基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探尋銀芩口服液治療新型冠狀病毒肺炎抑制機制的研究

季士亮，何麗萍，郭東凱，王 威，陳 輝，江翊國，王 誠＊

1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州科技城醫(yī)院臨床藥學(xué)實驗室（江蘇蘇州 215153）

2.蘇州市天靈中藥飲片有限公司（江蘇蘇州 215000）

3.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院（四川瀘州 646000）

2019年在我國湖北武漢新發(fā)的冠狀病毒是一種新型冠狀病毒（SARS-CoV-2），其引起的新型冠狀病毒肺炎（Corona virus disease 2019，COVID-19）給我國和世界其他國家均造成了嚴(yán)重災(zāi)難。截止2020年7月1日，國外確診人數(shù)為1 100多萬，死亡病例530 000多例，我國確診人數(shù)為85 000多例，死亡病例4 600多例。該病毒具有潛伏期長、傳染性強、各類人群普遍易感等特點，感染初期以發(fā)熱、乏力、干咳為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重者出現(xiàn)多器官衰竭，目前尚無特效藥[1]。

由于尚未研制出抗SARS-CoV-2的特效藥及疫苗，然而幾千年來中醫(yī)藥在應(yīng)對各種疫病的治療中都發(fā)揮了積極的作用，尤其近年來在SARS、H1N1流感病毒等防治中，中醫(yī)藥也發(fā)揮了重要作用[2-3]。國家衛(wèi)健委發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》中，不斷強調(diào)加強中西醫(yī)結(jié)合診療COVID-19 模式的構(gòu)建[4]。我國疫情能得到很好的控制，中西醫(yī)結(jié)合治療的模式得到了國外醫(yī)學(xué)者越來越多的重視，同時我國也向全世界積極共享中醫(yī)藥在抗擊新冠疫情中的寶貴經(jīng)驗。

銀芩口服液（原金蟬口服液：蘇藥制字Z04001335）復(fù)方主要由金銀花、黃芩、柴胡、蟬衣等提取物制成的中藥制劑，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒的功效，臨床主要用于感冒、發(fā)熱、咽痛等上呼吸道感染，另外，長期的臨床實踐表明其治療手足口病和小兒合胞病毒感染效果尤為突出[4]。該處方根據(jù)中醫(yī)藥理論，柴胡苦平，入肝膽經(jīng)，透泄與清解少陽之邪，并能疏泄氣機之郁滯，使少陽之邪得以疏散，黃芩苦寒，清泄少陽之熱，柴胡之升散，得黃芩之清降泄，兩者配伍，達(dá)到和解少陽的目的。同時處方中的金銀花、黃芩、柴胡在COVID-19診療中是高頻使用的中藥[5]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接綜合了多個學(xué)科，能綜合的分析藥物-疾病-基因-靶點之間的關(guān)系，具有“多基因、多靶點”的特點[8]。分子對接作為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中預(yù)測中藥有效成分靶點的關(guān)鍵技術(shù)，具有高效、經(jīng)濟(jì)的特點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥領(lǐng)域中[9]。本研究通過計算機輔助藥物設(shè)計對主要活性成分與新型冠狀病毒肺炎關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白進(jìn)行模擬研究，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出銀芩口服液作用靶點進(jìn)行聚類分析，為銀芩口服液抗新型冠狀病毒的藥物開發(fā)和臨床治療提供參考。

1 方法

1.1 銀芩口服液中成分收集與靶點的獲取

根據(jù)復(fù)方中單味藥的拼音名稱從數(shù)據(jù)庫Traditional Chinese Medicine Systems P harmacology Database and Analysis Platform（TCMSP，網(wǎng)址為：http://tcmspw.com/）[10]和a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine（BATMAN-TCM，網(wǎng)址為：http://bionet.ncpsb.org/ batman-tcm/）[11]，分別檢索銀芩口服液各單味藥的化學(xué)成分。以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)在TCMSP數(shù)據(jù)庫中收集“金銀花”“黃芩”“柴胡”“蟬蛻”的有效活性成分以及對應(yīng)靶點。

