響應(yīng)面法優(yōu)化固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法檢測鴨肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

王 武，查甫本，張 靜，沈君臣，任志偉

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

響應(yīng)面法優(yōu)化固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法檢測鴨肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

王 武，查甫本，張 靜，沈君臣，任志偉

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

為優(yōu)化鴨肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的萃取條件，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以鴨肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的色譜圖總峰面積為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析。結(jié)果表明，最佳萃取條件為鴨肉萃取量為2.4g、萃取時(shí)間42min、萃取溫度49℃。在此條件下檢測到鴨肉中含有烯烴類、醛類、酮類、含氮含硫含氧類及雜環(huán)化合物等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)27種。

鴨肉；固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法(SPME-GC-MS)；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)；Box-Behnken設(shè)計(jì)；響應(yīng)面分析

鴨肉具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇等特點(diǎn)，含有較多的B族維生素、VE和煙酸[1]，其脂肪酸熔點(diǎn)低，易于消化吸收。據(jù)《本草綱目》記載，鴨甘、大寒、無毒，有清肺解熱、止咳化痰、養(yǎng)胃補(bǔ)腎、滋陰補(bǔ)血之功，可用于醫(yī)治癆熱骨蒸、血暈頭痛、陰虛失眠、肺熱咳嗽、腎炎水腫、排尿不利及低熱等癥，養(yǎng)生界也有“爛煮老雄鴨，功效比參芪”之說，食鴨進(jìn)補(bǔ)也逐漸成為一大時(shí)尚。在禽畜制品市場競爭日趨激烈的形勢下，保持鴨肉制品的風(fēng)味是提高鴨肉制品競爭力的重要保證，而揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是影響鴨肉制品風(fēng)味的重要方面。

固相微萃取技術(shù)(solid phase microextraction，SPME)是1989年加拿大Waterloo大學(xué)C.L.Arthur和 J.Pawliszyn等開發(fā)的新型無溶劑樣品前處理技術(shù)，SPME技術(shù)集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體，操作簡便，廣泛應(yīng)用于環(huán)境污染物、農(nóng)藥殘留、臨床藥理、公安案件分析、制藥、化工、食品分析等領(lǐng)域[2]，可用于鴨肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測的前處理。本實(shí)驗(yàn)通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)法及響應(yīng)面分析法，優(yōu)化了固相微萃取條件，并采用頂空固相微萃取與氣相色譜聯(lián)用技術(shù)，分析檢測鴨肉揮發(fā)性風(fēng)味成分，以期為確定其鴨肉特色揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生機(jī)理并進(jìn)一步為鴨肉風(fēng)味調(diào)控研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

櫻桃谷瘦型鴨腿 山東六和集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

手動(dòng)SPME進(jìn)樣器、75μmCarboxen/PDMS萃取頭、65μmPDMS/DVB萃取頭，100μmPDMS萃取頭、15mL EPA/VOA螺口樣品瓶 美國 Supelco公司；DB-5MS毛細(xì)管色譜柱 Agilent公司；QP-2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司； 液氮罐 成都金鳳液氮容器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 萃取頭老化

將使用的3種固相微萃頭在氣相色譜的進(jìn)樣口老化至無雜峰，老化溫度250℃，時(shí)間120min。

1.3.2 樣品制備

將生鴨肉在 95℃左右的水中煮熟后取腿肉，冷凍24h后切成薄片，迅速置于液氮罐中0.5h，磨成粉末備用。

1.3.3 GC-MS參數(shù)條件及分析

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：DB-5MS毛細(xì)管色譜柱(60m×0.32mm，1μm)；升溫程序：起始柱溫40℃，保持2min，以5℃/min上升至60℃；再以3℃/min上升至100℃；再以18℃/min上升至240℃，保持6min。載氣He，流速0.3mL/min；恒壓35kPa，不分流，進(jìn)樣口溫度與接口溫度均為250℃，檢測溫度240℃。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊(EI)離子源；電子能量70eV；離子源溫度200℃；燈絲電流150μA；質(zhì)量掃描范圍(m/z)33～450u。

