IL-23/IL-17炎性反應(yīng)軸與HBV宮內(nèi)感染的相關(guān)性研究

王蘭芳，高智蓮，葛曉偉，張倩，張靜，吳秀梅，陳先俠

乙型肝炎病毒(HBV)母嬰垂直傳播是其高致病及嬰幼兒慢性感染的主要原因，宮內(nèi)感染HBV易成為慢性攜帶者，且具有發(fā)展為肝硬化、肝癌的高風(fēng)險(xiǎn)[1]。目前關(guān)于宮內(nèi)感染的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未十分清楚，以往報(bào)道表明，輔助性T細(xì)胞17(Th17)具有促炎作用，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)具有抑制炎性反應(yīng)的作用，Treg/Th17平衡可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，且與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，白介素-23(IL-23)/IL-17炎性反應(yīng)軸在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中可能具有重要作用[3]。Th17細(xì)胞能夠分泌具有較強(qiáng)致炎作用的IL-17，IL-17具有促進(jìn)炎性因子和趨化因子產(chǎn)生，以及趨化中性粒細(xì)胞聚集的作用[4]。研究表明，IL-17在自身免疫性疾病中也具有重要作用[5]。促炎因子IL-23主要由樹突狀細(xì)胞分泌，其能夠誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的增殖及IL-17的分泌，在體內(nèi)發(fā)揮致炎作用[6]。IL-23/IL-17炎性反應(yīng)軸在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，但關(guān)于IL-23/IL-17炎性反應(yīng)軸在HBV宮內(nèi)感染的研究鮮有報(bào)道?，F(xiàn)分析IL-23、IL-17與相關(guān)因子IL-6、干擾素-γ(IFN-γ)的關(guān)系及兩者在HBV宮內(nèi)感染中的作用，為相關(guān)疾病的治療提供理論依據(jù)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年8月—2019年9月安徽省婦幼保健院/安徽醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院產(chǎn)科住院分娩的HBsAg陽性孕婦120例為研究組，年齡20～40(28.25±2.58)歲，胎齡37～41(38.49±1.30)周。根據(jù)新生兒臍帶血乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)檢測(cè)結(jié)果分為2個(gè)亞組，HBV-DNA陽性者為宮內(nèi)感染亞組(n=18)，HBV-DNA陰性者為宮內(nèi)未感染亞組(n=102)。選擇同期來院體檢的健康孕婦120例為健康對(duì)照組，年齡21～40(28.42±2.34)歲，胎齡37～41(38.27±1.09)周。2組孕婦均為單胎妊娠，年齡、胎齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，全部孕婦及其家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①孕婦血清檢測(cè)HBsAg陽性；②孕期無其他產(chǎn)科合并癥及并發(fā)癥；③肝腎功能正常。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有先天性免疫疾病者；②近期服用抗病毒藥物、皮質(zhì)激素類藥物；③胎兒畸形者。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 樣本采集：采集孕婦分娩前外周靜脈血及新生兒臍帶血各2管(共4管，每管3 ml)，母兒血液各一管于24 h內(nèi)檢測(cè)Treg和Th17細(xì)胞；孕婦另一管血液于室溫靜置30 min，離心得血清分裝于無菌EP管中，-20℃凍存?zhèn)溆?；新生兒臍帶血另一管用來檢測(cè)HBV-DNA。新生兒臍帶血采集前首先用生理鹽水擦拭臍帶，然后用酒精擦拭，以防止臍帶血污染。

1.3.2 IL-23/IL-17炎性反應(yīng)軸相關(guān)指標(biāo)測(cè)定：(1)孕婦血Treg和Th17細(xì)胞測(cè)定，采用FACSCanto Ⅱ型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，計(jì)算Treg、Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比率。(2)孕婦及新生兒臍帶血清細(xì)胞因子檢測(cè)，以酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)孕婦及新生兒臍帶血清IL-17、IL-23、IL-6、IFN-γ水平，ELISA試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司，檢測(cè)步驟按照說明書進(jìn)行。

1.3.3 新生兒臍帶血HBV-DNA檢測(cè)：采用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)新生兒臍帶血HBV-DNA水平，使用Trizol試劑盒(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司)提取總RNA，PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TakaRa公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，運(yùn)用DNASTAR軟件設(shè)計(jì)引物，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性5 s，57℃退火20 s，57℃延伸20 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。所有操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行，HBV-DNA水平≥1×103拷貝/ml則判定為宮內(nèi)感染。

2 結(jié) 果

2.1 2組宮內(nèi)感染比較 經(jīng)RT-PCR檢測(cè)新生兒臍帶血HBV-DNA發(fā)現(xiàn)，研究組孕婦分娩的新生兒發(fā)生宮內(nèi)感染18例(15.0%)，健康對(duì)照組無新生兒發(fā)生宮內(nèi)感染，研究組宮內(nèi)感染率顯著高于健康對(duì)照組(χ2=19.459，P=0.000)。

