纖維在神經(jīng)性疼痛啟動和維持中持續(xù)興奮。同樣，有髓神經(jīng)軸突(A纖維)和無髓神經(jīng)軸突(C纖維)特異性的變化在疼痛模型中也有大量報道,如頻率、類型和異位放電持續(xù)時間增加[7]。這些神經(jīng)纖維放電的變化導(dǎo)致神經(jīng)性疼痛。而在進行周圍神經(jīng)阻滯治療后，外傷性周圍神經(jīng)損傷患者同側(cè)自發(fā)性和誘發(fā)性疼痛完全消失，這提示阻斷受損神經(jīng)元異?；顒涌捎糜谥委熒窠?jīng)性疼痛。硬膜外注射利多卡因阻斷背根神經(jīng)節(jié)也可減輕幻肢痛患者的疼痛感[8]。此外，隨著持續(xù)的傷害性輸入，傷害性神經(jīng)通路對刺激變得敏感，即痛覺神經(jīng)元對其正?；蜷撓聜魅氲捻憫?yīng)性增強。小膠質(zhì)細胞的過度激活同樣會觸發(fā)促痛介質(zhì)的釋放，導(dǎo)致疼痛狀態(tài)的持續(xù)[9]。由于神經(jīng)損傷后產(chǎn)生神經(jīng)性疼痛的機制錯綜復(fù)雜，從源頭阻斷受損神經(jīng)元異常活動可能是簡單有效的治療方法，例如光遺傳學(xué)技術(shù)。

2.2 受體及離子通道改變 神經(jīng)性疼痛患者中，神經(jīng)元特性的改變可能與細胞內(nèi)離子通道(鈉、鈣和鉀)改變相關(guān)。離子通道表達的變化可導(dǎo)致疼痛信號的傳入神經(jīng)元及其軸突過度興奮，且鈉離子通道和鈣離子通道還可促進神經(jīng)遞質(zhì)釋放，共同作用導(dǎo)致疼痛。既往研究人員發(fā)現(xiàn)敲除小鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元中的鈉離子通道可以減輕炎性反應(yīng)性疼痛和痛覺過敏。而且還觀察到神經(jīng)瘤內(nèi)受損神經(jīng)遠端軸突尖端存在Na+異常積累，產(chǎn)生了異位沖動[10-11]。G蛋白偶聯(lián)的內(nèi)整流鉀(GIRK)通道是疼痛信號的重要參與者，并作為阿片類藥物鎮(zhèn)痛作用的效應(yīng)器發(fā)揮重要作用。另有多項研究表明，在神經(jīng)性疼痛動物模型中鉀離子通道表達下調(diào)[12]。在神經(jīng)性疼痛模型中，DRG神經(jīng)元中的鈣離子通道電流密度上調(diào),成功敲除鈣離子通道可以介導(dǎo)鎮(zhèn)痛效果。離子通道的表達和功能極大控制了疼痛信號通路中初級傳入神經(jīng)元的電活動，因此有目的地干預(yù)離子通道，有助于治療神經(jīng)性疼痛。

2.3 G蛋白偶聯(lián)受體改變 G蛋白偶聯(lián)受體在神經(jīng)性疼痛患者體內(nèi)大量表達，提示其在神經(jīng)性疼痛的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，主要可能與痛覺感受器敏化相關(guān)。與離子通道短效作用相比，G蛋白偶聯(lián)受體可介導(dǎo)基因表達或膜興奮性的長期變化。此外，神經(jīng)損傷后激活免疫細胞涉及了許多經(jīng)典趨化因子和趨化因子的G蛋白偶聯(lián)受體[13]。G蛋白偶聯(lián)受體的激活同樣會引起炎性介質(zhì)的釋放，免疫細胞、炎性因子及各種G蛋白偶聯(lián)受體的受體激動劑共同作用于痛覺感受器上的G蛋白偶聯(lián)受體，造成疼痛[14-15]。

3 光遺傳學(xué)在神經(jīng)性疼痛治療中的應(yīng)用

光遺傳學(xué)通過在特定的細胞類型中過度表達光敏蛋白(視蛋白)來產(chǎn)生神經(jīng)回路特異性調(diào)節(jié)。與傳統(tǒng)電刺激相比，光遺傳學(xué)對神經(jīng)元刺激的明顯優(yōu)勢包括以毫秒為時間精度選擇性激活特定神經(jīng)元。這種光敏細胞刺激方法消除了將電極放置在具有相對同質(zhì)神經(jīng)元組的腦細胞核中這一極具挑戰(zhàn)性的要求。針對神經(jīng)性疼痛涉及的發(fā)病機制，光遺傳學(xué)可從不同途徑緩解治療神經(jīng)性疼痛。

