微RNA在皮膚鱗狀細胞癌中的作用研究進展

李智，呂建建

(青島市市立醫(yī)院皮膚科，山東 青島 266000)

皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC)是常見的皮膚惡性腫瘤之一，是一種源于表皮角質(zhì)形成細胞的腫瘤。隨著我國人口老齡化的加劇，其發(fā)病率逐年升高[1-2]。CSCC主要表現(xiàn)為面、頸、手背等曝光部位皮膚表面紅斑或丘疹性病變，常有鱗狀鱗屑或結(jié)痂現(xiàn)象，大部分CSCC經(jīng)手術(shù)切除可得到徹底治療，但低分化以及腫瘤直徑>2 cm、深度>2 mm的CSCC易復發(fā)和轉(zhuǎn)移[3]。既往研究顯示，紫外線照射、化學致癌物、人乳頭瘤病毒感染以及基礎皮膚病等是CSCC的危險因素[4]，但具體發(fā)病機制較為復雜。陸曉鷗等[5]基于GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫進行CSCC基因表達及信號轉(zhuǎn)導通路的生物信息學分析研究顯示，基因芯片數(shù)據(jù)中共有894個差異基因，包括438個上調(diào)基因和456個下調(diào)基因?；虮倔w論分析顯示，上調(diào)基因主要富集的生物進程包括有絲分裂細胞周期過程、染色體分離、有絲分裂核分裂，下調(diào)基因主要包括表皮發(fā)育、角質(zhì)形成細胞分化、表皮細胞分化；而京都基因和基因組百科全書路徑分析顯示，上調(diào)基因主要富集的信號轉(zhuǎn)導通路為DNA復制、細胞周期、錯配修復，下調(diào)基因為促分裂原活化的蛋白激酶信號通路、Notch信號通路和背腹軸的形成[5]。進一步研究顯示，微RNA(microRNA，miRNA)的異常表達也與CSCC的臨床表現(xiàn)及病理學特征相關(guān)，在細胞增殖、分化和凋亡中起重要作用[6-8]?，F(xiàn)通過回顧既往關(guān)于CSCC miRNA表達譜和miRNA作用機制的研究，探索miRNA在CSCC增殖、遷移及侵襲過程中的作用。

1 miRNA概述

1993年，Lee等[9]在秀麗新小桿線蟲中發(fā)現(xiàn)了第1個miRNA——lin-4，lin-4通過與靶基因RNA 3′非編碼區(qū)結(jié)合負調(diào)控lin-14信使RNA(messenger RNA，mRNA)的表達，導致lin-14蛋白水平下降；同時發(fā)現(xiàn)，lin-4突變導致功能喪失與基因突變獲得功能的編碼蛋白基因lin-14引起的效應一致，均能導致蠕蟲發(fā)育時序混亂，因此推測lin-4是一種能階段性調(diào)控胚胎發(fā)育的基因[10]。隨后發(fā)現(xiàn)了大量由19～23個核苷酸組成的類似內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，統(tǒng)稱為miRNA[11]。miRNA的體內(nèi)合成是一個多步驟過程。在細胞核內(nèi)，RNA聚合酶Ⅱ?qū)iRNA編碼基因轉(zhuǎn)錄為具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，然后miRNA初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被RNase Ⅲ內(nèi)切酶Drosha和雙鏈RNA特異性結(jié)合蛋白迪喬治綜合征危象區(qū)基因8加工為具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的前體miRNA；接下來，輸出蛋白5將前體miRNA轉(zhuǎn)運出細胞核后被細胞質(zhì)中的RNaseⅢ內(nèi)切酶Dicer剪接成雙鏈miRNA(即miRNA*復合體)；雙鏈分離后，miRNA*被降解或參與調(diào)節(jié)miRNA的穩(wěn)定性，而另一條單鏈作為成熟的miRNA形成RNA誘導沉默復合物[11]。RNA誘導沉默復合物與靶基因mRNA進行完全或不完全互補配對，導致mRNA降解(完全配對)或翻譯抑制(不完全配對)，以實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達調(diào)控[11]。