2.2 各組血Treg和Th17細(xì)胞水平比較 2亞組孕婦血Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞比率均顯著高于健康對(duì)照組(P<0.05)，且宮內(nèi)感染亞組上述指標(biāo)均高于宮內(nèi)未感染亞組(P<0.05)，見表1。

表1 各組孕婦血Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞水平比較

2.3 各組孕婦血清IL-17、IL-23、IL-6、IFN-γ水平比較 與健康對(duì)照組比較，宮內(nèi)未感染亞組孕婦血清IL-17、IL-23、IL-6、IFN-γ水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而宮內(nèi)感染亞組孕婦血清IL-17、IL-23、IL-6水平顯著升高，血清IFN-γ水平顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.4 新生兒臍帶血清IL-17、IL-23、IL-6、IFN-γ水平比較 各組新生兒臍帶血清IL-17、IL-23、IL-6、IFN-γ水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.5 IL-23/IL-17炎性反應(yīng)軸與Treg、Th17細(xì)胞相關(guān)性分析 孕婦血清IL-23、IL-17、IL-6、Treg細(xì)胞及Th17細(xì)胞各因子間均呈顯著正相關(guān)，與IFN-γ均呈顯著負(fù)相關(guān)(P均<0.05)，見表4。

2.6 血清IL-17、IL-23診斷HBV宮內(nèi)感染ROC分析 ROC結(jié)果顯示，孕婦血清IL-17、IL-23聯(lián)合診斷HBV宮內(nèi)感染的價(jià)值明顯優(yōu)于單項(xiàng)診斷，見表5、圖1。

表2 各組孕婦血清IL-17、IL-23、IL-6、IFN-γ水平比較

表3 各組新生兒臍帶血清IL-17、IL-23、IL-6、IFN-γ水平比較

表4 IL-23/IL-17炎性反應(yīng)軸與Treg、Th17細(xì)胞相關(guān)性分析

圖1 孕婦血清IL-17、IL-23對(duì)HBV宮內(nèi)感染的診斷價(jià)值ROC曲線分析

3 討 論

HBV宮內(nèi)感染是指孕婦感染HBV后通過胎盤感染腹中胎兒，又稱之為母嬰傳播或先天感染。宮內(nèi)感染途徑從時(shí)間上主要分為產(chǎn)前、產(chǎn)時(shí)、產(chǎn)后，分娩時(shí)感染HBV主要是宮頸分泌物及產(chǎn)婦的血液[7-8]。目前對(duì)于產(chǎn)時(shí)、產(chǎn)后HBV感染可以使用乙肝疫苗和乙型肝炎免疫球蛋白(hepatitis B immunoglobulin，HBIG)阻斷，對(duì)于產(chǎn)前感染的治療方法則較難實(shí)施。溫海秀等[9]研究表明，母親HBeAg陽性新生兒HBV宮內(nèi)傳播率為18.52%，陰性則為6.59%。邵昱璋等[10]研究表明，新生兒宮內(nèi)感染率與母體胎盤及血清中HBV-DNA水平有密切聯(lián)系，宮內(nèi)感染兒童其母體HBV-DNA水平均高于105拷貝/ml。本研究中，新生兒HBV-DNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，宮內(nèi)感染率為15.0%，低于上述研究結(jié)果，可能與選擇的對(duì)象及研究樣本量不同有關(guān)，但是上述結(jié)果均說明HBV宮內(nèi)感染率仍很高，而宮內(nèi)感染是導(dǎo)致母嬰阻斷失敗的重要原因，對(duì)新生兒影響極大，因此及時(shí)探索影響宮內(nèi)感染的相關(guān)機(jī)制并采取有效措施預(yù)防宮內(nèi)感染極為重要。

IL-23主要由樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，具有促進(jìn)細(xì)胞因子、炎性反應(yīng)因子、趨化因子產(chǎn)生的作用，能夠激活并調(diào)節(jié)T細(xì)胞誘導(dǎo)的慢性炎性反應(yīng)及自身免疫反應(yīng)[11]。Th17細(xì)胞主要由幼稚CD4+T細(xì)胞分化而來，IL-23作為CD4+T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞不可缺少的細(xì)胞因子，能夠誘導(dǎo)激活CD4+T細(xì)胞的增殖與分化，刺激IL-17/IL-17F的分泌，加強(qiáng)IL-23/IL-17炎性反應(yīng)軸誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)性疾病[12-13]。IL-17/IL-17F與受體結(jié)合后促進(jìn)IL-6的表達(dá)，趨化中性粒細(xì)胞聚集到炎性反應(yīng)部位[14]。Treg細(xì)胞在IL-23的作用下可轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹置贗L-17功能的細(xì)胞，促進(jìn)IL-17分泌增多。本研究顯示，宮內(nèi)未感染亞組及宮內(nèi)感染亞組Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例均顯著高于健康對(duì)照組，宮內(nèi)感染亞組孕婦血Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例高于宮內(nèi)未感染亞組，與以往研究結(jié)果一致，說明HBV宮內(nèi)感染的孕婦體內(nèi)存在免疫功能失調(diào)的現(xiàn)象，而Treg/Th17失衡可能是引起HBV宮內(nèi)感染的重要免疫機(jī)制之一。

