長鏈非編碼RNA在腰椎間盤退變中的研究進(jìn)展

宋健，詹玉林2,，周小莉，林志康

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201210； 2.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院東院骨科，上海 201210)

腰痛是困擾人類生命健康的最主要的慢性疾病之一。最新發(fā)布的《全球疾病、傷害和風(fēng)險(xiǎn)因素負(fù)擔(dān)研究2017》顯示，以頸、腰痛為主的肌肉骨骼疾病成為“殘疾生活年數(shù)”發(fā)生率最高的病種，這主要與適齡工作人員趨于辦公久坐環(huán)境以及此類疾病少受醫(yī)療政策關(guān)注有關(guān)[1]。慢性腰痛消耗了大量的醫(yī)療資源，不僅給患者和社會(huì)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還留下了諸多疼痛后遺癥(如抑郁、焦慮和睡眠障礙)[2]。一項(xiàng)基于中國南方人群的流行病學(xué)研究顯示，55歲以下的成人90%會(huì)出現(xiàn)腰椎間盤退變(lumbar disc degeneration，LDD)，且患病率隨著年齡的增長而升高，10%的患者因此造成慢性殘疾，LDD與腰痛呈顯著正相關(guān)[3]。LDD是由多因素導(dǎo)致的復(fù)雜病種，主要由體外因素(如不協(xié)調(diào)應(yīng)力負(fù)荷、熬夜工作、伏案久坐、吸煙、肥胖)的長期持續(xù)影響與內(nèi)部機(jī)體易感遺傳因子異常表達(dá)共同導(dǎo)致。LDD的機(jī)制研究主要涉及遺傳信息的差異表達(dá)、調(diào)控信號(hào)通路的細(xì)胞因子所介導(dǎo)的促炎與抗炎過程失衡以及細(xì)胞外基質(zhì)合成代謝與分解代謝的紊亂等。遺傳信息表達(dá)異常又包括增殖、凋亡、衰老、自噬等細(xì)胞活動(dòng)?，F(xiàn)就長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)在LDD中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 LDD與腰痛

椎間盤由三個(gè)結(jié)構(gòu)成分組成：位于中心的軟膠質(zhì)髓核，主要由髓核細(xì)胞組成，分布有豐富的Ⅱ型膠原和蛋白聚糖，保留盤內(nèi)水分，維持椎間盤的彈性；周圍環(huán)繞片層狀的纖維環(huán)，主要由成纖維細(xì)胞組成，內(nèi)含同心鋪層、交錯(cuò)穿梭的張力性Ⅰ型膠原和彈性纖維，維持椎間盤的韌性；上下分別連接兩個(gè)雙層軟骨終板，保持椎間盤的高度和穩(wěn)定，并負(fù)責(zé)吸收從盤外擴(kuò)散的營養(yǎng)與氧氣[4]。椎間盤的各組成部分相互協(xié)作，保證了脊柱的正常彎曲和扭轉(zhuǎn)，并起到緩沖減震的作用。椎間盤是人體最大的無血管組織，正常情況下，具有特定的解剖屏障結(jié)構(gòu)，無淋巴引流，雖然具有免疫原性的Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、蛋白聚糖等細(xì)胞外基質(zhì)成分可以與外界免疫細(xì)胞直接接觸，免疫細(xì)胞也可以通過軟骨終板進(jìn)入盤內(nèi)，但并不會(huì)發(fā)生損害性免疫反應(yīng)，因此被稱為“免疫赦免器官”，而免疫赦免狀態(tài)是椎間盤維持正常生理功能的必要條件[5-6]。

