布氏桿菌感染者血清Tim-3/HMGB1與相關(guān)細(xì)胞因子的變化

楊麗瑋，盧佩佩 ，西麗娜依·買買提，郭淑麗

布氏桿菌病是由布氏桿菌感染引起的人畜共患傳染病，其主要通過消化道、皮膚裂隙、疤痕及吸入的粉塵感染人體，引起多系統(tǒng)、多器官損害[1]。免疫受體T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域3(Tim-3)在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，在機(jī)體慢性病毒感染、腫瘤免疫逃逸中扮演關(guān)鍵的角色[2]。而高遷移率族蛋白1(HMGB1)是一種非組蛋白，位于細(xì)胞核中，由瀕死細(xì)胞、癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞分泌，是Tim-3的配體，在布氏桿菌感染者細(xì)胞表面上高表達(dá)的免疫受體Tim-3，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種細(xì)胞因子、趨化因子和活性氧等，進(jìn)而導(dǎo)致炎性反應(yīng)或細(xì)胞組織損傷[3]。然而，目前尚未闡明Tim-3/HMGB1在布氏桿菌感染者中的表達(dá)變化，以及其與相關(guān)細(xì)胞因子水平變化的關(guān)系，基于此，分析布氏桿菌感染者體內(nèi)Tim-3/HMGB1與相關(guān)細(xì)胞因子的變化，為布魯氏感染者治療提供新的靶點(diǎn)，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年10月—2018年10月于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院感染科住院布氏桿菌感染者32例作為布病組，男21例，女11例，年齡22～62(37.45±7.22)歲；病程3～10(4.76±2.15)個月；有明確接觸史25例(78.12 %)，其中屠宰工作人員4例，養(yǎng)殖人員14例，疾控人員7例；臨床分期：急性期25例，慢性期7例；既往治療史14例；合并癥：睪丸炎18例，卵巢炎9例，心、腎及神經(jīng)系統(tǒng)受累表現(xiàn)者5例。同時選取同期于醫(yī)院體檢的正常人30例作為健康對照組，男19例，女11例，年齡22～65(38.27±6.87)歲；2組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。均衡可比。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合布氏桿菌病診療指南(試行)與布氏桿菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS 269—2019)[4-5]；②均追蹤隨訪檢測2個月以上。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①結(jié)核、敗血癥、傷寒、副傷寒、風(fēng)濕熱等疾病者；②資料不完整者；③中途退出者。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 血清Tim-3、HMGB1、TNF-α、IL-1β及干細(xì)胞因子(SCF)水平的檢測：采集2組研究對象的外周血清3 ml，置于-80 ℃冰箱中備用。使用賽默飛世爾科技(中國)有限公司生產(chǎn)的熱電MK3酶標(biāo)儀，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測血清Tim-3、HMGB1、TNF-α、IL-1β及SCF水平。檢測操作嚴(yán)格按照賽默飛世爾科技(中國)有限公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 TGF-β水平檢測：采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法檢測研究對象的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中TGF-β的斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)(SFC)。采抗凝血3 h內(nèi)分離PBMC，在包被特異性抗人TGF-β抗體的96孔酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)板，每孔加入100 μl培養(yǎng)液調(diào)至終濃度為2×105個PBMC。每份PBMC樣本加3個孔，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)100 μl為陰性對照孔，終濃度為5 μg/ml植物血凝素(PHA)為陽性對照孔，終濃度為5 μg/ml布氏桿菌重組蛋白抗原(BCSP31)為實(shí)驗(yàn)刺激孔，置37 ℃、5%含量的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)板置于德國BIOSYS公司提供的YZ-2000 C 型酶聯(lián)斑點(diǎn)分析儀，調(diào)參數(shù)，計數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清Tim-3、HMGB1水平比較 布病組Tim-3、HMGB1水平高于健康對照組(P<0.01)，見表1。

表1 2組受試者血清Tim-3、HMGB1水平比較

2.2 2組血清TNF-α、IL-1β及SCF水平比較 布病組血清TNF-α、IL-1β及SCF水平均高于健康對照組(P<0.01)，見表2。

表2 2組受試者血清TNF-α、IL-1β及SCF水平比較

2.3 2組PBMC中分泌TGF-β的SFC比較 布病組中采用BCSP31為實(shí)驗(yàn)刺激孔TGF-β的SFC明顯多于健康對照組，而2組中陰性與陽性對照孔TGF-β的SFC比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3、圖1、圖2。

