喉返神經(jīng)損傷基因治療的研究進展

李浩，代文杰

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院甲狀腺外科，哈爾濱 150001)

喉返神經(jīng)是第10對腦神經(jīng)迷走神經(jīng)的分支之一[1]，喉返神經(jīng)損傷是甲狀腺手術(shù)的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，單側(cè)喉返神經(jīng)損傷會造成聲音嘶啞，雙側(cè)損傷會造成呼吸困難甚至窒息[2-3]。由于左側(cè)喉返神經(jīng)走行較長，喉返神經(jīng)損傷發(fā)生率較右側(cè)高1倍左右[4-6]。據(jù)統(tǒng)計，甲狀腺術(shù)后暫時性和永久性喉返神經(jīng)損傷的發(fā)生率≤11%,一旦損傷將給患者身體及心理造成巨大傷害[7]。通常喉返神經(jīng)損傷由術(shù)中操作不當(dāng)、頸部惡性腫瘤侵襲、氣管插管等造成[4]，其中手術(shù)誤傷是喉返神經(jīng)受損的主要原因之一，損傷方式包括結(jié)扎、鉗夾、離斷、能量器械損傷等[8]。如果術(shù)中發(fā)生神經(jīng)離斷可以通過喉返神經(jīng)重建術(shù)修復(fù)，但由于術(shù)后喉部運動功能的恢復(fù)效果不明顯，這一處理方式很少被大眾接受[9]。

基因治療在周圍神經(jīng)損傷治療中具有廣闊的應(yīng)用前景，它是一種通過單次給藥在一定時間內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因并產(chǎn)生治療蛋白的藥物傳遞系統(tǒng)[10]。研究顯示，可通過建立病毒載體將目的基因傳遞給運動神經(jīng)元及周圍神經(jīng)元的施萬細(xì)胞，從而實現(xiàn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，一些神經(jīng)營養(yǎng)因子和生長因子可能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生保護作用[11]?，F(xiàn)就基因治療在喉返神經(jīng)領(lǐng)域的研究進展予以綜述。

1 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法

喉返神經(jīng)基因治療的第一步是轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的確認(rèn)，目前報道中用作載體的有腺相關(guān)病毒載體(adeno-associated viral vector，AAV)、腺病毒載體(adeno viral vector，AdV)、肌肉特異性非病毒載體、質(zhì)粒、仙臺病毒；第二步是明確治療對象，即保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的運動神經(jīng)元，促進神經(jīng)軸突再生，保護喉肌的運動終板，防止喉肌萎縮[11]。

1.1喉返神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng) 基因治療的靶點包括喉返神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，攜帶治療基因的病毒載體可通過注射進入喉返神經(jīng)中再傳遞至中樞神經(jīng)，目前基因治療常用載體是AAV，該載體在目前所發(fā)現(xiàn)的載體中安全性最好。Rubin等[12]向喉返神經(jīng)注射重組AAV擴散報告基因，并在大鼠腦干內(nèi)成功檢測到表達基因；此外原位雜交實驗顯示，大鼠腦干內(nèi)存在病毒DNA[13]，說明病毒和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物均可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)逆突觸運輸。

有研究將腺病毒用于神經(jīng)系統(tǒng)的基因治療，但有部分學(xué)者認(rèn)為腺病毒具有毒性會產(chǎn)生免疫反應(yīng)而不推薦用作載體[14-15]。此外，Rubin等[16]研究發(fā)現(xiàn)，將AdV注射到喉返神經(jīng)中不會造成明顯的額外神經(jīng)元損傷，注射后1周在大腦疑核檢測到轉(zhuǎn)入基因的表達；Araki等[17]在同一模型中驗證了基因通過逆向轉(zhuǎn)運在大腦中表達。

1.2喉肌和聲帶黏膜 喉肌和聲帶黏膜是基因治療的另外兩個靶點，將治療基因?qū)牒砑?，可產(chǎn)生肌營養(yǎng)和神經(jīng)營養(yǎng)作用，防止喉返神經(jīng)損傷后肌肉萎縮，并可以保護運動終板。有研究利用高水平的肌肉特異性基因表達載體將報告基因(LacZ)和治療基因[胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)]導(dǎo)入大鼠的癱瘓喉肌，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測發(fā)現(xiàn)，治療組81.3%(13/16)的大鼠在注射4周后檢測到治療基因編碼的mRNA，說明治療基因通過喉肌運輸成功，單次、延遲注射運載體可能產(chǎn)生更好的神經(jīng)恢復(fù)效果[18]。此外，電穿孔基因即質(zhì)粒傳遞，也可作為一種新的喉肌基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，并且該方法具有轉(zhuǎn)染率高、組織損傷小的優(yōu)點[19]。

