蛋白親環(huán)素D基因功能研究進展

胡威，祝恒成，李浩勇，劉修恒，曾艷

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科，武漢 430060)

蛋白親環(huán)素D(cyclophilin D，CypD)是由順-反異構(gòu)酶F基因編碼的線粒體基質(zhì)蛋白，為一種肽基脯氨酰異構(gòu)酶和可溶性蛋白，是線粒體親環(huán)蛋白基因家族的成員[1]，CypD由兩層膜包被，直徑 0.5～1.0 μm，為紡錘狀或棒狀，需使用電子顯微鏡識別。線粒體是細胞中制造能量的結(jié)構(gòu)，同時是細胞進行有氧呼吸的主要場所，被稱為細胞的發(fā)動機，與細胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)平衡相關(guān)。關(guān)于線粒體早期的研究主要涉及細胞凋亡，線粒體內(nèi)膜外側(cè)的外周蛋白細胞色素C能介導(dǎo)細胞凋亡，而細胞色素C為可溶性蛋白，易于獲得結(jié)晶，且研究方法較簡單方便，因此細胞色素C是目前研究較透徹的凋亡基因。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)線粒體與“壞死”——細胞死亡的另外一種途徑密不可分，其中涉及線粒體的另一個重要結(jié)構(gòu)，即線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)，而CypD是MPTP的調(diào)控開關(guān)[2]。CypD結(jié)合于MPTP的腺苷酸轉(zhuǎn)位子上，是一種肽基脯氨酰異構(gòu)酶，定位于10q22～10q23，信使RNA全長2 213個堿基，編碼207個氨基酸[3]。目前國內(nèi)外關(guān)于CypD功能的研究已開展20余年，對CypD的功能已有了比較詳細和全面的認識，現(xiàn)就CypD基因功能的研究進展予以綜述。

1 CypD與缺血再灌注損傷

早在2005年，兩個獨立的研究小組使用當時最先進的基因敲除技術(shù)，將實驗小鼠的CypD基因敲除，得到的CypD基因敲除小鼠對心臟的缺血再灌注損傷有顯著的抵抗作用，且得到的CypD基因敲除小鼠未表現(xiàn)其他生理和病理異常，該研究成果發(fā)表于同年3月的《Nature》雜志，并得到了線粒體研究領(lǐng)域權(quán)威專家Halestrap教授的認可；同時，研究人員從CypD基因敲除小鼠的心、肝、腦等重要器官中分離出線粒體，電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)這些線粒體在形態(tài)上完全無異常表現(xiàn)，但對過量Ca2+導(dǎo)致的線粒體腫脹和通透性轉(zhuǎn)換具有了抵抗作用[4-5]。此后，有研究表明，CypD基因敲除對缺氧誘導(dǎo)的正常大鼠腎細胞壞死途徑的細胞死亡有抵抗作用；此外，通過慢病毒載體等分子生物學(xué)技術(shù)下調(diào)CypD的表達對大鼠腎缺血再灌注損傷具有保護作用[6-7]。而下調(diào)CypD的表達在心、腦、肺等重要器官缺血再灌注損傷中的保護作用也得到了驗證，2005年前的研究提示，CypD可能是通過調(diào)節(jié)腺苷酸轉(zhuǎn)位子的功能，抑制細胞凋亡，從而發(fā)揮作用[4-5，7-12]，即細胞凋亡→細胞死亡通路；2005年后，關(guān)于CypD基因的作用機制逐漸清晰起來，CypD的過表達能直接促進線粒體MPTP的開放，從而導(dǎo)致線粒體通透性的轉(zhuǎn)變，線粒體的通透性增加后，細胞對外界刺激誘導(dǎo)細胞壞死的敏感性將增加，常見的外界刺激有一氧化氮和一些化療藥物等[6，13-20]。而常用的凋亡誘導(dǎo)劑羰基氰化物間氯苯腙在該過程中卻沒有任何作用，甚至還產(chǎn)生了抑制，說明細胞壞死過程與CypD誘導(dǎo)的線粒體通透性改變有密切關(guān)系[17-20]。此外，雖然CypD基因敲除的小鼠在發(fā)育上無異常，但體外實驗表明，正常小鼠和CypD基因敲除小鼠的CypD基因在細胞水平的差異有統(tǒng)計學(xué)意義；且由于CypD基因已被敲除，環(huán)孢菌素A(cyclosporin A，CsA)對CypD基因敲除小鼠無效[21-23]。但卻對活性氧類及Ca2+超載誘導(dǎo)的細胞壞死產(chǎn)生了抵抗，細胞壞死過程受到抑制后減慢，而細胞凋亡的過程卻無異常變化[24-27]。