1.3.4 定性定量方法

定性方法：經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索，同時(shí)與NIST library對(duì)照相匹配，本研究僅報(bào)道相似度大于80(最大值100)的鑒定結(jié)果。

定量方法：相對(duì)百分含量按峰面積歸一化計(jì)算。

1.3.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.5.1 單因素影響試驗(yàn)

在固定的GC-MS條件下選擇合適萃取頭，再在此基礎(chǔ)上考察萃取量、萃取溫度、萃取時(shí)間、解析時(shí)間對(duì)萃取物質(zhì)離子色譜圖總峰面積的影響。

1.3.5.2 響應(yīng)法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，選用最佳萃取頭及解吸時(shí)間，以萃取量(A)、萃取時(shí)間(B)、萃取溫度(C)為試驗(yàn)因素，并以+1、0、－1分別代表變量的水平，以總峰面積作為響應(yīng)值。采用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和響應(yīng)面分析。

1.3.5.3 樣品檢測

根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定的最優(yōu)條件，對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取條件優(yōu)化

2.1.1 萃取頭的選擇

萃取頭涂層種類和厚度對(duì)SPME靈敏度的影響最為關(guān)鍵，不同種類目標(biāo)分析物一般需用不同類型的吸附質(zhì)涂層萃取，考慮到被萃取的物質(zhì)種類和極性都較多，需要對(duì)萃取頭進(jìn)行選擇。固定鴨肉萃取量2g，分別選擇在45℃恒溫下萃取30min，解吸時(shí)間為2min，考察CAR/ PDMS、PDMS/DVB、PDMS 3種萃取頭對(duì)總峰面積的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 萃取頭對(duì)總峰面積的影響Fig.1 Effect of extraction fibers on total ion current chromatographic peak area of duck meat extract

由圖1可知，CAR/PDMS萃取頭萃取得到的總峰面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于PDMS/DVB萃取頭和PDMS萃取頭，可能是由于鴨肉中氣體和小分子質(zhì)量化合物較多，而CAR/ PDMS萃取頭對(duì)一些氣體及小分子物質(zhì)萃取效果較好，因此萃取頭類型選擇CAR/PDMS。

2.1.2 萃取量對(duì)總峰面積的影響

由于瓶內(nèi)容積固定，而鴨肉萃取量對(duì)揮發(fā)性成分的影響較大，量少則揮發(fā)性成分較少不易分析，量過多則由于擠壓作用而使得氣體不易揮發(fā)出來，選用CAR/ PDMS萃取頭，固定萃取時(shí)間30min，萃取溫度45℃，解吸時(shí)間2min，鴨肉萃取量分別為1、2、3、4g，研究萃取量對(duì)總峰面積的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 萃取量對(duì)總峰面積的影響Fig.2 Effect of sample load on total ion current chromatographic peak area of duck meat extract

由圖2可知，總峰面積隨著鴨肉量的增大而增大，添加量為2g達(dá)到最大，然后則稍有減小。這表明鴨肉萃取量對(duì)總峰面積影響較大，并且存在最佳點(diǎn)。

2.1.3 萃取溫度對(duì)總峰面積的影響

萃取溫度對(duì)SPME的影響具有雙重效應(yīng)：通常升高溫度，液體內(nèi)分子熱運(yùn)動(dòng)加快，有利于分析物在基質(zhì)中的擴(kuò)散(提高分析物在頂空的分配)，縮短平衡時(shí)間、加快分析速度；但溫度過高會(huì)使分析物在涂層與基質(zhì)中的分配系數(shù)降低，涂層對(duì)分析物的吸附量減小，影響SPME法的靈敏度。選擇CAR/PDMS萃取頭，固定萃取量2g，萃取時(shí)間30min，解吸時(shí)間2min，萃取溫度設(shè)定為35、45、55、65℃，研究萃取溫度對(duì)總峰面積的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 萃取溫度對(duì)總峰面積的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on total ion current chromatographic peak area of duck meat extract

