p75NTR在牙發(fā)育與組織再生領(lǐng)域中的研究進展

李適廷，余 俠，溫秀杰

西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科（四川瀘州 646000）

p75NTR（p75 neurotrophin receptor,p75NTR）屬低親和力神經(jīng)營養(yǎng)因子（Neurotrophin , NTs）受體，也是腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor , TNF）受體超家族成員之一。以往研究顯示，p75NTR在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮著非常重要的作用，以膜受體的角色參與調(diào)控神經(jīng)干細胞的增殖、凋亡、遷移等多重生物學(xué)效應(yīng)；此外，在胚胎發(fā)育過程中，p75NTR還參與調(diào)控多種組織的發(fā)生發(fā)育，包括牙齒、脂肪、肝臟等等，而且在不同的干細胞群中或不同的微環(huán)境下，其發(fā)揮的作用完全不同、甚至相反[1-3]。因此，闡明p75NTR 的確切信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制顯得尤為重要。

眾所周知，顱神經(jīng)嵴來源的外胚間充質(zhì)與牙源性上皮相互作用啟動牙齒發(fā)育，因此顱神經(jīng)嵴來源的外胚間充質(zhì)干細胞（Ectomesenchymal stem cells, EMSCs）被認為是牙發(fā)生發(fā)育的始祖干細胞（除牙釉質(zhì)以外）。膜受體p75NTR作為該干細胞群的特異性表面標志物，近年來其在牙發(fā)育和組織再生中的潛在調(diào)控作用受到越來越多學(xué)者的關(guān)注[4]。因此，本文就p75NTR的結(jié)構(gòu)特點和生理功能、參與調(diào)控牙發(fā)育與組織再生的生物學(xué)效應(yīng)和分子機制作一綜述。

1 p75NTR的結(jié)構(gòu)與功能特點

p75NTR基因位于17q12-17q22，包括10個外顯子和9個內(nèi)含子，相對分子質(zhì)量為75 ku，屬于Ⅰ型跨膜受體蛋白，其結(jié)構(gòu)包括信號肽、胞外結(jié)構(gòu)域（ECD）、疏水的跨膜區(qū)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（ICD）[5-6]。p75NTRECD有4個配體結(jié)合部位，富含半胱氨酸重復(fù)序列區(qū)，負責(zé)結(jié)合不同的細胞外因子。疏水的跨膜區(qū)是一條單鏈，含22 個氨基酸分子，與p75NTR的磷酸化有關(guān)。p75NTRICD富含堿性氨基酸，包含3個功能域：①類似與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子( TNF-receptor associated factors, TRAFs)結(jié)合的近膜區(qū)；②Ⅱ型死亡結(jié)構(gòu)域；③位于C末端的突觸后密度蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Postsynaptic density protein, PSD） 。

p75NTR結(jié)構(gòu)相對簡單，與另一個NTs受體——高親和力的酪氨酸激酶受體（Trks）不同，p75NTR屬低親和力NTs受體，與4種神經(jīng)營養(yǎng)因子（神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、NT-3、NT-4）親和力相同，無特異性。作為編碼NGF受體的功能性候選基因，p75NTR基因突變可能與遺傳性感覺和自主神經(jīng)病變（Hereditary sensory and autonomic neuropathies, HSAN）有一定相關(guān)性[7]。而高親和力受體Trks 中，TrkA與 NGF，TrkB與 BDNF、NT-4，TrkC與NT-3呈現(xiàn)特異性結(jié)合[8]。研究顯示，兩個NTs受體p75NTR和Trks關(guān)系密切，p75NTR在調(diào)控多重生物學(xué)效應(yīng)過程中，是否有Trks協(xié)同以及不同的Trks亞型參與協(xié)同，其發(fā)揮的作用完全不同。