由于內(nèi)外損傷因素聯(lián)合作用使免疫赦免狀態(tài)被打破，椎間盤發(fā)生退變。為抵抗損害，盤內(nèi)髓核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及免疫細(xì)胞活化并分泌促炎癥因子，包括腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-17、γ干擾素、前列腺素E2以及趨化因子等。TNF可通過核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)和促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路調(diào)控?fù)p傷細(xì)胞的凋亡；IL-6負(fù)責(zé)通過Janus激酶(Janus kinase，JAK)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT)和Ras蛋白/磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K) 信號(hào)通路，促進(jìn)B細(xì)胞、T細(xì)胞增殖分化功能，刺激前列腺素E2的增加以及細(xì)胞外基質(zhì)的分解，顯著減少蛋白多糖的合成；γ干擾素通過JAK/STAT途徑，增加細(xì)胞間黏附分子1表達(dá)，使微血管侵入椎間盤；IL-17信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生趨化因子，募集單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞到達(dá)炎癥部位；IL-1α、IL-1β促進(jìn)趨化因子的產(chǎn)生，這些細(xì)胞因子可促進(jìn)B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞的侵入，促進(jìn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，繼而分泌高水平的β神經(jīng)生長因子和腦源性神經(jīng)生長因子，神經(jīng)痛相關(guān)陽離子通道，特別是酸敏感離子通道3和瞬時(shí)電位陽離子通道1去極化表達(dá)導(dǎo)致致痛性神經(jīng)纖維侵入，高水平的細(xì)胞因子刺激神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至中樞，引起腰痛的發(fā)生[7]。

炎癥反應(yīng)可促使免疫細(xì)胞對(duì)椎間盤的破壞性損傷，加劇盤內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-1、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-13以及血小板反應(yīng)蛋白的解聚素與金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif，ADAMTS)-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、ADAMTS-9、ADAMTS-15的分解代謝過程，使椎間盤的彈性結(jié)構(gòu)成分(蛋白聚糖、Ⅱ型膠原)以及水分相對(duì)減少，而Ⅰ型膠原增加、高度降低，穩(wěn)定性遭到破壞，髓核組織不足以承受脊柱強(qiáng)大的壓力負(fù)荷，應(yīng)力轉(zhuǎn)向纖維環(huán)，致使椎間盤結(jié)構(gòu)破壞[8]。暴露出具有免疫原性的髓核、纖維環(huán)組織及細(xì)胞外基質(zhì)成分，引起抗原抗體反應(yīng)、免疫球蛋白沉積，進(jìn)而激活弗氏完全佐劑與誘導(dǎo)的胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和MAPK信號(hào)通路所致的炎癥反應(yīng)，刺激背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)末梢傷害感受器產(chǎn)生疼痛[9]。除傳統(tǒng)意義上的椎間盤突出壓迫神經(jīng)根導(dǎo)致的疼痛外，這些觀點(diǎn)闡釋了LDD導(dǎo)致的非占位腰痛。

2 LncRNA與LDD

LncRNA是轉(zhuǎn)錄本序列長度大于200 nt且不具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA， LncRNA物種間保守性較低，曾被認(rèn)為是微RNA(microRNA，miRNA)偶然結(jié)合的副產(chǎn)物，干擾轉(zhuǎn)錄調(diào)控的進(jìn)程，被視為轉(zhuǎn)錄間的“噪聲”“暗物質(zhì)”[10]。后續(xù)的研究證明，LncRNA具有種內(nèi)保守的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，有些具有與信使RNA(messenger RNA，mRNA)相似的poly(A)尾結(jié)構(gòu)，可以與蛋白、DNA和RNA相互作用，參與多種生物學(xué)過程的調(diào)控，涉及表觀遺傳的DNA甲基化和組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄過程中轉(zhuǎn)錄因子的招募、轉(zhuǎn)錄后miRNA的內(nèi)源競爭及mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控，甚至影響翻譯水平蛋白的空間構(gòu)象及功能活性等，在很多細(xì)胞生命活動(dòng)中起著舉足輕重的作用，素有“音樂指揮家”之稱[11]。LncRNA在不同組織中的表達(dá)具有高度特異性，為研究局部特殊病種提供了可靠的依據(jù)。