迄今為止，人體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)1 000多種miRNA，占人類基因組的1%，每個miRNA均可能有數(shù)百個靶點，調(diào)控人體內(nèi)超過30%基因的表達，在早期發(fā)育、細胞增殖、分化和凋亡以及造血等正常生理過程中發(fā)揮調(diào)控作用[11-13]。此外，miRNA的表達異?？赡芘c腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[14]，可作為診斷、治療以及評價腫瘤預后等方面的生物學標志物[15]。

2 miRNA在CSCC中的表達情況

為探索miRNA在CSCC發(fā)病機制中的作用，眾多研究對CSCC癌組織中miRNA的表達情況與癌旁組織、健康皮膚組織、皮膚病組織進行比較發(fā)現(xiàn)，miR-21、miR-31[16]、miR-99a/100、miR-205、miR-221[17]、miR-365等在癌組織中的表達上調(diào)，而miR-20a[18]、miR-34a、miR-124、miR-124/214、miR-125b[19]、miR-155、miR-148[20]、miR-193b/365a、miR-199a、miR-203、miR-361-5p、miR-375、miR-483-3p、miR-497[21]、miR-3619-5p[22]等在癌旁正常組織中表達上調(diào)[23]。以上表達譜提示，miRNA在CSCC的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用，而且可能通過調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因的表達發(fā)揮雙重作用，一方面可以促進癌變，另一方面也可以抑制腫瘤細胞的增殖和遷移[24]。

3 miRNA在CSCC增殖、遷移和侵襲中的雙重調(diào)控作用

癌細胞的大量增殖是癌癥發(fā)生的初始階段，而大量增殖的癌細胞需要占用大量的營養(yǎng)供給，從而影響正常組織的能量供給。同時，癌細胞還會代替相關(guān)部位的正常細胞，導致正常細胞功能缺失。此外，增殖的癌細胞形成腫塊會壓迫周圍器官和組織，造成周圍臟器缺血缺氧。細胞遷移和侵襲是腫瘤癌變轉(zhuǎn)移的最關(guān)鍵步驟，細胞在接收到內(nèi)源和外源性遷移信號后通過胞體形變進行定向移動，腫瘤細胞經(jīng)血管基膜穿入深面間質(zhì)后侵襲組織和轉(zhuǎn)移至遠處。因此，miRNA可能在CSCC的增殖、遷移和侵襲過程中發(fā)揮雙重調(diào)控作用。

3.1促進CSCC的miRNA miR-31是CSCC表達譜中上調(diào)最明顯的miRNA之一，具有多個靶基因，參與細胞周期、DNA修復、代謝、細胞凋亡、趨化因子信號通路和化學抵抗性[25]。Wang等[16]將CSCC與光化性角化病皮膚、健康皮膚進行比較發(fā)現(xiàn)，CSCC中miR-31過表達；在CSCC細胞系(UT-SCC-7細胞)中，抑制miR-31表達會顯著降低UT-SCC-7細胞的轉(zhuǎn)移和集落形成能力，提示miR-31在CSCC進展過程中主要通過促進癌細胞遷移和侵襲發(fā)揮作用。Lin等[26]發(fā)現(xiàn)，Rho相關(guān)結(jié)構(gòu)域BTB蛋白質(zhì)1也是miR-31的直接靶基因，而Rho相關(guān)結(jié)構(gòu)域BTB蛋白質(zhì)1是小GTPase的Rho家族成員，是一種腫瘤抑制因子。通過干擾小RNA沉默或敲低A-431細胞系發(fā)現(xiàn)，miR-31可通過抑制Rho相關(guān)結(jié)構(gòu)域BTB蛋白質(zhì)1的表達誘導細胞增殖和侵襲。以上研究均提示了miR-31在CSCC調(diào)控中的重要作用。

miR-205在腫瘤中的表達上調(diào)，并與結(jié)締組織增生、神經(jīng)周圍浸潤和浸潤性生長方式等相關(guān)[27]。Caueto等[28]在成熟鼠類CSCC細胞系中發(fā)現(xiàn)，miR-205主要在腫瘤的未分化區(qū)域和侵襲前沿表達，提示miR-205可能與局部復發(fā)和進化緩慢的臨床事件的發(fā)展有關(guān)。Stojadinovic等[29]也觀察到侵襲性CSCC中miR-205的表達較原位CSCC顯著增加，且侵襲性CSCC中miR-205的靶基因(如髓性熱帶病毒整合位點1同源物、賴氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶2B和博來霉素水解酶重組蛋白)水平明顯下調(diào)。表明miR-205及其靶基因可作為CSCC的預后標志物。