3.1 中央腦部區(qū)域 光遺傳學(xué)可使大腦區(qū)域內(nèi)的離散神經(jīng)元群實現(xiàn)可逆的功能增益或功能損失。痛覺系統(tǒng)的中樞敏感和皮質(zhì)超興奮是神經(jīng)性疼痛的基本機制之一。Xiong等[16]用光遺傳學(xué)配合光刺激改變了神經(jīng)元膜的性質(zhì)和降低興奮性突觸后事件的頻率，使皮質(zhì)超興奮性正常化，減少并預(yù)防了疼痛。Gadotti等[17]證實光遺傳學(xué)技術(shù)也可通過調(diào)節(jié)內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(mPFC)的功能來治療神經(jīng)性疼痛。他們向基底外側(cè)杏仁核(BLA)中注射腺相關(guān)病毒(AAV)-Arch3.0構(gòu)建物，然后將纖維光學(xué)套管植入mPFC，并測量黃光介導(dǎo)的這種抑制視蛋白激活時的疼痛行為反應(yīng)。數(shù)據(jù)顯示，Arch3.0激活分別導(dǎo)致爪退縮閾值和對機械刺激和熱刺激的反應(yīng)延遲顯著增加，這可能是BLA向mPFC中GABA能神經(jīng)元突觸輸入的改變所介導(dǎo)的。此外，最近的人類成像研究表明，在慢性疼痛中前額皮質(zhì)(PFC)到伏隔核(NAc)的投影發(fā)生了改變。在大鼠持續(xù)性神經(jīng)性疼痛模型中，PFC的光激活會產(chǎn)生強烈的抗傷害感受效應(yīng)，從而減輕疼痛癥狀，而PFC的疼痛緩解功能可能是通過對NAc的投射介導(dǎo)的。另一項實驗同樣報道了光刺激NAc改善了大鼠的疼痛行為和降低丘腦后外側(cè)核的丘腦放電[18]。此外，利用光遺傳學(xué)可抑制前扣帶皮質(zhì)(ACC)的過度活動以減輕神經(jīng)性疼痛和類似焦慮抑郁的后果[19]，治療神經(jīng)性疼痛的同時改善抑郁癥狀，提高患者生活質(zhì)量。因此借助光遺傳學(xué)刺激大腦特定區(qū)域可能是緩解和治療神經(jīng)性疼痛的一種新策略。

3.2 周圍神經(jīng)元 周圍神經(jīng)損傷及神經(jīng)元異常活動參與了神經(jīng)性疼痛的致病，有大量數(shù)據(jù)顯示，利用光遺傳學(xué)選擇性地影響特定神經(jīng)元可以有效緩解神經(jīng)性疼痛。Dhandapani等[20]及團隊選擇性地用光激活一些外周神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)小鼠產(chǎn)生明顯的傷害性行為。后利用基于TrkB配體的光治療方法，對這些神經(jīng)元進行分子引導(dǎo)激光消融，實現(xiàn)皮膚TrkB陽性神經(jīng)元的長期收縮，并成功逆轉(zhuǎn)了神經(jīng)性疼痛。此外，有研究者發(fā)現(xiàn)體內(nèi)的GABA能神經(jīng)元的光發(fā)生去極化同樣可以減少周圍神經(jīng)的痛覺[21]。Watanaba等[22]微注射AAV來表達通道視紫紅質(zhì)-2 (ChR2)，使多巴胺能神經(jīng)元受到光刺激，這些細胞的光激活在神經(jīng)性疼痛模型小鼠中產(chǎn)生了一種顯著但短暫的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。而Raver等[23]發(fā)現(xiàn)在大鼠神經(jīng)性疼痛模型中肱旁復(fù)合體(PB)神經(jīng)元活動增強，這與來自CeA的對側(cè)臂旁神經(jīng)(LPB)抑制有關(guān)，并且他們也通過光刺激這一途徑成功抑制了疼痛。Cowie等[24]則通過光遺傳學(xué)選擇性地表達向外整流質(zhì)子泵archaerhodopsin3 (Arch)，并使用透皮光激活A(yù)rch來抑制神經(jīng)性疼痛模型中的周圍皮膚末梢，阻斷了表達降鈣素基因相關(guān)肽- α外周神經(jīng)元(CGRPα)的信號，成功降低了疼痛反應(yīng)。這些結(jié)果均提示通過調(diào)節(jié)神經(jīng)損傷后的異常神經(jīng)元活動這一途徑，光遺傳學(xué)有望成為治療神經(jīng)疼痛的有效方法之一。

