間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性呼吸窘迫綜合征作用研究進(jìn)展

張海月，劉潺綜述 吳小軍審校

急性呼吸窘迫綜合征(ARDS) 是急性肺損傷(ALI) 最嚴(yán)重的形式，是在多種原發(fā)病和誘因作用下發(fā)生的急性缺氧性呼吸衰竭綜合征[1-2]。肺部感染，尤其是細(xì)菌性肺炎是常見的病因;另外，膿毒血癥、全身炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)、吸入性肺炎、創(chuàng)傷、大量輸血、重癥壞死性胰腺炎等也是誘發(fā)ARDS的危險因素。當(dāng)肺組織受到上述損傷因素刺激時，肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞受損，內(nèi)皮屏障通透性增加，液體外滲至肺間質(zhì)和肺泡腔，引起肺泡和肺間質(zhì)水腫，同時肺泡表面活性物質(zhì)生成減少、透明膜形成，引起肺順應(yīng)性下降，通氣/血流比例失調(diào)。TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等促炎因子釋放，促進(jìn)中性粒細(xì)胞向肺部損傷部位募集并激活，釋放活性氧、蛋白酶、白三烯等介質(zhì)，破壞毛細(xì)血管內(nèi)皮和肺泡上皮、收縮支氣管、堵塞小氣道。另外炎性反應(yīng)細(xì)胞的增生和纖維化階段，增加了肺泡—毛細(xì)血管膜的厚度，導(dǎo)致彌散功能障礙，進(jìn)一步加重低氧血癥。目前，人們對ARDS發(fā)病機(jī)制有了更深的了解，同時機(jī)械通氣及支持療法也有了很大的進(jìn)步，但是ARDS的病死率仍高達(dá)30%～50%。因此，新的治療措施亟待提出。近年來，很多研究報到了間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)治療肺部疾病的潛力[3-5]。MSCs可以通過細(xì)胞接觸依賴性機(jī)制和釋放可溶性因子發(fā)揮作用，表現(xiàn)為抗炎、抗凋亡、促進(jìn)內(nèi)皮及上皮細(xì)胞修復(fù)、增強(qiáng)微生物及肺泡內(nèi)液體清除等過程，改善了ARDS動物模型的肺功能及生存率。另外MSCs 表面表達(dá)低水平Ⅰ型人類白細(xì)胞抗原(HLA)，不表達(dá)Ⅱ型主要組織相容性抗原(MHC-Ⅱ)和T細(xì)胞共刺激分子，具有低免疫原性，為同種異體MSCs治療提供理論依據(jù)[6]。部分早期臨床試驗也提供了MSCs用于治療ARDS患者安全性的證據(jù)。

1 MSCs概述

MSCs 為成體干細(xì)胞，最早從骨髓中分離出來，具有增殖分化能力，產(chǎn)生成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞各種間充質(zhì)表型。2006年，國際細(xì)胞治療學(xué)會間充質(zhì)干細(xì)胞與組織干細(xì)胞委員會提出定義MSCs的最低標(biāo)準(zhǔn)：(1)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下對塑料器皿的黏附性；(2)必須表達(dá)CD73、CD90和CD105表面分子，不表達(dá)CD11b、CD14、CD34、CD45、CD79和HLA-DR;(3)能夠在體外分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。目前，MSCs不僅可從骨髓中獲得，還可以從脂肪組織、肺組織、臍帶血、胎盤等其他幾種組織中分離[7]。不同來源的MSCs其基因表達(dá)、分泌物質(zhì)和細(xì)胞表面蛋白具有異質(zhì)性，從而影響其免疫調(diào)節(jié)作用[8-10]。與胚胎干細(xì)胞相比，MSCs有更低的致瘤性，可在體外迅速增殖，有更大的臨床應(yīng)用潛力。MSCs還可在無需宿主與受體的匹配條件下發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，因此可用于自體或異體移植的抗排斥治療。多項試驗研究表明，MSCs在心肌梗死、糖尿病、肝功能衰竭和急性腎功能衰竭等臨床疾病中可能具有潛在的治療應(yīng)用。動物實驗研究也表明MSCs可能對ALI、ARDS有治療作用。

2 MSCs治療ARDS作用機(jī)制

MSCs遷移定植到肺損傷部位后，可在體內(nèi)分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，參與肺泡上皮的更新。但在LPS誘導(dǎo)急性肺損傷的動物實驗中發(fā)現(xiàn)，MSCs的治療作用并不依靠MSCs分化成肺泡或氣道上皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等任何一種細(xì)胞類型，可能與MSCs向損傷部位募集，通過與宿主細(xì)胞相互作用并分泌多種可溶性分子來實現(xiàn)[11-12]。MSCs可分泌生長因子、抗炎因子、調(diào)節(jié)上皮和內(nèi)皮通透性的因子等多種物質(zhì)作用于肺損傷部位，還可以分泌外泌體、微囊泡，將線粒體轉(zhuǎn)移到肺泡減輕肺部損傷，促進(jìn)組織修復(fù)[13-14]。