（1）p75NTR在TrkA的協(xié)同作用下正向調(diào)控細胞存活與增殖，即p75NTR被NTs激活后，協(xié)同TrkA激活NF-kB通路，從而提升細胞的存活和增殖能力[9]。學(xué)者們根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)了2種p75NTR與TrkA的協(xié)同模式：一種是以經(jīng)典的1:1形成p75NTR-TrkA二聚體，可以增加結(jié)合位點的親和力高達25倍；另一種是p75NTR被NGF激活后釋放配體p75NTR-ICD，后者與TrkA結(jié)合，提高TrkA的親和力。p75NTR-TrkA協(xié)同介導(dǎo)這一的正向調(diào)控細胞增殖作用，可以被p75NTR拮抗劑或TrkA拮抗劑所抑制，進一步證實了這一過程是兩個受體協(xié)同調(diào)控的[8]。

（2）在沒有TrkA的協(xié)同下，p75NTR激活后啟動JNK/Caspase-3通路，調(diào)控細胞凋亡。在細胞凋亡的啟動過程中，細胞核內(nèi)的JNK起著主導(dǎo)作用，具體途徑是：proNGF與p75NTR結(jié)合，激活JNK，從而啟動細胞凋亡進程；而只能激活細胞質(zhì)中JNK的p75的變異體——p341A，盡管能夠引起JNK的磷酸化，但無法激活半胱天冬酶-3(caspase-3)，因此不能引起細胞凋亡[10]。

（3）p75NTR在TrkA協(xié)同下發(fā)揮存活和增殖的正向調(diào)控作用，在沒有TrkA協(xié)同下發(fā)揮細胞凋亡的促進作用，而Trks的另一個亞型——TrkB的協(xié)同作用卻不足以使p75NTR發(fā)揮促細胞存活和增殖的作用。研究顯示，角質(zhì)細胞僅表達TrkB和p75NTR，讓p75NTR的特異性激活劑（不與Trks受體結(jié)合）β-amyloid作用于角質(zhì)細胞，導(dǎo)致細胞增殖活性降低，caspase-3的表達增加，引起細胞凋亡。而pro-NGF和TrkB的拮抗劑均能促進細胞凋亡，表明TrkB負向協(xié)同p75NTR的細胞凋亡作用，但與TrkA不同，不足以逆轉(zhuǎn)p75NTR的細胞凋亡作用，從而表現(xiàn)出細胞存活與增殖的正向調(diào)控作用[11]。

（4）p75NTR被不同的NTs激活后，也呈現(xiàn)出不同的細胞效應(yīng)，例如NGF可以激活p75NTR-TrkA介導(dǎo)的促細胞增殖效應(yīng)，而其他3個NTs則不具備這一功能[8]。另有學(xué)者提出，p75 NTR更容易被NTs前體（pro-NGF、pro-BDNF）激活，而Trks更容易與成熟的NTs（NGF、BDNF）結(jié)合發(fā)揮作用[11]。由此可見，p75NTR在不同的細胞中、與不同的協(xié)同因子結(jié)合，可能會發(fā)揮不同的調(diào)控作用。

2 p75NTR在牙發(fā)育與組織再生中的調(diào)控作用與機制

2.1 p75NTR參與牙發(fā)育啟動

在胚胎發(fā)育過程中，顱神經(jīng)嵴來源的外胚間充質(zhì)干細胞（EMSCs）遷移至上、下頜突，與牙源性上皮相互作用啟動牙齒發(fā)育，轉(zhuǎn)化為牙胚中的牙囊和牙乳頭結(jié)構(gòu)，進而分化為成牙本質(zhì)細胞、成牙骨質(zhì)細胞、牙髓干細胞等多種牙齒組織生成細胞，最終生成除牙釉質(zhì)以外的牙體組織結(jié)構(gòu)[12]。