3.3 離子通道 離子通道是疼痛產(chǎn)生的重要參與者。鑒于神經(jīng)性疼痛的致病通路十分復(fù)雜，研究人員認為直接作用于周圍痛覺感受器的終端，阻斷疼痛信號傳導(dǎo)，是治療神經(jīng)性疼痛的一條簡單有效的方法。有學(xué)者將抑制Arch質(zhì)子泵送到Nav1.8(+)主傳入血管，利用黃光刺激可靠地阻斷了背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(DRG)的電誘導(dǎo)動作電位。實驗結(jié)果顯示Nav1.8-Arch(+)小鼠的后爪急性透皮光照可顯著降低炎性條件下的機械異位痛。此外，對麻醉的Nav1.8-Arch(+)小鼠外周傳入神經(jīng)長時間光學(xué)沉默可導(dǎo)致刺激后鎮(zhèn)痛[11,25]。然而，目前可用的光發(fā)生抑制工具僅提供了短期的神經(jīng)元沉默，不能提供長期抑制。有研究者提供了一個優(yōu)化的藍光敏感合成鉀離子通道BLINK2，它在3個物種的神經(jīng)元中都有良好的表達。這個通道被低劑量的藍光照射激活，并在照明停止后黑暗中保持活躍(數(shù)十分鐘)，而這種激活引起了長時間的神經(jīng)元放電抑制。作為一個概念驗證的應(yīng)用，研究者在一個自由移動的大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型中證明，少量BLINK2通道的激活導(dǎo)致了疼痛感覺的長期減少(30 min)[26]。此外，利用光敏第三代氯離子泵(eNpHR3.0)抑制痛覺感受器的動作電位生成。當(dāng)通過AAV6肝內(nèi)注射給藥時，eNpHR3.0在恒定的黃光照射下激活DRG神經(jīng)元，強烈抑制膜超極化引發(fā)的動作電位。該通道的體內(nèi)刺激足以防止神經(jīng)性疼痛模型中的疼痛行為，表明其治療潛力。

綜上所述，光遺傳學(xué)有望通過不同機制來達到治療神經(jīng)性疼痛的目的。但需要注意的是，光遺傳學(xué)用于神經(jīng)性疼痛治療的真正挑戰(zhàn)是確定損傷的傷害性神經(jīng)元，而將其用于神經(jīng)性疼痛治療的另一個主要障礙是光敏蛋白傳遞給目標(biāo)細胞。通常通過病毒基因遞送方法將光敏蛋白引入靶向哺乳動物神經(jīng)元[27]。而Dine等[28]已經(jīng)充分描述了人類中病毒載體遞送系統(tǒng)的限制。最近研究發(fā)現(xiàn)，非侵入性經(jīng)顱聚焦超聲技術(shù)可通過全身注射基于脂質(zhì)的微泡(由超聲造影劑組成的混合物)和感興趣的分子來靶向血腦屏障[29]。利用這一技術(shù)，可以遞送編碼各種光活化蛋白質(zhì)通道的病毒載體，是體內(nèi)允許完全非侵入性的神經(jīng)刺激。此外，最近一項實驗通過克服所需恒定照明的需要，證明了階梯功能抑制通道視紫紅質(zhì)SwiChR優(yōu)于正常通道視紫紅質(zhì)，這種策略將所需的光照暴露降低>98%，因此有望解決光遺傳抑制的長期限制。optoPAIN作為一種非侵入性評估疼痛敏感性變化的光遺傳平臺，同樣可用于檢查疼痛的藥理學(xué)和化學(xué)抑制[30]。

4 小結(jié)與展望

目前治療神經(jīng)性疼痛的局限之一是對所涉及的神經(jīng)生物學(xué)和神經(jīng)回路的尚未完全理解。將光遺傳學(xué)的細胞特異性和時間控制與體外電生理記錄相結(jié)合，可更容易地梳理出特定通路和電路中的神經(jīng)元之間的通信。并且光遺傳學(xué)利用基因識別周圍感覺纖維亞群，具有高時間分辨率，克服了遺傳消融的代償限制。而且在動物模型上，已有許多實驗提供了光遺傳學(xué)通過作用于大腦區(qū)域、外周神經(jīng)元、受體及離子通道改變和G蛋白偶聯(lián)受體等途徑成功治療神經(jīng)性疼痛的證據(jù)。此外，光遺傳學(xué)作為學(xué)界一個新領(lǐng)域，其技術(shù)和研究正在不斷開展深入。鑒于神經(jīng)性疼痛尚缺乏有效治療手段及其病理生理機制仍未闡明，具有高度特異性的光遺傳學(xué)應(yīng)成為未來治療方法的主要焦點之一。