2.1 MSCs調(diào)節(jié)內(nèi)皮和上皮細(xì)胞通透性 微血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性是維持內(nèi)皮屏障穩(wěn)定性的重要因素。內(nèi)皮屏障通透性增加，液體外滲，上皮細(xì)胞損傷肺泡表面活性物質(zhì)減少，肺組織水腫和彌漫性炎性反應(yīng)是ARDS主要表現(xiàn)。MSCs分泌的部分物質(zhì)具有調(diào)節(jié)肺泡微血管系統(tǒng)通透性的能力。血管生成素1(Ang-1)是內(nèi)皮Tie2受體的配體，具有調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞通透性，保護(hù)上皮細(xì)胞屏障作用。炎性環(huán)境下培養(yǎng)MSCs可增強(qiáng)其產(chǎn)生Ang-1的能力，當(dāng)siRNA沉默Ang-1表達(dá)時，MSCs失去對上皮細(xì)胞通透性的調(diào)節(jié)能力。角質(zhì)細(xì)胞生長因子7(KGF-7)在內(nèi)皮細(xì)胞再生和損傷修復(fù)中有重要作用，可減輕ALI動物模型的肺泡水腫。過表達(dá)KGF-7的MSCs改善了微血管通透性，抑制了TNF-α、IL-1β等促炎因子的釋放，增加了抗炎因子IL-10釋放[15]。肝細(xì)胞生長因子(HGF)能夠保護(hù)細(xì)胞間緊密連接，維持內(nèi)皮屏障[16-17]。另外，MSCs分泌的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)通過降低內(nèi)皮通透性、抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抑制炎性反應(yīng)，發(fā)揮對ALI動物模型的保護(hù)作用[18-19]。

2.2 MSCs抗炎作用 研究表明，MSCs能夠分泌白細(xì)胞介素1受體拮抗劑(IL-1RA)、KGF等多種因子發(fā)揮抗炎作用[20-21]。MSCs能夠抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)ALI模型血液循環(huán)及肺組織內(nèi)促炎因子IFN-γ、IL-1β、MIP1-α、KC的產(chǎn)生。研究表明MSCs 降低了內(nèi)毒素誘導(dǎo)ALI模型肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞數(shù)，增加了表達(dá)(iNOS)-Ym1+的M2型巨噬細(xì)胞的比例，機(jī)制可能與MSCs分泌的胰島素樣生長因子1(IGF-1)促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)化，抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)有關(guān)[22]。

2.3 MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用 MSCs能夠影響樹突狀細(xì)胞的成熟，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)化[23-26]。MSCs分泌的前列腺素E2(PGE2)能夠促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞分泌抗炎因子IL-10，從而抑制了中性粒細(xì)胞的黏附、跨上皮轉(zhuǎn)移，對炎性反應(yīng)起到抑制作用[27]。MSCs分泌的KGF促進(jìn)了GM-CSF生成，增強(qiáng)了肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬功能，KGF還能通過增加抗凋亡因子Bcl-2、降低凋亡相關(guān)因子Bax及Caspase-3的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞的凋亡[28]。MSCs還能抑制B淋巴細(xì)胞增殖分化，抑制T淋巴細(xì)胞增殖，增加Treg細(xì)胞分化，抑制Th17分化[29-30]。MSCs分泌的吲哚胺2，3雙加氧酶(IDO)和KGF6是其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的重要分子。IDO通過耗竭色氨酸并生成犬尿氨酸，從而抑制T細(xì)胞增殖。MSCs上調(diào)與IL-8結(jié)合的KGF6，發(fā)揮抗炎作用。MSCs除了分泌抗炎因子外，還能促進(jìn)IL-6、IL-8的產(chǎn)生。IL-6、IL-8為促炎因子，但有研究表明抑制MSCs IL-6的表達(dá)，降低了其對肺損傷的保護(hù)作用，另外IL-8可增強(qiáng)VEGF表達(dá)，促進(jìn)血管生成[31]。

2.4 MSCs提高肺泡液清除率 肺泡液清除率(AFC)是肺泡上皮細(xì)胞通過鈉離子通道、水通道蛋白、Na-K-ATP酶清除肺泡水腫液的能力。AFC下降對ARDS的病死率有預(yù)測價值。在高氣道壓力機(jī)械通氣、細(xì)菌感染、促炎因子釋放等情況下可引起AFC降低。MSCs可通過KGF依賴途徑改善LPS誘導(dǎo)的AFC下降，KGF主要促進(jìn)鈉轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白向肺泡上皮細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運(yùn)來增加肺泡液的清除。KGF還能降低水通道蛋白5的表達(dá)并抑制Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞向Ⅰ型轉(zhuǎn)化。也有研究表明，KGF對AFC的調(diào)節(jié)作用是通過增加上皮細(xì)胞修復(fù)、細(xì)胞黏附和遷移來實現(xiàn)。