1.2 靶點蛋白基因名的轉(zhuǎn)換及靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

本研究先將化合物作用靶點通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 UniProt（https://www.uniprot.org/）轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的基因名稱，再利用人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards（https://www.genecards.org/）查詢靶標(biāo)蛋白對應(yīng)的基因名，并通過Cytoscape3.7.2（http://www.cytoscape.org/） 構(gòu)建藥材-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)，分析化合物和靶點互作網(wǎng)絡(luò)。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及聚類富集分析

采用Metascape[12]（http://metascape.org/，veision 3.5）對銀芩口服液的靶點進(jìn)行分析。通過BioGrid, InWeb_IM, OmniPath三個數(shù)據(jù)庫獲取靶點蛋白-蛋白相互作用信息并構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（Protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。采用Molecular Complex Detection （MCODE）算法將靶點進(jìn)行聚類，并對其進(jìn)行GO生物過程分析、GO分子功能分析、GO細(xì)胞成分分析，然后根據(jù)靶點數(shù)量對結(jié)果進(jìn)行排序，保留排名前5位結(jié)果。

1.4 核心靶點通路分析

為了明確銀芩口服液核心靶標(biāo)的功能及在信號通路中的作用，利用R軟件的ClusterProfiler包，設(shè)定閾值P＜0.01，進(jìn)行KEGG信號通路富集分析，得到銀芩口服液活性化合物作用靶點的主要生物功能和通路過程，并利用可視化在線繪圖網(wǎng)站Omishare（tools/index.php/）繪圖。

1.5 成分-靶點分子對接

首先，通過Pocasa數(shù)據(jù)庫預(yù)測活性對接靶點，每個蛋白選擇排名前五的活性位點，進(jìn)行對接。從PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）[13]下載新型冠狀病毒的水解酶蛋白 3CLLpro（PDB ID：6lu7）和 ACE2（PDB ID：1r42）的分子結(jié)構(gòu) PDB 格式文件。運用PyMOL軟件分離原配體，并使用AutoDock 軟件處理蛋白和藥物小分子，保存為pdbqt，并進(jìn)行分子對接。一般認(rèn)為結(jié)合能小于0則配體與受體可以自發(fā)結(jié)合，本研究篩選自由能小于-5的結(jié)果。將與小分子對接中5個活性蛋白位點中最小的結(jié)果使用pymol進(jìn)行處理，最終篩選出與新冠病毒靶點最相關(guān)的化合物。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選

從TCMSP中檢索發(fā)現(xiàn)，銀芩口服液共含有56個活性成分，對應(yīng)不同的靶標(biāo)266個。其中，黃芩31個，金銀花17個，柴胡11個，蟬蛻3個。值得注意的是，銀芩口服液中存在不同中藥含有相同成分的現(xiàn)象。通過venny2.1.0將成分交集結(jié)果可視化（見圖1），得到5個共有成分：山奈酚和槲皮素為柴胡和金銀花所共有；β-谷甾醇和黃烷酮為黃芩和金銀花所共有;豆甾醇為柴胡、金銀花和黃芩三者所共有。銀芩口服液活性成分具體信息見表1。

圖1 銀芩口服液中成分分布Figure 1.Distribution of compounds in YQOL

表1 銀芩口服液主要活性成分Table 1.The main active components in YQOL

表1 銀芩口服液主要活性成分Table 1.The main active components in YQOL

2.2 化合物-靶點互作網(wǎng)絡(luò)