IL-23/IL-17參與體內(nèi)多種炎性反應(yīng)、自身免疫疾病的調(diào)節(jié)及妊娠期疾病的發(fā)展，IL-23/IL-17炎性反應(yīng)軸與Th17細(xì)胞的活化和維持密切相關(guān)，在多種炎性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、炎性腸病、哮喘中具有重要作用，并影響HBV宮內(nèi)感染過程[15]。Th17細(xì)胞參與炎性反應(yīng)，促進(jìn)肝臟的炎性反應(yīng)損傷。賈冠華等[16]研究結(jié)果顯示，慢性乙型病毒性肝炎患者血清中IL-23表達(dá)量隨病情嚴(yán)重程度而上升。HBx蛋白誘導(dǎo)NF-κB的活化，進(jìn)而通過Erk-p65/p50信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)IL-23的分泌，IL-23能夠刺激HBV感染患者肝臟及外周血中Th17細(xì)胞分泌IL-17[17]。王琳等[18]研究結(jié)果顯示，HBV感染患者IL-23主要來源于髓樣樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，且IL-23/IL-23R軸調(diào)節(jié)IL-17的分泌。IFN-γ主要由Th1型細(xì)胞分泌，在HBV的清除中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，宮內(nèi)感染亞組血清IL-17、IL-23、IL-6水平高于健康對(duì)照組和宮內(nèi)未感染亞組，IFN-γ水平低于健康對(duì)照組和宮內(nèi)未感染亞組，同時(shí)ROC曲線分析孕婦血清IL-17、IL-23預(yù)測(cè)HBV宮內(nèi)感染的AUC分別為0.791、0.693，截?cái)嘀禐?64.77 ng/L、227.99 ng/L，表明血清IL-17高于264.77 ng/L，IL-23高于227.99 ng/L時(shí)可能有HBV宮內(nèi)感染，且IL-17、IL-23聯(lián)合診斷價(jià)值更高，其AUC為0.803，表明兩者聯(lián)合可提高臨床診斷價(jià)值，同時(shí)也說明HBV感染后炎性因子IL-23分泌增多，促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化進(jìn)而促進(jìn)IL-17的分泌，IL-17又促進(jìn)炎性因子IL-6的分泌，因此推測(cè)IL-23/IL-17炎性軸在HBV宮內(nèi)感染中發(fā)揮重要作用，但是關(guān)于此途徑是否和其他細(xì)胞因子或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑共同參與HBV宮內(nèi)感染的發(fā)生，還有待進(jìn)一步更深層次分析。

表5 孕婦血清IL-17、IL-23對(duì)HBV宮內(nèi)感染的診斷價(jià)值分析

還有研究證實(shí)，胎兒及新生兒免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，免疫功能不成熟，早期體液及細(xì)胞免疫水平較低，細(xì)胞因子IL-17、IL-6、IFN-γ分泌水平更低[19-21]。本研究結(jié)果顯示，健康對(duì)照組和研究組新生兒臍帶血清中IL-23、IL-17、IL-6、IFN-γ比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且均低于母體相應(yīng)因子水平，表明新生兒免疫功能不完善，Th細(xì)胞功能低下，各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生能力也較低，存在多種炎性反應(yīng)因子及細(xì)胞因子的缺陷，故患兒不能及時(shí)有效地清除體內(nèi)的HBV病毒，因此，對(duì)HBV宮內(nèi)感染的預(yù)防應(yīng)重點(diǎn)放在孕婦身上，減少孕婦的體內(nèi)病毒量。

綜上所述，IL-23/IL-17炎性反應(yīng)軸與HBV宮內(nèi)感染密切相關(guān)，IL-23與IL-17呈顯著正相關(guān)，且二者均可作為孕婦HBV宮內(nèi)感染的臨床檢測(cè)指標(biāo)。但本研究由于樣本數(shù)量較少，未對(duì)遠(yuǎn)期治療效果進(jìn)行隨訪，存在不足之處，今后將擴(kuò)大樣本數(shù)量進(jìn)行深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

王蘭芳：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；高智蓮：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；葛曉偉、張倩：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；張靜、吳秀梅：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；陳先俠：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