LncRNA作為基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子，參與了神經(jīng)性退變、炎癥反應(yīng)、骨關(guān)節(jié)炎等疾病的諸多生命過程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝、遷移侵襲及表型調(diào)控等[12-13]。有研究分析了正常與退變髓核細(xì)胞中各5個(gè)樣本中差異表達(dá)的LncRNA和mRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，呈現(xiàn)顯著差異倍數(shù)>10的LncRNA共有116個(gè)(67個(gè)上調(diào)、49個(gè)下調(diào))，mRNA有260個(gè)，并通過KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)有研究意義的生物學(xué)通路，包括細(xì)胞外基質(zhì)受體作用、炎癥相關(guān)的NF-κB/MAPK、Wnt/β聯(lián)蛋白(β-catenin)、PI3K/Akt信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長因子-β信號(hào)通路、ILs細(xì)胞因子通路等；另外，還分析出作為抗炎因子的IL-17在退變的髓核細(xì)胞中低表達(dá)，相關(guān)分析顯示，IL-17與其鄰近基因間長鏈基因間非編碼RNA(long intergenic non-coding RNA，LincRNA)-SLC20A1-1的表達(dá)上調(diào)顯著相關(guān)[14]。表明LncRNA在LDD過程中發(fā)揮潛在控制炎癥表達(dá)的效用。

從GEO(Gene Expression Omnibus)基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫中基于GSE56081平臺(tái)下載的GSE56081基因芯片中共篩選出8個(gè)與LDD相關(guān)的關(guān)鍵LncRNA (CTC-523E23.5、RP4-639J15.1、RP11-363G2.4；CTD-2246P4.1、Linc00917； AC005082.12；miR-132、RP11-38F22.1)[15]。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，結(jié)合一些通用的數(shù)據(jù)庫可以建立LncRNA-miRNA-mRNA共表達(dá)的競爭性內(nèi)源RNA網(wǎng)絡(luò)，能夠找出更多LncRNA與疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)，為進(jìn)一步學(xué)術(shù)研究和臨床應(yīng)用提供有價(jià)值的參考。

3 LncRNA與LDD的機(jī)制研究

通常情況下，LDD是由于髓核內(nèi)酶類的分解代謝速度大于合成代謝速度所致，而在退變的早期，往往出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅱ型膠原合成增加，在椎間盤受損區(qū)出現(xiàn)典型的“細(xì)胞簇”的特征，這些細(xì)胞密度升高，但活性細(xì)胞數(shù)量較少、細(xì)胞周期紊亂，細(xì)胞呈現(xiàn)過度增殖，可能揭示早期由細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)LDD和不正常機(jī)械應(yīng)力損傷等因素導(dǎo)致的進(jìn)展性結(jié)構(gòu)破壞的異常反應(yīng)[16]。隨著椎間盤的退化，椎間盤細(xì)胞發(fā)生巨大的生物學(xué)變化，包括細(xì)胞類型轉(zhuǎn)換、細(xì)胞老化、凋亡加速等細(xì)胞表型改變，這些變化通過復(fù)雜的相互作用參與了椎間盤變性的過程，致使椎間盤分解代謝增強(qiáng)，并逐漸喪失合成細(xì)胞外基質(zhì)成分的能力，炎癥反應(yīng)隨之被激活[17]。具有活性的LncRNA可以通過直接調(diào)控髓核細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的靶基因或競爭miRNA調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、衰老、自噬、細(xì)胞外基質(zhì)的合成以及降解等諸多細(xì)胞過程[18]。