2.5 MSCs增強(qiáng)微生物清除作用 MSCs通過分泌抗菌肽和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬作用減輕細(xì)菌性膿毒血癥。MSCs受到細(xì)菌刺激后可分泌β防御素BD2、抗菌肽LL-37和Lipocain 2。BD2能夠抑制細(xì)菌生長，LL-37有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒作用，Lipocain 2在肺部感染時能夠調(diào)節(jié)CXCL9等趨化因子表達(dá)，減輕炎性反應(yīng)[32-34]。MSCs條件培養(yǎng)液(conditioned media, CM) 中含有高濃度抗菌肽能夠抑制細(xì)菌生長。肺損傷的動物實驗中，MSCs可抑制動物肺組織勻漿液中細(xì)菌生長，而LL-37抗體抑制了這一作用；通過TLR2、TLR4抗體抑制BD2的生成，同樣降低了MSCs的抑菌作用[20,32]。

2.6 MSCs線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)作用 MSCs能夠恢復(fù)上皮細(xì)胞線粒體功能。研究表明，MSCs能夠通過MSCs和上皮細(xì)胞間connexin- 43-gap連接蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)線粒體到損傷的上皮細(xì)胞，為上皮細(xì)胞提供ATP，增加Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分泌肺泡表面活性物質(zhì)表達(dá)，減輕肺損傷。MSCs還能通過形成納米管道將線粒體轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞，從而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞氧化磷酸化和吞噬功能。

3 MSCs治療ADRS的實驗研究及優(yōu)化治療策略

大量的動物實驗表明，MSCs對肺損傷有治療作用，盡管MSCs的來源、劑量、時間、給與方式存在不同，但均減輕了肺損傷[35-40]。多數(shù)研究表現(xiàn)為MSCs降低了炎性反應(yīng)、肺水腫、膠原沉積，改善了肺部組織學(xué)損傷，保護(hù)了內(nèi)皮屏障功能；在分子水平，MSCs促進(jìn)ARDS模型抗炎細(xì)胞因子生成；在細(xì)胞水平，MSCs增強(qiáng)了Treg細(xì)胞反應(yīng)，增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞吞噬活性，降低了中性粒細(xì)胞數(shù)量。盡管MSCs治療肺損傷取得了重要進(jìn)展，但仍需要進(jìn)一步研究以闡明MSCs最佳來源和劑量、給藥途徑和頻率等一些未解決的問題。并且在多數(shù)實驗方案中，MSCs是在疾病誘導(dǎo)之前、同時或之后短時間內(nèi)施用，這些模型沒有考慮到肺部和遠(yuǎn)端器官損傷的時程，可能與臨床情況存在差異性。

如何進(jìn)一步優(yōu)化MSCs療效是研究的重點(diǎn)。目前研究主要集中在基因修飾、預(yù)處理等方面提高M(jìn)SCs治療ARDS潛力?；蛐揎棽粌H增強(qiáng)了MSCs向損傷部位遷移、促進(jìn)組織修復(fù)的內(nèi)在能力，而且提高了其在惡劣微環(huán)境中的生存能力。目前報道的候選基因有CXCR4、EP2、HO-1、ACE2、HGF、sST2、IL-10、KGF等[41]。如病毒轉(zhuǎn)染MSCs使其高表達(dá)sST2,降低了中性粒細(xì)胞數(shù)量，降低了肺泡灌洗液促炎因子IL-6、TNF-α濃度，增強(qiáng)了MSCs抗炎作用[42]；過表達(dá)KGF的MSCs改善了肺微血管通透性，降低了LPS引起的肺損傷[15]；過表達(dá)VEGF的MSCs抑制了內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，降低內(nèi)皮屏障通透性，改善了肺水腫[18]。用TLR3配體poly(I:C)預(yù)處理MSCs，抑制了MSCs miR-143的表達(dá)并增加了COX2的表達(dá)，從而增加PGE2產(chǎn)生和巨噬細(xì)胞抗炎效果[43]。預(yù)處理MSCs方法包括低氧、ARDS患者來源的血漿、N-乙酰半胱氨酸、TGF-β1預(yù)處理及MSCs三維培養(yǎng)等，通過改善MSCs的微環(huán)境來增強(qiáng)MSCs的抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等療效[41]。除了通過基因修飾和預(yù)處理外，也可通過選擇5代以內(nèi)MSCs及調(diào)整肺微環(huán)境來優(yōu)化MSCs的治療。