此外，動物實驗發(fā)現(xiàn)，CypD基因敲除小鼠能抵抗缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷，減少心肌壞死；反過來，用慢病毒過表達載體將轉(zhuǎn)基因小鼠的CypD基因過表達，實驗動物則會出現(xiàn)心肌肥大并伴有心肌細胞功能下降，體外實驗觀察到心肌細胞壞死增加，并伴有線粒體的異常腫脹[9]。在大鼠腎缺血再灌注損傷模型中，通過小干擾RNA或慢病毒載體下調(diào)CypD基因表達能對大鼠腎缺血再灌注損傷產(chǎn)生抵抗[6]。結(jié)合以上這些數(shù)據(jù)得出結(jié)論：CypD誘導(dǎo)的線粒體通透性轉(zhuǎn)變不再單純的是細胞色素C通路介導(dǎo)的細胞凋亡，還介導(dǎo)了一種調(diào)節(jié)性壞死，即Ca2+超載和氧化損傷等外界因素誘導(dǎo)的細胞壞死[28-29]。

2 CypD與氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激的定義是指體內(nèi)氧化與抗氧化兩者失衡，氧化強于抗氧化，機體傾向于被氧化，體內(nèi)高活性分子(如活性氮自由基與活性氧自由基)產(chǎn)生過多，氧化程度超出了氧化物的清除速度，從而導(dǎo)致組織損傷[30-31]。近年來，研究人員對抗氧化治療的研究取得新進展，提出了“氧化應(yīng)激干擾”的新觀點[32]。氧化應(yīng)激干擾是指機體在健康或亞健康狀態(tài)時，體內(nèi)老化的舊細胞及已發(fā)生變異的細胞(如腫瘤細胞)通過氧化應(yīng)激被清除掉，并排出體外，這樣機體的內(nèi)環(huán)境才能保持平衡，并維持在一種有序、健康的狀態(tài)，此時氧化應(yīng)激的作用是積極、正面的，相當于機體的自我修復(fù)過程[33-34]。也可以這樣講，氧化應(yīng)激是一種生物體的自我保護及自我更新的有效手段，這是生物體經(jīng)過長期發(fā)展、進化及自然選擇所獲得的。

但是，如果生物體內(nèi)的這種正常秩序被一種或多種原因破壞，比如，當外源物(如細菌、病毒等微生物)侵入時，生物體的第一反應(yīng)往往是啟動異源物代謝，此時產(chǎn)生大量的活性氧自由基，氧化應(yīng)激隨即啟動，將侵入的微生物過氧化，從而殺死并清除這些外源物[35]。此過程一般都會使機體產(chǎn)生過量的活性氧類及其副產(chǎn)物，暫時處于窗口期，如外源物過多，超出氧化應(yīng)激清除能力，就會產(chǎn)生過量的活性氧類，過量的活性氧類對機體有害，它會產(chǎn)生大量變性蛋白質(zhì)及脂質(zhì)等，會造成循環(huán)異常，并同時誘導(dǎo)代謝，甚至改變基因表達，造成機體相關(guān)功能異常，導(dǎo)致機體內(nèi)處于進一步無序的狀態(tài)[36]。