將關(guān)鍵靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建YQOL靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），網(wǎng)絡(luò)模型中共有312個節(jié)點，726條連接。根據(jù)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果，該網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點連接度平均值為12.9，每個靶點平均與2.8個成分相互作用。經(jīng)過 Degree 打分排序，采用“Degree＞2倍中位數(shù)，BC＞中位數(shù)，CC＞中位數(shù)”為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到12個核心成分，被認(rèn)為是銀芩口服液起效的關(guān)鍵所在，其中靶點數(shù)目最多的前7個化學(xué)成分分別是M1-槲皮素、M2-異黃碟呤、M3-山柰酚、M4-豆甾醇、M5-β-谷甾醇、M6-木犀草素、M7-黃芩素，分別能與154、127、68、39、32、28、19個靶點蛋白發(fā)生相互作用。從靶點來看，排名前5位的分別是PTGS1、ESR1、AR、PPARG、GSK3β，它們分別能與50、45、36、33、29個化合物發(fā)生相互作用。

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及聚類富集分析

將 Metascape（http://metascape.org/,veision3.5）中蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）和聚類分析的結(jié)果可視化（圖 3）。PPI網(wǎng)絡(luò)由共226個節(jié)點，930條邊組成，節(jié)點的大小用degree表示，不同的顏色來表示不同的模塊。MCODE聚類分析結(jié)果中，涉及 12個模塊，89個靶點。對上述模塊進(jìn)行GO富集分析，根據(jù)靶點數(shù)目與模塊總靶點數(shù)的比值（靶點占比）進(jìn)行排序，保留靶點占比靠前的 3個生物過程、分子功能、細(xì)胞成分結(jié)果。GO功能富集得到237個生物過程、59個細(xì)胞組成、62個分子功能（見圖 4）。

2.4 銀芩口服液抗SARS-CoV-2靶點的通路分析

通過KEGG通路富集得到66條信號通路，主要有網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)信號傳遞通路、腫瘤相關(guān)通路、cAMP信號通路等，其中網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)信號傳遞通路涉及ADORA3-GRIK1-GABRB3-GABRB2-TACR2-GRIK2；腫瘤相關(guān)通路涉及PIK3CG-AR-BCL2-GSK3β-HIF1A；cAMP信號通路涉及ADCY3-CAMK2G- NFKBIA-GRIN2-RELA-MAPK8，見圖5。

圖2 銀芩口服液中化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)Figure 2.The target network diagram of the compound of YQOL

圖3 銀芩口服液作用靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò) (A) 和聚類分析 (B)Figure 3.Protein-protein interaction network (A) and MCODE analysis (B) for potential targets of YQOL

圖4 銀芩口服液作用靶點GO生物功能富集分析圖Figure 4.GO biological enrichment analysis diagram of YQOL action targets

圖5 銀芩口服液作用靶點KEGG 通路富集分析圖Figure 5.KEGG pathway of YQOL action targets

2.5 銀芩口服液中核心活性與ACE2 和 3CL水解酶的分子對接

一般認(rèn)為，分子對接結(jié)合自由能越小越好，通過多次對比分子對接結(jié)果，得出銀芩口服液中核心活性化合物與SARS-CoV-2 3CL水解酶、ACE2 有較好的結(jié)合活性，分子對接親和力均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于-5.0 kJ/mol，結(jié)果見圖6。

圖6 銀芩口服液中核心活性與ACE2 和 3CL水解酶的分子對接Figure 6.Molecular docking of ACE2 and 3CL hydrolase with YQOL bioactive ingredients