miR-221在腫瘤的起始和進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括調(diào)控增殖信號通路，避免腫瘤因子導致的細胞死亡，監(jiān)測血管生成，甚至支持上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[30]。Gong等[17]發(fā)現(xiàn)，CSCC癌組織中miR-221的表達上調(diào)，對miR-221進行模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)，miR-221的上調(diào)顯著促進了細胞增殖，而下調(diào)的miR-221則抑制了癌細胞的增殖；熒光素酶活性測定技術(shù)發(fā)現(xiàn)，miR-221直接靶向人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten gene，PTEN)，CSCC組織中miR-221和PTEN信使RNA的表達呈負相關(guān)，miR-221下調(diào)可通過靶向結(jié)合PTEN抑制細胞增殖。PTEN蛋白是最經(jīng)典的腫瘤抑制因子，通過磷酸酰胺肌醇的去磷酸化，導致驅(qū)動腫瘤發(fā)生的磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號過度激活。通過敲低miR-221可引起磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B途徑表達減少，PTEN蛋白表達增加，從而導致腫瘤發(fā)生[17]，為腫瘤治療提供了新途徑。

miR-365在CSCC患者中的表達上調(diào)，可能具有促進CSCC發(fā)生發(fā)展的作用。Zhou等[31]證實，Bcl-2相關(guān)X蛋白是miR-365的直接靶點，CSCC中miR-365上調(diào)引起B(yǎng)cl-2相關(guān)X蛋白消耗，進而促進腫瘤生長，增強腫瘤的增殖、遷移、侵襲以及對細胞凋亡的抵抗力。同時，miR-365還可靶向核因子I/B對細胞周期蛋白依賴性激酶6和細胞周期蛋白依賴性激酶4的轉(zhuǎn)錄抑制作用，進而抑制CSCC進展[32]。此外，使用miR-365拮抗劑抑制miR-365可抑制體內(nèi)皮膚腫瘤形成，促使G1期阻滯和癌細胞凋亡[33]。因此，miR-365可能是CSCC治療的新靶點。

miR-506對許多生物反應的發(fā)生起至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，不僅影響細胞增殖，還對細胞分化、遷移和侵襲有顯著的調(diào)控作用。miR-506在許多不同類型的癌癥中發(fā)揮作用，如在肝癌中抑制細胞增殖和腫瘤生長[34]，在宮頸癌中抑制癌細胞增殖[35]，在胃癌中抑制癌細胞的遷移侵襲和血管生成[36]。但有關(guān)miR-506參與CSCC的報道較少。Zhou等[37]發(fā)現(xiàn)，miR-506的表達在CSCC組織和細胞中顯著上調(diào)，而下調(diào)miR-506則導致腫瘤發(fā)生受抑制；進一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-506抑制劑的CSCC系細胞增殖速率降低，且p65和層粘連蛋白γ1的水平顯著升高。p65(核因子κB)信號通路啟動抗凋亡，而凋亡是抑制腫瘤異常生長的重要保護途徑，因此miR-506的異常表達可能干擾了核因子κB信號通路的凋亡過程。層粘連蛋白γ1屬于層粘連蛋白家族的癌基因，調(diào)控著細胞的轉(zhuǎn)移、信號轉(zhuǎn)導、分化和黏附，其過表達與腫瘤細胞的侵襲、遷移特性增強以及不良預后相關(guān)[38-39]。

3.2抑制CSCC的miRNA miR-15b作為miR-15家族的重要成員，雖然并未發(fā)現(xiàn)其在CSCC中異常表達，但miR-15b的抑癌作用可能成為CSCC的潛在治療靶標。Zhang等[40]研究發(fā)現(xiàn)，miR-15b轉(zhuǎn)染會顯著降低SCL-1細胞的活力、誘導細胞凋亡并減少細胞中生存蛋白信使RNA的表達。生存蛋白是凋亡相關(guān)蛋白的重要成員之一，具有促進癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移的作用，而miR-15b轉(zhuǎn)染會導致生存蛋白表達下調(diào)，從而抑制癌細胞轉(zhuǎn)移。