當生物體氧化劑和抗氧化劑不平衡時，氧化應(yīng)激水平會大幅升高，在窗口期內(nèi)，僅處于量變階段，不會造成器質(zhì)性的病變，生物體也不會有任何異常表現(xiàn)，即“亞健康”狀態(tài)，當氧化和氧化劑繼續(xù)失衡，超出了氧化應(yīng)激窗口期后，生物體將會出現(xiàn)器質(zhì)性病變[33-36]，即病理狀態(tài)。研究表明，氧化應(yīng)激窗口期依然涉及Ca2+內(nèi)穩(wěn)態(tài)及線粒體通透性轉(zhuǎn)化等關(guān)鍵步驟，CypD基因作為線粒體MPTP的開關(guān)及線粒體的重要組成部分起著重要作用，在體外實驗中，隨著氧化應(yīng)激強度的增加或作用時間延長，正常人類腎小管上皮細胞壞死明顯增加[36]。應(yīng)用小干擾RNA直接下調(diào)細胞CypD基因的表達，或使用CypD抑制劑CsA均能有效減少氧化應(yīng)激對正常人腎小管上皮細胞的損傷，而氧化應(yīng)激誘發(fā)人腎小管上皮細胞的壞死過程依賴于CypD[28-29，35]。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)，缺血組織發(fā)生再灌注時，組織同時也會產(chǎn)生大量的過氧化氫，過量的過氧化氫反過來會介導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細胞損傷及死亡，將組織損傷的過程加速，這說明缺血再灌注損傷和氧化應(yīng)激兩者之間有著某種聯(lián)系，可以相互促進，導(dǎo)致組織損傷加重，細胞迅速壞死[26，29]。但CypD在氧化應(yīng)激窗口期發(fā)揮的作用，具體機制目前并未完全研究清楚，它具體是僅通過線粒體途徑調(diào)控細胞壞死來發(fā)揮作用，還是直接通過抗氧化來逆轉(zhuǎn)組織的過氧化狀態(tài)，或是以上兩種作用兼而有之，還需進一步研究證實[36]。

3 CypD與腫瘤的關(guān)系

關(guān)于CypD基因功能的研究，早期僅局限于缺血再灌注損傷及氧化應(yīng)激等生理過程，僅認為CypD主要通過調(diào)節(jié)MPTP通透性或腺苷酸轉(zhuǎn)位子的功能來發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞壞死或細胞凋亡的作用[19，21]。隨著對CypD基因功能研究的深入，CypD與腫瘤的關(guān)系逐漸成為最近5年研究的熱點，但并未發(fā)現(xiàn)小鼠器官出現(xiàn)腫瘤改變，僅為心肌細胞中的線粒體的異常膨脹[37-38]。進一步研究表明，CypD基因的表達在人類腎癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、乳腺癌細胞中均出現(xiàn)了特異性的改變，主要機制目前有如下幾種解釋：①從分子生物學(xué)角度理解，腫瘤本質(zhì)是細胞的過度增殖，早期研究表明，CypD可通過下調(diào)細胞凋亡而促使腫瘤的發(fā)生，主要還是通過調(diào)控MPTP的開放，通過調(diào)節(jié)Ca2+通道介導(dǎo)的激活來調(diào)節(jié)凋亡，此過程中細胞器內(nèi)相關(guān)的離子平衡會打破，導(dǎo)致細胞器腫脹，進而導(dǎo)致細胞外膜破裂和線粒體釋放促凋亡因子，從而控制細胞死亡過程，導(dǎo)致細胞過度增殖，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展，在整個過程中CypD調(diào)節(jié)MPTP的開放是一個重要的步驟[5-6]。②隨著研究的繼續(xù)深入，研究人員發(fā)現(xiàn)，CypD導(dǎo)致線粒體功能改變時，將協(xié)同刺激產(chǎn)生活性氧自由基，并激活c-Jun 氨基端激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而c-Jun氨基端激酶能配合致癌基因Ras抑制 Hippo信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致致癌基因上調(diào)，促進腫瘤的發(fā)展[37-38]。另外，有研究者發(fā)現(xiàn)了一個新的介導(dǎo)腫瘤細胞死亡的機制(不同于通過單純的調(diào)節(jié)CypD的表達導(dǎo)致MPTP開放)，即某些基因(如哺乳動物不育系20樣激酶1)可通過與CypD結(jié)合形成大分子蛋白復(fù)合物直接改變MPTP的結(jié)構(gòu)，研究人員用化療藥物吉西他濱刺激哺乳動物不育系20樣激酶1基因，哺乳動物不育系20樣激酶1與CypD組成的大蛋白復(fù)合物在線粒體上被檢測到；同時，使用CypD抑制劑CsA阻止大蛋白復(fù)合物的形成，可以抑制吉西他濱誘導(dǎo)的細胞死亡，表明CypD基因可能決定吉西他濱的耐藥[38-39]。③還有研究表明了CypD是同時通過下調(diào)細胞凋亡和調(diào)節(jié)細胞壞死兩組途徑來促使腫瘤發(fā)生的，且主要是通過胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信號通路來發(fā)揮作用[40-46]。CypD誘導(dǎo)的腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)組織細胞壞死和凋亡均過度表達，CypD蛋白的下調(diào)抑制了腎癌細胞的凋亡及壞死，促進了細胞周期蛋白的發(fā)展，導(dǎo)致細胞過度增殖[44]?；贑ypD對MPTP開放的調(diào)控作用，CypD過表達誘導(dǎo)線粒體膜電位去極化。提示CypD表達下調(diào)抑制了MPTP的開放，促進了ccRCC的發(fā)展。