仙臺病毒是副黏病毒家族的一員，是一種具有非片段、負(fù)義RNA基因組的包膜病毒，仙臺病毒載體具有對人無致病性、能有效地感染氣道上皮細(xì)胞的特點[20]，仙臺病毒載體可以攜帶至少5 000個堿基量的基因，并且僅需小于5 min的載體細(xì)胞接觸時間就能將基因?qū)爰?xì)胞。Mizokami等[21]研究了仙臺病毒載體對喉肌和氣管上皮的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，發(fā)現(xiàn)在正常氣管上皮中，噴霧吸入法優(yōu)于注射法，前者報告基因的表達更加顯著且持久，吸入法的發(fā)現(xiàn)為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了一條新的途徑。

2 喉返神經(jīng)損傷的基因治療

喉返神經(jīng)的基因治療與神經(jīng)營養(yǎng)因子和生長因子密切相關(guān)，其中包括神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)、成纖維細(xì)胞生長因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、血管內(nèi)皮生長因子以及IGF-1[22]，它們具有促進周圍神經(jīng)纖維再生的作用，其中前3種因子在神經(jīng)修補中顯示出較強的促進軸突增長作用[23]。

2.1喉肌萎縮的預(yù)防 喉返神經(jīng)損傷后，喉肌失去神經(jīng)支配，容易發(fā)生萎縮，因此神經(jīng)修復(fù)前預(yù)防喉肌萎縮尤為重要。Shiotani等[24]建立了大鼠喉麻痹模型，將含有IGF-1基因的肌肉特異性非病毒載體注入成年大鼠的癱瘓喉肌，單次注射28 d后，與對照組大鼠(相同部位注入等量0.9%氯化鈉注射液)比較，轉(zhuǎn)染IGF-1的大鼠肌纖維直徑、運動終板長度和神經(jīng)相關(guān)終板的百分比顯著增加，Gugatschka等[25]的研究也得出相同的結(jié)論；另有研究對IGF-1基因轉(zhuǎn)移后的肌球蛋白重鏈組成進行分析發(fā)現(xiàn)，失神經(jīng)支配喉肌的ⅡA/X型肌球蛋白重鏈?zhǔn)艿揭种?，而ⅡL型肌球蛋白重鏈表達升高，從而使喉肌的肌球蛋白重鏈組成正?；痆26]。對比單次和多次注射后效果發(fā)現(xiàn)，多次注射動物IGF-1的mRNA基因表達率高于單次注射(100%比81%)，但兩者生物反應(yīng)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義[17]。IGF通過修復(fù)喉肌肌球蛋白重鏈組成預(yù)防喉肌萎縮。

在臨床中喉返神經(jīng)損傷的治療并不一定在發(fā)生后即刻進行，由于喉返神經(jīng)存在自主恢復(fù)的可能，一般需要觀察等待幾周至幾個月，而上述實驗中的動物均是在喉返神經(jīng)受到損傷后立即接受治療，為了觀察兩者間的差別，有研究對損傷后立即治療的大鼠和延遲30 d治療的大鼠進行比較，發(fā)現(xiàn)單次延遲的IGF-1肌內(nèi)注射可以更好地促進肌肉再神經(jīng)支配[18]。