miR-20a在不同腫瘤中的作用不一致，在結(jié)直腸癌、涎腺腺樣囊性癌、膽囊癌、胃癌、肺泡橫紋肌肉瘤等腫瘤中miR-20a的表達明顯增加，而在乳腺癌、CSCC、肝細胞癌、口腔鱗狀細胞癌和上皮性卵巢癌中，miR-20a的表達顯著減少[41]。Zhou等[18]對miR-20a在CSCC中的作用進行研究發(fā)現(xiàn)，miR-20a直接作用于LIM激酶1，使CSCC細胞生長速度減緩并抑制遷移。LIM激酶1參與許多涉及細胞骨架的生物學過程，如神經(jīng)突起生長、胚胎生長、血栓形成、記憶形成等，可能是乳腺癌、卵巢癌、骨肉瘤轉(zhuǎn)移的促進劑[18]。但也有研究持不同意見，認為miR-20a的低表達與不良預后有關(guān)。Zhang等[42]研究發(fā)現(xiàn)，miR-20a低表達患者的總體生存率明顯低于miR-20a高表達者。因此，miR-20a的確切作用仍需進一步驗證。

miR-124和miR-214與多種腫瘤相關(guān)，其中miR-124主要與胃腸道腫瘤相關(guān)[43]，而miR-214[44]主要與皮膚癌相關(guān)，其作用機制可能與胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)水平有關(guān)，ERK1的表達水平受miR-214影響，ERK2則受miR-124和miR-214的影響。研究顯示，Ⅱ/Ⅲ期CSCC患者miR-124和miR-214的表達下調(diào)，而CSCC細胞系中ERK1/2蛋白水平升高[45]。因此，miR-124/214及其靶基因ERK1/2的水平很可能是CSCC發(fā)生發(fā)展的原因之一。

在腫瘤中有很多已知的靶基因，包括Bcl-2、基質(zhì)金屬蛋白酶13、細胞周期蛋白依賴性激酶、人胰島素樣生長因子1受體以及表皮生長因子受體2/3[5]。Xu等[19]發(fā)現(xiàn)，miR-125b在CSCC組織中下調(diào)，且miR-125b與基質(zhì)金屬蛋白酶13的表達水平呈負相關(guān)，提示基質(zhì)金屬蛋白酶13可能是miR-125b在CSCC中發(fā)揮作用的直接靶點。此外，miR-125b還可能通過靶向信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3通路在CSCC中起腫瘤抑制作用[45]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PICSAR基因敲除通過上調(diào)miR-125b和下調(diào)Yes相關(guān)蛋白1抑制CSCC腫瘤生長[46]。

miR-148a可通過調(diào)整細胞周期發(fā)揮抑制細胞增長的作用，同時還可抑制CSCC細胞的遷移和侵襲。Luo等[20]發(fā)現(xiàn)，miR-148a通過下調(diào)促分裂原活化的蛋白激酶激酶4和9兩個靶基因的表達，抑制CSCC細胞系(A431和SCL-1)細胞增殖，并降低兩種細胞的集落形成率；蛋白質(zhì)印跡法顯示，miR-148a抑制了SCL-1細胞的遷移和侵襲，從而對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起抑制作用。

miR-193b是表皮細胞中表達較豐富的miRNA，在腫瘤發(fā)生中起抑制作用。既往研究顯示，miR-193b可抑制黑色素瘤、乳腺癌等多個腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和存活[47-48]。Gastaldi等[49]在小鼠表皮鱗狀細胞癌中發(fā)現(xiàn)，miR-193b的異位表達有抑癌作用，且KRAS和MAX是miR-193b的直接靶目標。

miR-199a前體產(chǎn)生成熟的miR-199a-5p和miR-199a-3p，它們與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、心肌細胞保護以及骨骼形成有關(guān)，其中miR-199a-5p在CSCC中低表達，其抑癌機制可能與靶向有絲分裂分子有關(guān)[50]。Kim等[51]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a-5p的過表達抑制了皮膚角質(zhì)形成細胞的遷移能力，其可能通過調(diào)節(jié)基底細胞附著分子、卷曲同源物6和盤狀結(jié)構(gòu)域受體酪氨酸激酶1靶基因的表達抑制癌細胞的侵襲，發(fā)揮抑癌作用。Lu等[52]還發(fā)現(xiàn)，miR-199a-5p通過沉默信息調(diào)節(jié)因子1/CD44胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域信號通路影響細胞的遷移能力和致瘤性，從而調(diào)節(jié)CSCC的進展。這幾種靶基因的發(fā)現(xiàn)解釋了miR-199a-5p在CSCC發(fā)病機制中的作用，也為CSCC的治療提供了依據(jù)。