由圖3可知，總峰面積在45℃時(shí)達(dá)到最大，然后開始下降。這表明萃取溫度對(duì)總峰面積的影響較大，并且存在最佳值。

2.1.4 萃取時(shí)間對(duì)總峰面積的影響

萃取時(shí)間的長短主要取決于頂空瓶中被分析物質(zhì)在固-氣二相之間達(dá)到平衡的速度，一般萃取過程均在剛開始時(shí)吸附量迅速增加，到一定的點(diǎn)位后上升就很緩慢。選擇CAR/PDMS萃取頭，固定萃取量2g，萃取溫度45℃，解吸時(shí)間2min，萃取時(shí)間分別為20、30、40、50min，研究萃取時(shí)間對(duì)總峰面積的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 萃取時(shí)間對(duì)總峰面積的影響Fig.4 Effect of extraction duration on total ion current chromatographic peak area of duck meat extract

由圖4可知，隨著時(shí)間的延長，總峰面積不斷增大，40min時(shí)達(dá)到最大，隨著時(shí)間的增加，面積反而有所減小。這表明萃取時(shí)間對(duì)總峰面積有影響較大，并且存在最佳值。

2.1.5 解吸時(shí)間對(duì)總峰面積的影響

解吸時(shí)間的長短一般和萃取頭涂層的厚度有關(guān)，萃取頭涂層越厚，解吸時(shí)間就相應(yīng)地延長。選擇CAR/ PDMS萃取頭，固定萃取時(shí)間40min，鴨肉萃取量2g，萃取溫度40℃，解吸時(shí)間分別為1、2、3、4min，研究解析時(shí)間對(duì)總峰面積的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 解吸時(shí)間對(duì)總峰面積的影響Fig.5 Effect of desoprtion duration on total ion current chromatographic peak area of duck meat extract

由圖5可知，隨著解吸時(shí)間的增加，峰面積也在增大，但在解吸時(shí)間為2min之后峰面積基本不變，而且在解吸2min后，再重新插入進(jìn)樣口解吸，基本上沒有任何信號(hào)。故解吸時(shí)間選擇為2min。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化萃取條件

2.2.1 響應(yīng)面法因素水平的選取及試驗(yàn)方案

根據(jù) Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[3-4]，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇CAR/PDMS萃取頭，解吸時(shí)間固定為2min，以鴨肉的萃取量、萃取時(shí)間及萃取溫度作為研究因素，采用三因素三水平響應(yīng)面分析方法，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels in the response surface design

2.2.2 多元回歸結(jié)果分析

以總峰面積為響應(yīng)值(Y)，對(duì)固相微萃取檢測鴨肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)為12個(gè)析因點(diǎn)和3個(gè)零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在各因素所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)3次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2，回歸分析結(jié)果見表3。

表2 設(shè)計(jì)方案和結(jié)果Table2 Response surface design arrangement and experimental results

表3 回歸分析結(jié)果Table3 Results of regression analysis

利用Design Expert7.0軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到總峰面積對(duì)鴨肉萃取量(A)、萃取時(shí)間(B)和萃取溫度(C)的二次多項(xiàng)回歸模型：

Y=－4.88084+0.96642A+0.066833B+0.15835C－1.35×10-3AB－2.30×10-5AC－2.75×10-3BC－0.16654A2－7.72917×10-4B2－1.54295×10-3C2

由表3可知，回歸模型極顯著(P＜0.01)；而失擬項(xiàng)不顯著(P=0.2493)，表明該模型擬合程度良好，可以用此模型來對(duì)鴨肉揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析和預(yù)測。從表3可以看出，A、C、A2、B2、C2對(duì)結(jié)果的影響極顯著(P＜0.01)。對(duì)總峰面積影響的大小依次為萃取量、萃取溫度和萃取時(shí)間。