4 MSCs治療ADRS的臨床研究及療效影響因素

目前報道有3項已完成的MSCs治療ARDS的臨床試驗。一項單中心隨機(jī)雙盲的Ⅰ期臨床試驗報道了靜脈注射同種異體脂肪來源的MSCs(1×106/kg)治療ARDS的安全性(無致瘤性)[44]，但與對照組相比，在住院時間、呼吸機(jī)使用時間及ICU入住時間上沒有明顯差異。另一項多中心的Ⅰ期臨床試驗報道了不同劑量(1×106、5×106、10 ×106/kg)骨髓來源MSCs治療ARDS的安全性[45]，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的Ⅱa期臨床試驗表明MSCs(10×106/kg)改善了ARDS患者的氧合指數(shù)[46]。一項病例報告報道了2例重癥難治ARDS患者接受骨髓源性MSCs(2×106/kg)治療后，呼吸窘迫、血流動力學(xué)紊亂、多器官衰竭等方面均有改善，可能與血液中炎性標(biāo)志物的減少有關(guān)[47]。有研究報道月經(jīng)血源性MSCs的移植可降低H7N9病毒誘發(fā)ARDS患者的病死率，5年隨訪期內(nèi)沒有不良反應(yīng)發(fā)生[48]。中國臨床試驗注冊中心注冊了10項關(guān)于MSCs移植治療COVID-19、ARDS患者有效性和安全性的研究。其中一項研究表明，移植人類臍帶衍生的MSCs改善了1例65歲女性COVID-19患者病情[49]，另一項研究報道了7例COVID-19患者(1例危重癥，4例重癥，2例輕癥)，接受MSCs靜脈注射后肺功能和癥狀得到明顯改善，在14 d觀察期內(nèi)沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，炎性因子下降，外周血淋巴細(xì)胞回升[50]。MSCs治療ARDS的療效需要更多臨床研究來評估。

MSCs來源、給藥途徑、最佳劑量等是影響MSCs療效的重要因素。MSCs可來源于骨髓、脂肪、臍帶、羊膜、胎兒血、月經(jīng)血等，不同來源的 MSCs 在增殖速度、分泌細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)能力上存在差異，即使同種來源，不同個體之間的MSCs也出現(xiàn)功能上的異質(zhì)性。臍帶和羊膜來源的MSCs增殖能力上具有明顯的優(yōu)勢，脂肪和骨髓次之；免疫調(diào)節(jié)能力方面，臍帶、羊膜和脂肪來源的MSCs優(yōu)于骨髓MSCs，而胎盤MSCs的免疫調(diào)節(jié)能力最差；分泌細(xì)胞因子譜方面，臍帶MSCs分泌細(xì)胞生長因子的總量明顯高于骨髓MSCs，但是不同來源的分泌細(xì)胞因子譜有明顯的特點(diǎn)。靜脈注射是MSCs移植最常用和簡單的途徑。由于肺部血管系統(tǒng)特性，靜脈注射最大的弊端就是肺部能清除大量MSCs，造成趨化到損傷部位發(fā)揮治療作用的MSCs數(shù)量減少。健康和疾病狀態(tài)下，MSCs在體內(nèi)的代謝動力學(xué)有差異，低氧環(huán)境可以增加MSCs在肺部滯留。MSCs治療ARDS的最佳劑量，目前并沒有形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，這與MSCs不符合傳統(tǒng)藥物典型的分布和代謝模型有關(guān)。目前的臨床研究中，靜脈注射MSCs的劑量范圍相對穩(wěn)定，集中在1×106～10×106/kg。未經(jīng)體外擴(kuò)增的MSCs細(xì)胞本身安全無害，體外擴(kuò)增最大風(fēng)險在于基因突變，骨髓MSCs體外培養(yǎng)至30代時出現(xiàn)染色體異常，臍帶MSCs體外培養(yǎng)至18代就出現(xiàn)了基因突變，同時隨著體外增殖代數(shù)增加，MSCs增殖活性、分泌細(xì)胞因子能力都在降低。目前認(rèn)為5代以內(nèi)的MSCs增殖能力、旁分泌信號通路、分化潛能和DNA穩(wěn)定性均維持在較好的狀態(tài)[41]。

5 小 結(jié)

MSCs對ARDS治療作用是通過抗炎、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)內(nèi)皮及上皮細(xì)胞修復(fù)、增強(qiáng)微生物及肺泡液清除等生物過程來實現(xiàn)，可能涉及多條復(fù)雜的信號通路。MSCs最佳來源和劑量，給藥途徑尚未形成統(tǒng)一、規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)。Ⅰ、Ⅱa期臨床試驗的MSCs安全性結(jié)果令人鼓舞，但有效性需大規(guī)模臨床試驗來評估。