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)分析了名醫(yī)名方銀芩口服液對 COVID-19 的潛在治療機制。從現(xiàn)存中藥數(shù)據(jù)庫獲得了較為全面的化學(xué)成分和靶標(biāo)信息，構(gòu)建并分析中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)模型，結(jié)果顯示中藥復(fù)方銀芩口服液治療COVID-19是通過多成分協(xié)同起效、多靶點共同發(fā)揮抗SARS-CoV-2作用，為探索銀芩口服液抗SARS-CoV-2的藥物開發(fā)和臨床治療提供參考。根據(jù)中醫(yī)理論，COVID-19屬中醫(yī)疫病范疇，病因為感受“疫戾”之氣，癘氣病因是導(dǎo)致瘟疫暴發(fā)的致病因素，基本病機特點為“濕、熱、毒、瘀”，強調(diào)根據(jù)發(fā)病不同地點、不同階段、因人辨證論治，治療初期應(yīng)以清熱化濕解毒為主[7]。經(jīng)方中金銀花辛涼透表，清熱解毒，又具芳香辟穢的功效。蟬蛻質(zhì)輕上浮，善行上焦氣分。黃芩清泄肺火，柴胡發(fā)汗解表，四藥合用，宣降并施，發(fā)表透邪，清熱解毒，溫邪無可藏匿，逐外散而病愈[12]。銀芩口服液集清熱解毒、芳香化濕降濁于一體，但其用于COVID-19的治療尚缺少直接證據(jù)。筆者認(rèn)為，應(yīng)在當(dāng)?shù)噩F(xiàn)有疑是及確診患者中積極開展多中心循證臨床研究。

由于SARS-CoV-2 是新發(fā)現(xiàn)的病毒，目前尚未研制出特效藥，雖然國外有研究稱抗病毒藥瑞德西韋對COVID-19療效顯著[13]，但該藥尚未在任何國家批準(zhǔn)上市，其安全性和有效性也未被證實。而數(shù)千年來中醫(yī)藥在我國應(yīng)對各種疫病中都發(fā)揮著重要作用，本次疫情期間國家衛(wèi)生健康委多次強調(diào)中西醫(yī)聯(lián)合防治COVID-19 的中國模式，并取得了巨大成效。2020年2月24日北京市新型冠狀病毒肺炎疫情防控工作新聞發(fā)布會報道，北京COVID-19中醫(yī)藥治療率總體為87%。在中醫(yī)藥治療患者中，使用中藥湯藥的比例82%，中醫(yī)藥治療總有效率為92%。中醫(yī)藥在我國COVID-19的防治中起到了重要作用，中西醫(yī)結(jié)合治療的優(yōu)勢再次顯現(xiàn)[14]。

目前研究已證實ACE2（羧肽酶生成血管緊張素II）是病毒打開宿主細(xì)胞的“鑰匙”，降低ACE2的表達(dá)可以達(dá)到阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞的作用[15]。因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對銀芩口服液復(fù)方成分進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，并利用分子對接將銀芩口服液中核心活性化合物與SARS-CoV-2 3CL水解酶進(jìn)行對接及與病毒表面受體ACE2酶進(jìn)行對接，從而篩選銀芩口服液中對抗COVID-19的活性成分。研究發(fā)現(xiàn)銀芩口服液中前20個活性化合物與SARS-CoV-2 3CL水解酶的結(jié)合能較為接近，尤其是黃芩素和異黃蝶呤。由于ACE2是2019-nCoV進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵表面受體，對冠狀病毒的感染和傳播能力起著重要作用。所以再次將銀芩口服液核心活性成分黃芩素和異黃蝶呤與ACE2進(jìn)行了分子對接，研究發(fā)現(xiàn)黃芩素和異黃蝶呤與ACE2親和力遠(yuǎn)高于瑞德西韋。靶點網(wǎng)絡(luò)圖顯示銀芩口服液治療COVID-19主要集中在PTGS1、GSK3β、NCOA2、ESR2、ESR1等核心靶點，且大多數(shù)與炎癥反應(yīng)相關(guān)。其中PIK3CG、PTGS1和GSK3β是與肺部最相關(guān)的通路基因。PIK3CG、PTGS1和GSK3β等靶點在抗病毒及在治療肺炎的過程中有重要作用。

綜上所述，銀芩口服液在治療SARSCoV-2抑制機制中具有多靶點、多通路的優(yōu)勢。但中藥的藥效不是其所含化學(xué)成分的簡單加和，中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中通常忽略中藥成分的含量，但含量、濃度對藥效的影響不可忽視[16]。因此，只有將基于網(wǎng)絡(luò)的計算預(yù)測和實驗確證相結(jié)合，對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行生物學(xué)實驗，才能驗證預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠度。