3.1細(xì)胞增殖相關(guān)LncRNA

3.1.1RP11-296a18.3 編號(hào)為RP11-296a18.3的LncRNA在人退變的髓核細(xì)胞中顯著上調(diào)，短發(fā)夾RNA轉(zhuǎn)染干擾實(shí)驗(yàn)顯示，髓核細(xì)胞的活性及DNA的合成能力被抑制，Ⅰ型膠原蛋白和MMP-13的表達(dá)減少；利用生信預(yù)測數(shù)據(jù)庫miRCode得到RP11-296a18.3潛在的結(jié)合靶點(diǎn)miR-138，LncRNA RP11-296a18.3通過類似“分子海綿”的形式，內(nèi)源性競爭吸收miR-138，而miR-138可與缺氧誘導(dǎo)因子1α結(jié)合，活化細(xì)胞增殖的miRNA；進(jìn)一步研究表明，RP11-296a18.3通過與miR-138結(jié)合形成異常增殖的細(xì)胞簇，進(jìn)而刺激細(xì)胞外基質(zhì)的分解代謝，并加速髓核細(xì)胞的退變過程[19]。

3.1.2小核仁RNA宿主基因1(small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1)和線粒體RNA處理核糖核酸內(nèi)切酶RNA(RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease，RMRP) 外源性調(diào)節(jié)的LncRNA SNHG1和RMRP被證明在LDD中的表達(dá)均上調(diào)，SNHG1通過抑制miR-326促進(jìn)了髓核增殖細(xì)胞核抗原和細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖[20]；RMRP在椎間盤中的異位表達(dá)，可靶向調(diào)節(jié)miR-206，減少M(fèi)MP-13和ADAMTS-4的表達(dá)，促進(jìn)Ⅱ型膠原和蛋白聚糖合成，同時(shí)促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原Ki-67和細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，且RMRP在LDD后期的表達(dá)水平更高[21]。LncRNA SNHG1與RMRP對(duì)LDD的發(fā)生、發(fā)展具有積極作用，但兩者表現(xiàn)出上調(diào)的趨勢，一個(gè)可能的原因?yàn)檫^度增殖的細(xì)胞形成異常細(xì)胞簇加速退變；另一方面可能由于LncRNA之間存在反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，SNHG1與RMRP的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制拮抗其他促退變的LncRNA，保護(hù)椎間盤免受過度的損傷。

3.1.3肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)和核富集轉(zhuǎn)錄本(nuclear enriched abundant transcript，NEAT)1 MALAT1又稱NEAT1，在不同的細(xì)胞過程中發(fā)揮不同的生理功能，如選擇性剪接、核組織和基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控[22]。與對(duì)照組相比，退變的髓核細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)顯著減少，MALAT1低表達(dá)的退變髓核細(xì)胞中胱天蛋白酶(caspase)3的活性(凋亡標(biāo)志物)增加，細(xì)胞增殖受到抑制，IL-1和IL-6的分泌增加，而上調(diào)MALAT1基因表達(dá)可抑制炎癥反應(yīng)和髓核細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，減輕LDD[23]。另一相似轉(zhuǎn)錄本LncRNA NEAT1在LDD中的表達(dá)則呈現(xiàn)相反的結(jié)果，NEAT1、p53、p21的表達(dá)均顯著上調(diào)，通過調(diào)節(jié)ERK/MAPK信號(hào)通路促進(jìn)分解代謝過程中MMP-13和ADAMTS-5的表達(dá)，使合成代謝中Ⅱ型膠原和蛋白聚糖表達(dá)下調(diào)、凋亡細(xì)胞水平升高，而通過轉(zhuǎn)染特異性干擾RNA可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)[24]。LncRNA NEAT通過阻止髓核細(xì)胞外基質(zhì)降解和細(xì)胞凋亡過程，有望成為LDD治療的新靶點(diǎn)。