2.2中樞神經(jīng)系統(tǒng)運動神經(jīng)元丟失的預(yù)防 喉麻痹治療中的一個主要問題是疑核運動神經(jīng)元的丟失，疑核運動神經(jīng)是控制喉返神經(jīng)運動的中樞，運動神經(jīng)元喪失將造成不可逆性損傷。為了評估基因治療對迷走神經(jīng)及喉返神經(jīng)損傷后運動神經(jīng)元損傷逆轉(zhuǎn)的潛力，Hernandez-Morato 等[27]驗證了編碼GDNF的AdV對疑核神經(jīng)元損傷成年大鼠的保護作用，通過迷走神經(jīng)撕脫模型模擬疑核運動神經(jīng)元萎縮和丟失，發(fā)現(xiàn)接種治療載體可防止疑核內(nèi)受損運動神經(jīng)元的丟失，改善乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶的免疫反應(yīng)，阻止受損神經(jīng)中的一氧化氮合酶發(fā)揮作用。Moro等[28]在同一動物模型中證實了腺病毒轉(zhuǎn)運BDNF和(或)GDNF對神經(jīng)的作用，與對照組(人為破壞神經(jīng)后不進行基因治療)相比，BDNF或GDNF治療后能顯著預(yù)防運動神經(jīng)元的丟失，BDNF的保護作用大于GDNF，并且BDNF與GDNF聯(lián)合治療具有協(xié)同作用，與BDNF或GDNF單獨治療相比，疑核內(nèi)的運動神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，受損神經(jīng)內(nèi)的一氧化氮合酶也受到抑制，表明腺病毒介導(dǎo)的BDNF和(或)GDNF基因轉(zhuǎn)移可預(yù)防迷走神經(jīng)損傷或喉返神經(jīng)損傷后運動神經(jīng)元的變性。由此表明，喉返神經(jīng)的損傷修復(fù)與神經(jīng)營養(yǎng)因子密切相關(guān)，通過促進神經(jīng)營養(yǎng)因子基因的表達，使受損神經(jīng)的功能得以恢復(fù)。

2.3神經(jīng)纖維再生與神經(jīng)功能恢復(fù) 喉返神經(jīng)損傷后的另一個主要并發(fā)癥是神經(jīng)纖維變性和再生不良,目前關(guān)于喉返神經(jīng)基因治療后神經(jīng)功能和組織學(xué)恢復(fù)的報道較少。Sakowski等[29]研究發(fā)現(xiàn)，通過腺病毒將GDNF基因直接導(dǎo)入大鼠受鉗夾損傷的喉返神經(jīng)后，受損神經(jīng)的功能和組織學(xué)結(jié)構(gòu)得到恢復(fù)，并且受損喉返神經(jīng)的運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯提高，GDNF治療4周后大鼠的運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度基本恢復(fù)正常，與對照組(注射0.9%氯化鈉注射液)相比，治療后的神經(jīng)軸突直徑更大，受損處的神經(jīng)修復(fù)能力更強。說明GDNF基因轉(zhuǎn)入對喉返神經(jīng)損傷后組織修復(fù)再生和神經(jīng)功能恢復(fù)具有明顯的促進作用。此外，如果術(shù)中損傷迷走神經(jīng)或喉返神經(jīng)，直接將載體注射到神經(jīng)中還可以起到預(yù)防神經(jīng)癱瘓的作用。

另一項研究發(fā)現(xiàn)，喉返神經(jīng)受損后注射編碼鋅指蛋白的AdV(Ad-p65)，可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子表達,從而加速受損神經(jīng)軸突的生長，恢復(fù)聲帶活動性，并保留甲杓肌神經(jīng)的終板功能[30]，多種神經(jīng)生長因子被證實可促進神經(jīng)纖維再生。

2.4喉功能的恢復(fù) 喉返神經(jīng)基因治療的最終目的是恢復(fù)患者的喉部功能，使聲帶運動恢復(fù)正常，并與呼吸、吞咽和發(fā)聲同步。Araki等[17]首次發(fā)現(xiàn)利用基因治療可以恢復(fù)大鼠聲帶運動功能，他們直接將編碼GDNF的AdV注射到喉返神經(jīng)的受損部位，注射后2周發(fā)現(xiàn)聲帶運動功能明顯恢復(fù)。Sakowski等[29]建立了喉返神經(jīng)損傷模型，研究可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子表達的Ad-p65 AdV的效用，注射后7 d與對照組(損傷喉返神經(jīng)后不做任何處理)比較發(fā)現(xiàn)，治療組大鼠聲帶的運動幅度顯著增強，說明基因治療可以加速大鼠喉部聲帶功能的恢復(fù)。Rubin等[30]嘗試運用攜帶鋅指蛋白基因的AAV刺激內(nèi)源性IGF-1生成，注射7 d后發(fā)現(xiàn)實驗組(在受損神經(jīng)處注射攜帶鋅指蛋白的AAV載體)視覺模擬評分高于對照組(在受損神經(jīng)處注射攜帶綠色熒光蛋白的AAV載體)，證實大鼠喉部功能恢復(fù)。