2.3 總峰面積的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

圖6 萃取量和萃取時(shí)間對(duì)總峰面積的影響Fig.6 Response surface diagram showing the interactive effects of sample load and extraction duration on total ion current chromatographic peak area of duck meat extract

圖7 萃取量和萃取溫度對(duì)峰面積的影響Fig.7 Response surface diagram showing the interactive effects of sample load and extraction temperature on total ion current chromatographic peak area of duck meat extract

圖8 萃取時(shí)間和萃取溫度對(duì)峰面積的影響Fig.8 Response surface diagram showing the interactive effects of extraction duration and temperature on total ion current chromatographic peak area of duck meat extract

利用Design Expert 7.0軟件，繪制響應(yīng)面圖(在考察的區(qū)域內(nèi))，結(jié)果如圖6～8所示。圖6顯示萃取溫度為45℃條件下，萃取量和萃取時(shí)間對(duì)總峰面積的影響；圖7顯示萃取時(shí)間為40min情況下，萃取量和萃取溫度對(duì)總峰面積的影響；圖8顯示萃取量為2g時(shí)，萃取時(shí)間和萃取溫度對(duì)總峰面積的影響。比較3組圖可知，萃取量和萃取溫度對(duì)總峰面積的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，而萃取時(shí)間則影響不大，表現(xiàn)為曲線較為平滑，響應(yīng)值變化較小；且3個(gè)響應(yīng)曲面均為開口向下的凸形曲面，說明響應(yīng)值存在極大值。結(jié)合二次回歸模型的分析結(jié)果，最大總峰面積的萃取條件為鴨肉萃取量2.40g，萃取時(shí)間42.27min，萃取溫度 49.17℃，此時(shí)，總峰面積最大，萃取效果最好。根據(jù)實(shí)際條件，選擇鴨肉萃取量為2.4g， 萃取時(shí)間42min，萃取溫度49℃。

2.4 樣品的檢測

圖9 樣品的分析譜圖Fig.9 Total ion current chromatogram of duck meat extract

表4 鴨肉的揮發(fā)性風(fēng)味成分和相對(duì)含量Table4 Identified flavor compounds and their relative content in duck meat

按上述最佳條件，即選用CAR/PDMS萃取頭，鴨肉萃取量2.4g，萃取時(shí)間為42min，萃取溫度為49℃，解吸時(shí)間固定為2min， 檢測出鴨肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總峰面積為14928539。共檢測出了烴類、醛類、醇類、酮類、酯類、含氮含硫含氧類及雜環(huán)化合物共27種風(fēng)味物質(zhì)。鴨肉的色譜圖如圖9所示，測定的風(fēng)味物質(zhì)的成分及相對(duì)含量如表4所示。

檢測結(jié)果表明，烴類存在于鴨肉中，由于烷烴閾值較高，因此烷烴對(duì)于食品整體的風(fēng)味貢獻(xiàn)很小[5]。但一些支鏈烯烴，如3,4-二甲基-1-戊烯可能對(duì)鴨肉的香氣特征有貢獻(xiàn)。

從鴨肉中檢出了大量的醛類物質(zhì)，主要是己醛、戊醛、壬醛、辛醛等烷基醛和部分烯醛。烷基醛、烯醛和二烯醛是亞油酸酯和亞麻酸酯的氫過氧化物降解的產(chǎn)物，可能是構(gòu)成肉品種的特征性風(fēng)味物質(zhì)[6]。一些相對(duì)分子質(zhì)量低的醛類化合物對(duì)蒸煮以后鴨肉的特征香味有貢獻(xiàn)[7]，己醛、壬醛、辛醛等具有清香青草氣味[8-9]，一些烯醛類及二烯醛類化合物，如2-庚烯醛、2-辛烯醛對(duì)蒸煮以后肉的特征香味貢獻(xiàn)更大。由于鴨肉不飽和脂肪酸含量較高，鴨肉的氧化產(chǎn)物對(duì)其風(fēng)味的作用可能比其他肉類要大。