在人胚胎牙齒過程中，p75NTR廣泛表達于牙本質(zhì)發(fā)生早期階段的上皮和間充質(zhì)來源的細胞內(nèi)，以及圍繞在發(fā)育中牙胚的神經(jīng)纖維內(nèi)；而在牙胚發(fā)育的終末階段，p75NTR表達局限于牙上皮的增殖細胞內(nèi)，在成釉細胞前體/成釉細胞和成牙本質(zhì)細胞內(nèi)表達消失[13]。由此可見，p75NTR在牙源性上皮和間充質(zhì)細胞的增殖與分化中起到重要的調(diào)控作用，而顱神經(jīng)嵴來源的外胚間充質(zhì)干細胞作為研究牙發(fā)育分子生物學(xué)機制的重要載體細胞，在牙齒發(fā)生、發(fā)育過程中也發(fā)揮著不可替代的功能。近年來研究顯示，p75NTR在牙發(fā)育蕾狀期靠近成釉器的間充質(zhì)中高表達，在帽狀初期內(nèi)釉上皮下方的牙乳頭和牙囊中高表達，在鐘狀期上皮-間充質(zhì)相互作用區(qū)域細胞中強表達。這些結(jié)果均表明，p75NTR很可能參與牙發(fā)育初期上皮與間充質(zhì)相互作用[14]。2020年Zhao等[15]報道，p75NTR上調(diào)Dlx1、Msx1的轉(zhuǎn)錄活性。Dlx和Msx基因同屬于homeobox基因，被公認在牙齒發(fā)生、發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[16-17]。有研究報道，Msx1在胚胎11天（E11）牙板間充質(zhì)中存在表達，至帽狀期（E13.5）牙乳頭及牙囊中表達最強[18]。Dlx也被證實在上皮-間充質(zhì)細胞相互作用區(qū)域高表達[19]。Dlx和Msx這一表達模式與前面報道的p75NTR表達模式非常相似，進一步顯示p75NTR可能與牙發(fā)育啟動有關(guān)。另有報道提出黑色素瘤相關(guān)抗原D1（Mage-D1）可能作為p75NTR和Dlx1、Msx1中間橋梁因子，介導(dǎo)牙發(fā)育啟動的調(diào)控，然而確切的分子機制還不清楚，仍需要繼續(xù)深入研究[15,20]。

p75NTR是神經(jīng)嵴源性干細胞的特異性表面標志物[4]，被認為是分離提純這一干細胞的理想受體。2004年Deng 等[21]和2006年Zhang等[22]先后從小鼠的第一鰓弓中、大鼠的頜突組織中分離出該干細胞，顯示了良好的干細胞特性，然而發(fā)現(xiàn)酶消化法培養(yǎng)出來的干細胞群存在較大的異質(zhì)性，在體外進行傳代培養(yǎng)時會主動向平滑肌細胞和成骨細胞分化，因此該干細胞在牙齒組織工程方面的應(yīng)用受到了阻礙。2011年Wen等[23]通過流式分選，獲得了細胞形態(tài)均一的p75+EMSCs，發(fā)現(xiàn)體外擴增十代后的p75+EMSCs增殖能力和表型趨于穩(wěn)定，并未出現(xiàn)上述的分化趨勢，并具有良好的多向分化潛能，認為p75+EMSCs能在體外代表顱神經(jīng)嵴來源細胞，是組織工程化牙齒一個可選擇的種子細胞，對研究牙齒的發(fā)生發(fā)育不失為一個良好的選擇。