原發(fā)性CSCC中，miR-203的表達可能與良好預后相關(guān)，其主要存在于分化良好的區(qū)域[28]。Ting等[53]的研究表明，miR-203過表達可抑制CSCC細胞系(SCL-1)細胞的增殖、侵襲和遷移，同時加速細胞凋亡，這主要與胞質(zhì)分裂調(diào)控蛋白1和Wnt/β聯(lián)蛋白信號通路有關(guān)。Lohcharoenkal等[54]發(fā)現(xiàn)，c-MYC基因是miR-203的一個直接靶點，而c-MYC可促進細胞增殖，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。在CSCC中，c-MYC的過表達逆轉(zhuǎn)了miR-203誘導的生長停滯，提示恢復miR-203表達可抑制c-MYC導致的過度增殖，并為miR-203在CSCC中作為預后指標提供依據(jù)。

癌組織的生長需要形成大量血管以汲取營養(yǎng)物質(zhì)，而血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)是大部分腫瘤中最主要的血管生成因子，其高表達可能與腫瘤血管生成增加相關(guān)[55]。Kanitz等[56]研究發(fā)現(xiàn)，VEGFA與miR-361-5p的表達水平呈負相關(guān)，CSCC樣本中miR-361-5p的水平顯著低于健康皮膚樣本。miR-361-5p可通過調(diào)控皮膚上皮細胞與內(nèi)皮細胞之間VEGFA的穩(wěn)定表達發(fā)揮抑制血管生成的作用，從而抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。VEGFA是miR-361-5p的第1個靶基因，這為靶基因治療CSCC在臨床中的應用提供了重要線索。

miR-497通過調(diào)整細胞周期發(fā)揮抑制細胞增長的作用。Wei等[21]研究發(fā)現(xiàn)，CSCC組織和細胞系中miR-497的表達水平明顯低于正常組織細胞；miR-497過表達使CSCC細胞系細胞(A431和HSC-5)G0/G1期時間顯著延長，而S期顯著縮短，表現(xiàn)為細胞周期停滯；雙重熒光素酶報告基因鑒定發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AN114A2很可能就是miR-497的直接靶基因[21]。但Mizrahi等[7]發(fā)現(xiàn)，miR-497的表達在角質(zhì)形成細胞惡化進程中呈進行性增加，能夠誘導上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變，且熒光素實驗證明纖溶酶原激活因子抑制因子型1是miR-497的靶點。因此，miR-497在CSCC中的作用仍需更多研究證明。

miR-3619-5p在人類惡性腫瘤中具有抑制腫瘤的作用，但其在CSCC進程中的生物學功能仍不清楚。Zhang等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，與正常細胞相比，對順鉑耐藥CSCC細胞中miR-3619-5p的表達明顯下調(diào)。使用miR-3619-5抑制劑敲除CSCC細胞系(A431和HSC-5)中miR-3619-5p的表達促進了親代癌細胞的增殖，這主要是通過調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運蛋白亞基4引發(fā)了CSCC的抑癌活性以及對順鉑的耐藥性[57]。

4 小 結(jié)

CSCC是繼黑色素細胞癌之后最常見的皮膚癌癥之一，確診率不斷升高。miRNA作為人體基因表達調(diào)控的重要工具，越來越受到醫(yī)學研究者的重視，其表達可對與疾病相關(guān)的多種細胞過程產(chǎn)生影響，特別是在致癌和抑癌過程中的作用。目前關(guān)于miRNA與CSCC的相關(guān)研究較少，其作為生物標志物用于診斷、治療靶點以及預測預后還存在很多問題，但不可否認miRNA為探索腫瘤發(fā)生機制提供了新的突破點。未來需要繼續(xù)深入研究與CSCC相關(guān)的miRNA及靶基因，通過改變miRNA的水平以及靶基因調(diào)控CSCC細胞的增殖、遷移和侵襲，從而預防和治療CSCC，進而改善患者的生活質(zhì)量。