3.2細(xì)胞凋亡相關(guān)LncRNA

3.2.1生長阻滯劑特異性轉(zhuǎn)錄本5(growth arrest-specific transcript 5，GAS5) GAS5作為一種編碼多種小核仁RNA的LncRNA，主要具有生長抑制和促進(jìn)異常炎癥細(xì)胞凋亡的作用。GAS5在LDD的表達(dá)顯著上調(diào)，在線數(shù)據(jù)庫miRBase確認(rèn)GAS5的miRNA結(jié)合靶點(diǎn)為miR-155，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)測定基因表達(dá)量，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)測得細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)、caspase-3表達(dá)，利用Annexin V/PI膜核雙染色法測定細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，對(duì)照組的凋亡率低于GAS5過表達(dá)組[(35.4±1.86)%比(42.6±2.23)%](P<0.05)，提示LncRNA GAS5可能通過靶向結(jié)合miR-155，上調(diào)細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3，從而誘導(dǎo)早期髓核細(xì)胞凋亡[25]。

3.2.2人類同源轉(zhuǎn)錄因子反義RNA (human homeobox transcription factors antisense intergenic RNA，HOTAIR) HOTAIR定位于第12號(hào)染色體HOXC11和HOXC12之間，是最早被發(fā)現(xiàn)的具有反式作用的基因間LincRNA[26]。研究表明，HOTAIR在LDD的髓核組織及TNF-α誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞退變模型中均顯著低表達(dá)；經(jīng)TargetScan系統(tǒng)預(yù)測得知，miR-34a是HOTAIR內(nèi)源競爭的miRNA，而miR-34a的關(guān)鍵靶點(diǎn)是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的Bcl-2基因，Bcl-2蛋白通過抗氧化損傷或作為通道蛋白等方式保護(hù)細(xì)胞免于損傷或凋亡，Bcl-2相關(guān)X蛋白及caspase-3有拮抗Bcl-2的保護(hù)效應(yīng)，可使細(xì)胞趨于死亡；經(jīng)轉(zhuǎn)染過表達(dá)HOTAIR基因到TNF-α誘導(dǎo)退變髓核細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率降低、Bcl-2增加、Bcl-2相關(guān)X蛋白、caspase-3相對(duì)減少，表明HOTAIR能夠通過miR-34a/Bcl-2軸抵抗TNF-α誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞損傷效應(yīng)[27]。HOTAIR的表達(dá)減少預(yù)示著LDD過程中髓核組織的自我保護(hù)機(jī)制受損，凋亡效應(yīng)占主導(dǎo)作用。

3.2.3DNA聚合酶ε(DNA polymerase epsilon，PolE) PolE由PolE1、PolE2、PolE3和PolE4四個(gè)單元組成。正常情況下，細(xì)胞需要維持一定的DNA甲基化狀態(tài)，才能穩(wěn)定有序調(diào)控非編碼RNA和基因的表達(dá)，DNA甲基化狀態(tài)決定了LncPolE水平，而LncPolE水平又能負(fù)調(diào)控DNA或染色質(zhì)中組蛋白的活動(dòng)，LncPolE水平升高可抑制PolE1的表達(dá)，影響PolE1復(fù)合物的穩(wěn)定性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[28]。Li等[29]的研究表明，在鐵含量降低的情況下，LncRNA啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白乙酰化和DNA甲基化異常，可導(dǎo)致PolE1的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，從而激活髓核細(xì)胞凋亡信號(hào)，最終導(dǎo)致LDD的發(fā)生，這一系列表觀遺傳上的變化與LncPolE存在密不可分的聯(lián)系，通過額外補(bǔ)充和消耗髓核組織中的鐵元素，LncPolE水平隨鐵含量的升高而下調(diào)，并通過二價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體1或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1的剔除進(jìn)一步得以證實(shí)。這是第一個(gè)由金屬陽離子調(diào)控的LncRNA，這一發(fā)現(xiàn)提出了另一具有創(chuàng)新性的研究思路，為從微量元素角度解決LDD提供了新的可能。

