川南山地黃牛瘤胃微生物多樣性分析方法

宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川宜賓644003

川南山地黃牛產(chǎn)于四川盆地南部邊緣山區(qū)，性情溫順，役力強，其體軀較小，體質(zhì)緊湊結(jié)實，前驅(qū)開闊，胸深，肩峰較高，背腰較寬。四肢較高，毛色以黃色居多。放牧以天然牧草為主，補飼以當(dāng)?shù)刂鳟a(chǎn)的玉米等青粗飼料為主，舍飼以當(dāng)?shù)鼗手癫?、象草、黑麥草、農(nóng)作物秸稈或其調(diào)制的青貯飼料、氨化飼料為主。反芻動物瘤胃是一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，包含了多種未知的微生物，按照Woese 等[1-2]的現(xiàn)代分類方法瘤胃微生物分屬細菌、古生菌（產(chǎn)甲烷菌）和真核生物（真菌和原蟲）3個域。瘤胃內(nèi)的微生物數(shù)量巨大、種類繁多，主要包括原蟲（超過25屬，其數(shù)量為104～106個/mL）、真菌（103～105個真菌孢子/mL，6個屬）、細菌（200種，活菌數(shù)高達1 011個/mL）、古生菌（5個屬，7個種）和噬菌體（顆粒數(shù)可達107～109個/mL）等，它們的共同作用是降解植物的細胞壁。川南山地黃牛瘤胃內(nèi)的微生物通過相互協(xié)同作用，將飼料快速降解轉(zhuǎn)化成動物所需的營養(yǎng)和能源物質(zhì)，瘤胃功能的健康與否直接決定本身的健康，微生物對瘤胃的消化代謝十分重要。近年來，微生物多樣性的研究方法是一個相對熱門的話題，準確地分析測定微生物群體的類型和數(shù)量，對瘤胃消化代謝體系作用機理相當(dāng)重要。本文就川南山地黃牛反芻動物瘤胃微生物多樣性分析方法進行簡述。

1 瘤胃微生物的傳統(tǒng)研究法

1.1 亨氏滾管法

亨氏滾管法是最常用的厭氧培養(yǎng)方法，該技術(shù)是應(yīng)用于洋酒瘤胃厭氧微生物的一種厭氧培養(yǎng)技術(shù)，可用于微生物的分離和鑒定，也可用于活菌培養(yǎng)計數(shù)?？梢垣@得瘤胃微生物的特定生長因素、代謝產(chǎn)物等信息，掌握瘤胃細菌及真菌的數(shù)量。通過此培養(yǎng)技術(shù)可以研究瘤胃微生物的多樣性，但是還是存在局限性，反芻動物瘤胃微生物大多是厭氧菌，在試驗時保持絕對厭氧環(huán)境不容易做到，能純培養(yǎng)出的瘤胃微生物是有限的，而且工作量大，測定結(jié)果與實際存在偏差。

1.2 最大或然數(shù)計數(shù)法

根據(jù)菌種特點采取最大或然數(shù)法（MPN 法）用于一些特殊功能菌的計數(shù)，將待測樣品進行稀釋，稀釋到少量的稀釋液接種到新鮮培養(yǎng)基中沒有或極少出現(xiàn)生長繁殖[3]。MPN 法對液相和固相中的真菌均能可靠記數(shù)，對產(chǎn)生游動孢子少的厭氧真菌的記數(shù)更適用，但不能對微生物進行分離研究，導(dǎo)致結(jié)果過高地估計瘤胃菌群的數(shù)量。

2 瘤胃微生物的分子生物學(xué)研究法

2.1 變性梯度凝膠電泳（DGGE）

變性梯度凝膠電泳技術(shù)是不需要進行體外瘤胃微生物培養(yǎng)，直接利用微生物樣品中的DNA或RNA對微生物群體加以區(qū)別，快速、準確地鑒定微生物種群的核酸變異檢測的電泳技術(shù)[4]。容易鑒定出傳統(tǒng)方式難以培養(yǎng)的微生物種類，極少量微生物樣品經(jīng)PCR擴增后，也可檢測分離得出，結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好?？梢岳肈GGE技術(shù)以川南山地黃牛與國外肉牛品種的瘤胃微生物群體的基因組DNA為研究對象，來了解其瘤胃中各種微生物的多樣性。應(yīng)用DGGE技術(shù)檢測堿基突變時，需依賴于測序技術(shù)。

2.2 溫度梯度凝膠電泳（TGGE）

TGGE是一種DNA指紋圖譜技術(shù)，常與PCR聚合酶鏈式反應(yīng)的DNA擴增技術(shù)結(jié)合，基于DNA基因信息的現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，利用不同分子在溫度改變下構(gòu)象差別進行分離[5]。利用NDA及RNA對微生物遺傳特性進行表征，避免傳統(tǒng)的菌種分離，還可鑒定出無法利用傳統(tǒng)方法分離出來的菌種。TGGE可用于研究瘤胃微生物細菌群落或特殊種群的遺傳多樣性，而無需作進一步的細菌個體特征分析。當(dāng)GC含量不同的堿基序列DNA雙鏈解鏈時需要不同的溶解溫值，DNA雙鏈一旦解鏈，其在凝膠中的電泳速度將會急劇下降，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長度的DNA片段能夠被區(qū)分開，但同樣長度的DNA片段在膠中的遷移行為一樣，因此不能被區(qū)分。當(dāng)然，TGGE在用分子生物學(xué)方法分析微生物群落結(jié)構(gòu)組成時，有很多偏差。不同細菌的基因組大小和核糖體RNA拷貝數(shù)不同；提取基因組總DNA時細胞的裂解效率不同；DNA提取和純化時有偏差；PCR擴增過程中有偏差。