鴨肉中檢出了1-戊醇、己醇等醇類物質(zhì)，主要是在加熱過程中脂肪氧化分解和羰基化合物還原所致，雖然這些醇類的閾值較高[10]，但鴨肉中飽和醇的百分含量為9.83%，含量較高，可能對(duì)鴨肉的特征風(fēng)味有一定的貢獻(xiàn)。

酮類可能是由不飽和脂肪酸的熱氧化或降解產(chǎn)生的[11-12]，檢測得到的酮類化合物中如2-庚酮、2,3-辛二酮、5-羥基-4-辛酮等對(duì)肉中甜的花香及果香風(fēng)味有貢獻(xiàn)，并且隨著碳鏈的增長會(huì)呈現(xiàn)出更強(qiáng)的花香特征[13-14]。烯酮類化合物如3-甲基,4-己烯-2-酮、4-庚烯-2-酮等是在加熱期間生成的脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物，具有植物芳香的氣味特征。

Mottram[6]認(rèn)為，雜環(huán)化合物及芳香類化合物域值較低，是肉中的特征香味的另一重要來源。2-戊基呋喃是亞油酸氧化產(chǎn)物，且閾值相對(duì)較低(大約為4μg/kg)，具有蔬菜芳香。2-戊基呋喃作為肉品脂質(zhì)氧化的指示物可能對(duì)肉品的整體風(fēng)味作用巨大[15]。含硫化合物是含硫氨基酸熱降解產(chǎn)生的，在肉中大多數(shù)以很低的濃度存在，但是它們的閾值非常低并且具有重要的感官特性，所以對(duì)肉品風(fēng)味的貢獻(xiàn)很大。此外，茴香腦具茴香的特殊香氣，而萜烯類的D-檸檬烯具有芬芳天然橙香味，留香時(shí)間長，它們可能對(duì)鴨肉的特色氣味也產(chǎn)生重要的影響。

3 結(jié) 論

3.1 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計(jì)法和響應(yīng)面分析法優(yōu)化鴨肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的固相微萃取條件，并采用頂空固相微萃取與氣相色譜聯(lián)用技術(shù)檢測分析鴨肉中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。最佳萃取條件為2.40g，萃取時(shí)間為42.27min，萃取溫度為49.17℃，此時(shí)萃取總峰面積最大，萃取效果最好。實(shí)驗(yàn)過程中選擇鴨肉萃取量為2.4g、萃取時(shí)間42min、萃取溫度49℃。

3.2 鴨肉中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測結(jié)果表明，鴨肉中共檢測出烴類、醛類、醇類、酮類、酯類、萜烯類、呋喃類、含硫化合物等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)27種。

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Optimization of SPME-GC-MS Conditions for Flvour Compounds Determinationin in Duck Meat by Response Surface Analysis

WANG Wu，ZHA Fu-ben，ZHANG Jing，SHEN Jun-chen，REN Zhi-wei
(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

To lay a foundation for the accurate determination of the flour compounds in duck leg meat by solid-phase microextraction (SPME) and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS), the optimization of the SPME conditions affecting the total ion current chromatographic peak area of duck meat extract was investigated using single factor and response surface methodology based on Box-Behnken central design. The optimal extraction conditions were obtained as follows: sample load 2.4 g and extraction temperature 49 ℃ for an extraction duration of 42 min. Totally 27 volatile flavor compounds were identified in duck meat. They were aldehydes, ketones and N-, S-, O containing and heterocyclic compounds.

duck meat；SPME/GC-MS；flavor compounds；Box-Behnken design；response surface methodology

TS207.3

A

1002-6630(2010)20-0329-06

2010-07-08

安徽省科技攻關(guān)重大項(xiàng)目(08010301080)

王武(1968—)，男，副教授，主要從事畜禽食品加工與副產(chǎn)物利用研究。E-mail：ww68@163.com