3.3細(xì)胞衰老相關(guān)LncRNA

3.3.1H19 人年齡的增加也是LDD重要的影響因素，髓核細(xì)胞的衰老普遍存在。由于受到長期持續(xù)外界環(huán)境刺激以及椎間盤自身無血管條件下局限的營養(yǎng)供應(yīng)，導(dǎo)致髓核細(xì)胞含量較少，細(xì)胞代謝過程中通過氧化磷酸化產(chǎn)生能量、氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致促炎因子(包括TNF-α和ILs)誘導(dǎo)產(chǎn)生副產(chǎn)物活性氧類成分，進(jìn)一步加劇了髓核細(xì)胞衰老及退變[30]。衰老相關(guān)β半乳糖苷酶在衰老細(xì)胞中的活性顯著增加，是實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞衰老的特異性標(biāo)志物。基于GEO數(shù)據(jù)庫的GSE56081芯片得知，LncRNA H19在LDD中的表達(dá)顯著升高，在線平臺(tái)miRanda、miRWalk、RNA22和Targetscan預(yù)測并證實(shí)了H19作為一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子通過海綿內(nèi)源性RNA競爭方式結(jié)合miR-22，促進(jìn)淋巴強(qiáng)化因子1的表達(dá)；另外，過氧化氫誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞衰老模型、基因敲除、過表達(dá)及信號(hào)通路實(shí)驗(yàn)證明，H19通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老過程中淋巴強(qiáng)化因子1、Myc、細(xì)胞周期蛋白D1蛋白的表達(dá)，促進(jìn)分解酶MMP-2、MMP-3、MMP-9以及ADAMTS-5和Ⅰ型膠原的增加，抑制細(xì)胞增殖，在LDD進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[31]。

3.3.2?；撬嵘险{(diào)基因1 (taurine up-regulated gene 1，TUG1) 另一在細(xì)胞衰老模型中發(fā)揮重要作用的TUG1也被證實(shí)能夠通過激活Wnt/β-catenin通路抑制細(xì)胞增殖，而髓核細(xì)胞衰老的標(biāo)志物衰老相關(guān)β半乳糖苷酶的活性增加，可加速炎癥因子的產(chǎn)生以及細(xì)胞的衰老[32]。沉默H19、TUG1或使用特異性Wnt/β-catenin信號(hào)阻滯劑可阻斷營養(yǎng)缺乏或炎癥誘導(dǎo)髓核細(xì)胞衰老過程，為LDD的臨床治療提供了理論依據(jù)。

3.4細(xì)胞自噬相關(guān)LncRNA——Linc00641 細(xì)胞自噬是真核生物進(jìn)化中保守地對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行周轉(zhuǎn)的過程，它將非必需的分子或損壞的細(xì)胞成分通過自噬小泡隔離，使溶酶體在各種應(yīng)激刺激下降解并得以循環(huán)利用，這一過程主要由自噬相關(guān)基因(autophagy related genes，ATG)調(diào)控。以往的研究中，衰老大鼠和退變的椎間盤中髓核細(xì)胞自噬水平升高，異常的機(jī)械壓縮、高糖、乳酸超載、葡萄糖胺、活性氧類和營養(yǎng)缺乏等多種應(yīng)激均會(huì)激活自噬反應(yīng)，miR-153-3p能夠降低ATG的表達(dá)水平，靶向抑制自噬程序，進(jìn)一步說明自噬調(diào)節(jié)可能是椎間盤病變的誘因之一[33]。Wang等[34]研究發(fā)現(xiàn)，Linc00641是來自基因間與自噬相關(guān)的LncRNA，采用透射電鏡、蛋白印跡實(shí)驗(yàn)和綠色熒光蛋白輕鏈3檢測自噬活性，并利用Pull down和RNA熒光原位雜交技術(shù)對(duì)Linc00641靶點(diǎn)及定位進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，Linc00641通過海綿競爭miR-153-3p，影響低營養(yǎng)誘導(dǎo)的LDD模型中ATG基因及蛋白的表達(dá)，加速細(xì)胞自噬及細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致LDD的級(jí)聯(lián)破壞反應(yīng)。