3 基因治療喉返神經(jīng)損傷的未來研究方向

盡管基因治療已被證明對中度喉返神經(jīng)損傷有效，但喉返神經(jīng)損傷治療中還有一個最重要的環(huán)節(jié)有待解決，即神經(jīng)元錯誤定向再生。由于新生的神經(jīng)纖維無法有效辨別之前的高級別神經(jīng)元，會出現(xiàn)新生神經(jīng)纖維之間錯誤連接的情況，雖然部分肌肉功能得到恢復(fù)，但同時也會產(chǎn)生一些神經(jīng)錯誤支配肌肉活動的情況，這為喉部功能的精準(zhǔn)恢復(fù)造成了困擾。喉返神經(jīng)鉗夾損傷模型中聲帶的損傷程度較輕，保留了神經(jīng)的完整性，與神經(jīng)離斷模型相比，受神經(jīng)纖維錯向再生的影響更小[31]。

要實現(xiàn)嚴(yán)重喉返神經(jīng)損傷后聲帶運動功能的恢復(fù)，需要解決神經(jīng)纖維錯向再生的問題。此外，由于聲帶唯一外展肌是環(huán)杓后肌，阻止環(huán)杓后肌軸突再生可增強聲帶的內(nèi)收功能，恢復(fù)聲帶運動[32-33]。研究顯示，神經(jīng)營養(yǎng)因子抗體在喉肌中的表達存在差異，可作為促進喉返神經(jīng)再支配的治療靶點，Hernandez-Morato等[18]報道了抗GDNF抗體對喉返神經(jīng)再神經(jīng)支配的影響,抗GDNF抗體注入環(huán)杓后肌可以影響再神經(jīng)支配模式，并減少聯(lián)合運動，增加功能神經(jīng)的支配。同樣，除神經(jīng)營養(yǎng)因子抗體外，抗癌藥物長春新堿也可以阻止環(huán)杓后肌的神經(jīng)再支配，從而改善喉收肌功能[34]。

聲帶功能恢復(fù)的另一個策略是減少運動神經(jīng)與其他神經(jīng)纖維之間的錯誤定向神經(jīng)再支配，喉返神經(jīng)除感覺和自主神經(jīng)纖維外，還包括運動纖維，運動神經(jīng)纖維與感覺神經(jīng)纖維或自主神經(jīng)纖維之間的錯向連接是導(dǎo)致功能恢復(fù)失敗的主要原因之一。有研究報道，使用一種新型的聚乙醇酸膠原管作為喉返神經(jīng)再生中藥物或載體給藥支架，可將一種抑制感覺軸突擴張的藥物插入該管，然后橋接到喉返神經(jīng)，從而促進聲帶恢復(fù)[35]。

4 問題與展望

在動物喉返神經(jīng)損傷模型中，基因治療在預(yù)防喉肌萎縮和運動神經(jīng)元丟失、保留神經(jīng)終板、再生神經(jīng)纖維、促進神經(jīng)功能恢復(fù)等方面具有重要作用。盡管在這些領(lǐng)域的研究有限，但現(xiàn)有的研究成果值得參考，未來的臨床應(yīng)用前景值得期待。但目前仍存在一些有待解決的問題，如每項研究均采用了不同的動物模型、不同的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法和不同的治療方式，這使得各項研究結(jié)果難以進行橫向比較，因此有必要進行相同試驗條件下的研究，從多種方法和治療方案中找出最佳切實可行的一項：明確最佳的導(dǎo)入基因、建立最優(yōu)質(zhì)的載體、選擇最高效的植入方式，從而促進該治療方式的推廣。

盡管一些報道提到并未發(fā)現(xiàn)基因治療造成的組織學(xué)損傷和免疫反應(yīng)，但并不是沒有任何不良反應(yīng)，相關(guān)方面的調(diào)研還有待完善以及更深入的研究。目前研究已經(jīng)證明了將AAV或AdV傳遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的有效性，但同時也顯示出一定的局限性[13-14]，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重點區(qū)域疑核將受到擴散傳遞的潛在不良影響。腺病毒基因表達的有限時效性可能符合喉返神經(jīng)損傷的特征，其暫時性的基因表達特點更適合于這種短期治療，但是短期轉(zhuǎn)基因表達的機制之一被認(rèn)為是由轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的免疫反應(yīng)產(chǎn)生的，而AdV具有毒性和免疫原性，這也正是部分學(xué)者摒棄AdV的原因，他們不提倡使用這種載體進行轉(zhuǎn)運，因此有必要研發(fā)更加高效、毒副作用更小的載體，為基因治療在安全性方面提供有力的保障。