2.2 p75NTR參與牙源性干細胞的分化調(diào)控

p75NTR在多種干細胞的分化早期強表達，被認為與干細胞的分化啟動密切相關(guān)。有研究顯示，始胚細胞中不表達p75NTR，當(dāng)始胚細胞發(fā)育成為胚胎干細胞（ES）后，開始表達p75NTR，特別是在未分化的ES中強表達；而隨著ES繼續(xù)分化，p75NTR、TrkA表達下降，并認為p75NTR可能與ES分化啟動密切相關(guān)[24]。體外的成神經(jīng)誘導(dǎo)實驗也證實，p75NTR在成神經(jīng)誘導(dǎo)初期（即6-12小時內(nèi)）高表達，表明p75NTR參與了干細胞的成神經(jīng)分化[25]。牙齒組織工程方面的研究也發(fā)現(xiàn)，p75NTR陽性牙髓干細胞的未分化程度更高，更是始祖的牙源性干細胞，提出p75NTR可能參與調(diào)控牙源性干細胞的分化啟動[26]。Xing等[27]研究發(fā)現(xiàn)，p75+EMSCs呈現(xiàn)出更強的成牙分化能力，與牙源性上皮細胞共培養(yǎng)，其牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1（DMP1）和牙本質(zhì)涎蛋白（DSP）表達明顯增強，Smad4敲除后這一作用顯著下調(diào)，提示p75NTR可能通過Smad4通路調(diào)控EMSCs的成牙分化。Wen等[28]也報道，顱神經(jīng)嵴來源的p75NTR陽性細胞，在牙囊條件培養(yǎng)液和牙本質(zhì)非膠原蛋白的共同誘導(dǎo)下，牙骨質(zhì)結(jié)合蛋白（CAP）、骨涎蛋白 （BSP）和DSP表達顯著增強，呈現(xiàn)出成牙骨樣細胞分化。此外，Nie等[29]報道，p75+EMSCs經(jīng)誘導(dǎo)可向骨骼肌細胞分化，顯示出較強的跨組織分化能力。

另有研究報道，在人乳牙牙髓干細胞中p75NTR會抑制成骨、成脂、成軟骨和成肌分化能力[26]，但卻能促進人恒牙牙髓干細胞的成骨和成脂能力[30]。也有研究顯示，通過單一受體p75NTR分選出的人恒牙牙髓干細胞亞群的神經(jīng)分化能力降低，說明p75NTR抑制牙髓干細胞的神經(jīng)分化[31]。以上結(jié)果表明，p75NTR對于牙源性干細胞分化具有重要的調(diào)控作用，且作用形式多樣。近年來，也有學(xué)者開始關(guān)注p75NTR在牙周膜干細胞的調(diào)控作用與機制，認為p75NTR可能通過ITGA1正向調(diào)控牙周膜干細胞的成骨分化，但確切分子機制仍需要進一步深入研究[32]。因此，目前為止還不能完全揭示p75NTR在牙源性干細胞中的調(diào)控作用與機制。

2.3 p75NTR參與礦化調(diào)控

生物礦化的巧妙是數(shù)十億年進化的結(jié)果，牙齒作為人體中最堅硬的器官，被認為是生物礦化原理與機制研究最好的模型。牙齒硬組織的完美結(jié)構(gòu)搭建和生物礦化機制一直是近年來的研究熱點。劉暢等[33]觀察大鼠胚胎下頜磨牙發(fā)育初期p75NTR和RUNX2 時空表達，發(fā)現(xiàn)在牙齒發(fā)生、發(fā)育過程中，p75NTR呈現(xiàn)出與礦化因子RUNX2相似的表達規(guī)律與分布特點。鞠迎新等[34]發(fā)現(xiàn)p75NTR參與了大鼠EMSCs的礦化過程，并且發(fā)現(xiàn)在E18.5 d時p75NTR表達量最高，礦化能力最強。王瑩瑩等[35]基于p75NTR敲除小鼠研究報道，p75NTR基因敲除會使小鼠股骨礦化形成能力降低，并提出p75NTR參與調(diào)控小鼠股骨礦化成骨的能力可能與NGF的結(jié)合有關(guān)。