2.3 宏基因組技術(shù)

采取16 SrDNA測序技術(shù)用來研究胃腸道細菌的生態(tài)和進化問題，此分析法是將PCR擴增的環(huán)境微生物樣品總DNA的rRNA片段(或其他標(biāo)記基因)克隆進合適的載體，構(gòu)建克隆文庫以分離不同的序列，然后對分離的序列采用測序技術(shù)或PCR/RFLP進行定性分析。建立了一種可同時分析細菌、古菌16SrRNA基因及原蟲18SrRNA基因、真菌核糖體間隔區(qū)基因的方法，避免對非目標(biāo)DNA測序，分辨率較高。但因成本高，工作量大，分析時間長，不適合對微生物群落結(jié)構(gòu)變化進行動態(tài)跟蹤研究。

2.4 熒光原位雜交（FISH）

熒光原位雜交在微生物系統(tǒng)發(fā)育、微生物診斷和環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)研究中應(yīng)用較多，生產(chǎn)中可用于未克隆基因或遺傳標(biāo)記、染色體變異、基因突變、基因拷貝數(shù)變化的檢測。

FISH是將細胞原位雜交技術(shù)和熒光技術(shù)有機結(jié)合而形成的新技術(shù)，基本原理用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸可用于已知基因或序列的染色體定位。FISH技術(shù)關(guān)鍵是核酸探針的制備，微生物樣品必須先經(jīng)過打碎、離心、清洗等處理步驟，使微生物細胞與雜質(zhì)分離、除去雜質(zhì)、收集細胞[6]，然后對收集的樣品進行固定和預(yù)處理，保證探針順利進入與DNA或RNA雜交。測定過程中能保持細胞形態(tài)完整，細胞不被破壞，能真實反映反芻動物瘤胃環(huán)境下微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)及分布狀態(tài)。此技術(shù)必須依賴寡聚核苷酸探針的特異性，易出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，靈敏度低于PCR技術(shù)，只能針對某一已知的特定菌種，不適用于未知微生物菌種的鑒定。

2.5 末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）

末端限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(T-RFLP)是以熒光標(biāo)記引物PCR為基礎(chǔ)，根據(jù)末端限制性片段長度區(qū)分出微生物群體組成的一種微生物群體圖譜法，可以定性與定量分析微生物群落。T-RFLP技術(shù)以分子系統(tǒng)學(xué)原理為基礎(chǔ)，綜合運用了PCR、限制性酶切、熒光標(biāo)記和DNA序列分析等技術(shù)，通過對特定核酸片段長度多態(tài)性的測定來分析微生物群落結(jié)構(gòu)和功能[7]。T-RFLP技術(shù)不需要培養(yǎng)的微生物群落，恰好彌補了絕大多數(shù)瘤胃微生物不可培養(yǎng)缺點，具有分析面廣、分辨率高、重復(fù)性好、快速簡便等優(yōu)點。T-RFLP技術(shù)是將不同的細菌種群經(jīng)一個特定引物—酶組合處理后，可產(chǎn)生相同的末端限制性長度片段，依賴于使用限制性內(nèi)切酶來檢測16S rRNA基因的序列多態(tài)性，可能不只對應(yīng)一個菌種，造成對群落多樣性的低估和對復(fù)雜群落多樣性的低估。

2.6 基因芯片技術(shù)

基因芯片又稱生物芯片，基因芯片技術(shù)是基于核酸互補雜交原理研制的新一代的核酸雜交技術(shù)，根據(jù)雜交信號進行定性與定量分析，具有高密度、平行分析、雙色測定和低背景值等特點，廣泛應(yīng)用于復(fù)雜的微生物群落全面的和定量的研究。在微生物群落與多樣性研究中，多采用寡核苷酸芯片、群落基因組芯片及宏基因芯片，可以了解微生物在環(huán)境中的功能活動和對群落的特定功能進行定性。因為基因芯片能夠同時平行分析數(shù)萬個基因，進行高通量篩選與檢測分析，解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)操作復(fù)雜、自動化程度低、檢測目的分子數(shù)量少等不足。

3 結(jié) 語

川南山地黃牛是典型的地方牛品種，對四川、重慶偏南部山區(qū)的氣候條件和較粗放的飼養(yǎng)管理，有良好的適應(yīng)能力。在改善飼養(yǎng)管理的條件下，可向役肉兼用型發(fā)展。要養(yǎng)好川南山地黃牛，必須要先養(yǎng)好瘤胃微生物，對瘤胃微生物多樣性分析顯得尤為重要，可以充分發(fā)揮其生長性能，生產(chǎn)中可以根據(jù)需要選擇瘤胃微生物的傳統(tǒng)研究法、瘤胃微生物的分子生物學(xué)研究法。