來自人類ccRCC組織標本的主要免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)顯示，與癌旁組織相比，ccRCC中的CypD蛋白表達顯著降低，并且觀察到CypD表達與腫瘤分期、大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性，表明CypD表達與ccRCC的發(fā)展呈負相關(guān)[44]。細胞系中CypD的表達也下調(diào)。研究表明，索拉非尼(治療轉(zhuǎn)移性ccRCC的二線藥物)能上調(diào)腎癌細胞中CypD的表達，同時對體外培養(yǎng)的ccRCC細胞株具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡和線粒體膜電位去極化的作用[44]。CypD抑制劑(CsA)和小干擾RNA-CypD逆轉(zhuǎn)了索拉非尼對ccRCC細胞增殖、凋亡和線粒體膜電位去極化的影響，表明索拉非尼的抗腫瘤作用與CypD通過線粒體途徑誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)[44-45]。來自CypD組織的主要免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)顯示，與癌旁組織相比，ccRCC中ERK蛋白表達顯著增加，且ERK和CypD的表達呈負相關(guān)[44]。體外研究表明，ERK可以負調(diào)控CypD的表達，促分裂原活化的蛋白激酶激酶1/2及其下游ERK的去磷酸化介導(dǎo)ccRCC的凋亡[42-45]。這些結(jié)論提示，ERK的激活抑制了介導(dǎo)MPTP開放和誘導(dǎo)ccRCC凋亡的CypD的表達，同時pcDNA3.1-ERK (ERK激活物)的過度表達能抑制索拉非尼對CypD表達的刺激作用，從而誘導(dǎo)腎癌細胞凋亡和線粒體膜電位去極化[46-49]。這些結(jié)果表明，CypD是通過ERK信號通路途徑介導(dǎo)索拉非尼對抗ccRCC的作用，同時也支持CypD是索拉非尼的一個抗癌藥物靶點[44-49]。

4 小 結(jié)

CypD是細胞器線粒體的重要組成部分，CypD功能的研究大致上經(jīng)歷了三個階段。第一階段，認為CypD基因主要是通過干擾細胞凋亡介入線粒體途徑的細胞死亡；第二階段，認為CypD主要是通過線粒體途徑的調(diào)控性細胞壞死發(fā)揮抗氧化應(yīng)激及器官缺血再灌注損傷等過程，不是簡單的調(diào)控細胞凋亡；第三階段：CypD基因功能進一步延伸至多種腫瘤，且CypD基因可通過干擾凋亡及調(diào)節(jié)性壞死在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。同時CypD基因是某些抗癌化療藥物的靶點(吉西他濱、索拉非尼等)。