3.5細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)LncRNA——LincRNA ADAMTS-5 LincRNA ADAMTS-5(LOC105372760)作為一種基因間反義表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控RNA，在LDD中的表達(dá)下調(diào)，用生物素化的Linc-ADAMTS-5進(jìn)行Pull down實(shí)驗(yàn)，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析，尋找到潛在的與Linc-ADAMTS-5相互作用的蛋白，與之相關(guān)的Ras響應(yīng)元件結(jié)合蛋白1 (Ras responsive element binding protein 1，RREB1)是調(diào)節(jié)ADAMTS-5在髓核細(xì)胞表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，剪接因子脯氨酸/谷氨酸是被證明與LincRNA ADAMTS-5相互作用的結(jié)合蛋白，Linc-ADAMTS-5與脯氨酸/谷氨酸蛋白結(jié)合后，促進(jìn)RREB1招募至ADAMTS-5啟動(dòng)子內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)，從而誘導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)，導(dǎo)致髓核細(xì)胞中組蛋白去乙酰化，抑制ADAMTS-5的表達(dá)[35]。另外，通過R2、JASPAR[36]、Genomatix[37]數(shù)據(jù)庫以及RNA免疫共沉淀、體外結(jié)合分析進(jìn)一步證實(shí)，LDD中下調(diào)的Linc-ADAMTS-5與RREB1協(xié)同可促進(jìn)ADAMTS-5的表達(dá)，促進(jìn)髓核組織細(xì)胞外基質(zhì)的降解，加速LDD的進(jìn)程。

3.6炎癥因子調(diào)節(jié)相關(guān)LncRNA——人類白細(xì)胞抗原復(fù)合體18(human leukocyte antigen complex group 18，HCG18) HCG18是長度為2 430 bp的LncRNA，在椎間盤突出患者的髓核組織中表達(dá)上調(diào)，并與突出的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)；通過生物信息方法starBase v2.0預(yù)測得知，miR-146a-5p通過抑制TNF受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6)的表達(dá)，阻斷激活NF-κB的信號(hào)通路，從而抑制巨噬細(xì)胞的侵入和細(xì)胞凋亡；HCG18還可通過抑制miR-146a-5p的功能，發(fā)揮多種導(dǎo)致細(xì)胞凋亡及炎性調(diào)節(jié)的功能[38]。Xi等[39]通過體外TNF-α誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞退變模型實(shí)驗(yàn)證明，HCG18與TRAF6呈正相關(guān)，而TRAF6能夠阻止HCG18介導(dǎo)的髓核細(xì)胞生長抑制；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達(dá)與基因干擾實(shí)驗(yàn)證明，HCG18可促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡、巨噬細(xì)胞侵襲、堿性磷酸酶含量升高以及成骨分化中礦化結(jié)節(jié)增加，HCG18通過miR-146a-5p/TRAF6/NF-κB的炎性調(diào)節(jié)軸，抑制了髓核細(xì)胞的生長，促進(jìn)髓核退變過程中炎癥反應(yīng)的積累，加速LDD的進(jìn)展。

4 小 結(jié)

LncRNA在局部組織具有高度特異性，作為檢測疾病的生物標(biāo)志物具有相當(dāng)可靠的價(jià)值。細(xì)胞焦亡作為一種新的程序性細(xì)胞死亡方式，與細(xì)胞凋亡、壞死等不同，其主要依賴于caspase-1形成多種caspase炎癥小體，并伴有大量促炎因子及消解酶的釋放。有研究表明，LncRNA H19、MALAT1、NEAT1分別參與視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷[40]、糖尿病腎病[41]、自身免疫反應(yīng)[42]等的細(xì)胞焦亡過程。這些常用于學(xué)術(shù)研究的LncRNA在椎間盤髓核組織中的表達(dá)也存在差異，進(jìn)一步從細(xì)胞焦亡的角度進(jìn)行深入研究，能夠開拓出LncRNA在LDD機(jī)制中的新思路。