MikamiY 等[26]發(fā)現(xiàn)，p75NTR陽性牙髓干細胞的未分化程度更高，p75NTR的表達與礦化因子 Runx2、OSX、ALP、BSP 負相關(guān)，并提出 p75NTR 調(diào)控牙齒礦化與 Trks受體無關(guān)。這一主張與 Yang K 等[20]報道一致，即p75NTR 調(diào)控 EMSCs 礦化與其傳統(tǒng)的協(xié)同因子 TrkA無關(guān)，推測可能通過新的橋梁因子Mage-D1參與牙發(fā)育調(diào)控；但不同的是，Yang K 等認為 p75NTR 正向調(diào)控 EMSCs 礦化。并且，近來有研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR與礦化相關(guān)標志物ALP、Col-1和Runx2的表達呈正相關(guān)，隨著牙胚發(fā)育成熟表達逐漸增強，認為p75NTR可能在牙齒形態(tài)發(fā)生，特別是硬組織形成過程中起到重要的調(diào)控作用[35]。Li等[36]報道，在EMSCs的礦化誘導(dǎo)過程中，過表達p75NTR可能促進核內(nèi)β-catenin表達；提出Wnt/β-catenin通路參與調(diào)控這一過程。Wang等[37]研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR敲除小鼠的 EMSCs的 PI3K/Akt/β-catenin出現(xiàn)下調(diào)，提出p75NTR通過PI3K/Akt/β-catenin通路正向調(diào)控EMSCs的礦化。兩個學(xué)者均提出β-catenin是p75NTR參與牙發(fā)育礦化調(diào)控的關(guān)鍵因子。另有研究報道，下調(diào)COST的表達，可增強p75NTR在EMSCs礦化過程中的正向調(diào)控作用[38]。目前，p75NTR參與牙發(fā)育礦化調(diào)控機制研究仍處于起步階段，仍需要進一步研究和揭示。

2.4 p75NTR參與時鐘節(jié)律調(diào)控

牙齒硬組織發(fā)育開始于釉牙本質(zhì)界髓角處，之后節(jié)律性地向頸部及頜面發(fā)育，即每天形成定量的一層基質(zhì)，再礦化形成硬組織，并在牙齒硬組織中留下了節(jié)律性痕跡，即牙釉質(zhì)中的釉柱橫紋、內(nèi)線、芮氏線、釉板等[39]，牙本質(zhì)中的馮·埃布納線[40]，牙骨質(zhì)中的纖維牙板[41]。Zheng L 等[42]在牙囊組織中發(fā)現(xiàn)四種主要的生物鐘基因 BMAL1、Clock、Per1、Per2 均有表達，進一步證實牙齒硬組織生成的時鐘節(jié)律特性。Baeza-Raja B等[43]研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR 啟動子上的保守非經(jīng)典 E-box 中存在與時鐘節(jié)律因子Clock/Bmal1 二聚體的結(jié)合位點，即1 039 位點；血清休克實驗顯示，在視交叉上核、外周組織中p75NTR的震蕩性與生物鐘基因 per1、per2 相一致，進而基于模式動物發(fā)現(xiàn)，p75NTRExIII-/-敲除小鼠的視交叉上核、肝臟組織中per1、per2 的生物節(jié)律性消失，認為p75NTR的生物節(jié)律表達受CLOCK/BMAL1二聚體調(diào)控（BMAL1 單獨不能調(diào)控）、進而影響生物節(jié)律基因Per1、Per2、Rev-Erba等的表達。楊琨等[44]研究報道，p75NTR 在牙胚來源的EMSCs 中也存在節(jié)律性表達，并且震蕩模式與其配體NGF及時鐘節(jié)律相關(guān)基因 per1、per2相一致，表明p75NTR在牙發(fā)育相關(guān)組織中存在時鐘節(jié)律性表達特點。Zhao等[18]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)p75NTRExIII-/-敲除小鼠的切牙每日礦化量顯著低于野生型小鼠和雜合子小鼠。上述研究均提示，p75NTR在牙齒硬組織形成過程中的時鐘節(jié)律調(diào)控方面起著重要作用。

綜上所述，p75NTR作為神經(jīng)嵴源性細胞的表面標記物，不僅可用來分離提純細胞，而且可以膜受體角色參與細胞的多重生物學(xué)效應(yīng)。目前已經(jīng)獲得p75NTR參與牙發(fā)育啟動與礦化調(diào)控的組織學(xué)與分子生物學(xué)證據(jù)，并初步探明其調(diào)控的可能信號機制。然而，p75NTR在牙發(fā)育與組織再生中的作用與信號機制仍需要進一步深入研究。相信隨著研究的不斷深入，p75NTR在牙發(fā)育中調(diào)控作用與信號機制會被相繼發(fā)現(xiàn)和探明，特別是牙齒硬組織周期礦化與節(jié)律生成，這將有助于揭示牙發(fā)育分子機制、推動牙齒組織工程進展。