3 討 論

布氏桿菌侵入機(jī)體后被吞噬細(xì)胞吞噬，逐步形成感染灶、菌血癥，隨后入侵人體重要臟器而大量繁殖，導(dǎo)致臨床表現(xiàn)為波浪熱，伴隨關(guān)節(jié)痛和全身乏力等癥狀[1]。Tim-3蛋白作為促炎性刺激參與靶細(xì)胞的信號傳導(dǎo)，在炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。HMGB1是一種非組蛋白，位于細(xì)胞核內(nèi)，與DNA結(jié)合以促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄過程。此外，轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)在炎性反應(yīng)、組織修復(fù)和胚胎發(fā)育等方面的生物學(xué)功能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β對細(xì)胞的生長、分化和免疫功能也有重要的調(diào)節(jié)作用[6]。而HMGB1會觸發(fā)布氏桿菌病患者釋放TNF-α，進(jìn)而誘導(dǎo)白細(xì)胞產(chǎn)生白介素1β(IL-1β)，導(dǎo)致IL-1β誘導(dǎo)感受態(tài)細(xì)胞分泌SCF[7]。

表3 2組受試者PBMC中分泌TGF-β的SFC比較

注：與健康對照組比較，a P<0.01

此外，最近發(fā)現(xiàn)HMGB1在響應(yīng)內(nèi)源性和/或外源性刺激(例如缺氧、內(nèi)毒素等)情況下產(chǎn)生異常的蛋白質(zhì)，可能被免疫系統(tǒng)識破,容易發(fā)生細(xì)胞死亡，瀕死/受傷的細(xì)胞被動釋放或由免疫/癌細(xì)胞分泌時起損傷相關(guān)分子模式的作用[8]。此過程之后，HMGB1參與觸發(fā)靶細(xì)胞中的信號傳導(dǎo)事件。因此，其可作為受應(yīng)激源影響的細(xì)胞分泌的因子[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在急性髓細(xì)胞性白血病期間，HMGB1水平顯著升高[10]。最近的證據(jù)表明，HMGB1與免疫受體Tim-3可能在重度顱腦損傷、NK細(xì)胞上的表達(dá)增加[11-12]。由Tim-3觸發(fā)的信號傳導(dǎo)途徑影響TNF-α等炎性細(xì)胞因子，與宿主免疫防御和造血的控制有關(guān)[13-14]。本研究結(jié)果顯示，布氏桿菌感染者血清Tim-3、HMGB1、TNF-α、IL-1β及SCF水平上升，這提示以上指標(biāo)水平高低與布氏桿菌感染情況存在一定的聯(lián)系。

TGF-β可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、分子及其各自受體表達(dá)的間接機(jī)制來影響細(xì)胞分化[15]。這些反應(yīng)強(qiáng)烈影響一系列細(xì)胞類型的生長和表型。TGF-β活性過高或降低可能分別導(dǎo)致纖維化疾病和過度增殖性疾病[16]。本研究顯示，PBMC中分泌TGF-β的SFC顯著較高，間接提示布氏桿菌感染者存在受體表達(dá)的免疫應(yīng)答調(diào)控機(jī)制。蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成伴隨著α-螺旋含量的增加，而β-鏈的損失可能主要來自Tim-3蛋白。生物學(xué)測試表明，以HMGB1依賴性方式從布氏桿菌感染者細(xì)胞釋放的TNF-α能夠誘導(dǎo)原代人健康白細(xì)胞分泌IL-1β。與本研究的觀察結(jié)果相符，后者表明響應(yīng)HMGB1刺激的TNF-α和IL-1β分泌均上調(diào)[17]。該反應(yīng)是布氏桿菌感染者進(jìn)展中非常重要的一步，因?yàn)镮L-1β與Ⅰ型IL-1受體相互作用，并誘導(dǎo)布氏桿菌感染者細(xì)胞增殖所需的SCF產(chǎn)生和分泌[18]。布氏桿菌感染者細(xì)胞表達(dá)可識別SCF的Kit受體，但由于AML細(xì)胞能夠誘導(dǎo)健康細(xì)胞產(chǎn)生SCF，因此這種造血因子具有高度致癌性，在原代小鼠骨髓細(xì)胞中看到了相同的效果。當(dāng)暴露于HMGB1時，TNF-α、IL-1β和SCF的水平升高，表明HMGB1也可以在骨髓中誘導(dǎo)這種作用[1]。這與本結(jié)果顯示布氏桿菌感染者Tim-3、HMGB1水平較高，同時TNF-α、IL-1β及SCF水平上升一致。因此， HMGB1作為Tim-3和其他免疫受體的配體對布氏桿菌感染者進(jìn)展至關(guān)重要。

綜上所述，布氏桿菌病患者血清Tim-3/HMGB1均增加，且在布氏桿菌抗原刺激后形成TGF-β的斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)明顯增加，這可能導(dǎo)致布氏桿菌感染過程免疫應(yīng)答提升，不利于機(jī)體對布氏桿菌的有效清除。

圖2 2組PBMC中分泌TGF-β的SFC斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

楊麗瑋、盧佩佩：設(shè)計研究方案，實(shí)施研究過程，資料搜集整理，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文撰寫；西麗娜依·買買提、郭淑麗：提出研究思路，課題設(shè)計，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文修改，論文審核