類(lèi)器官在泌尿系腫瘤中的研究進(jìn)展

肖俊文，胡 坤，蘇港林，孫 浩，劉宇辰＊

1.深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院·深圳市第二人民醫(yī)院廣東省泌尿生殖腫瘤系統(tǒng)與合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣東深圳 518000）

2.安徽醫(yī)科大學(xué)深圳市第二人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院泌尿外科（廣東深圳 518000）

3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系（廣東汕頭 515041）

隨著荷蘭的Hans Clevers第一次發(fā)表了關(guān)于類(lèi)器官技術(shù)的文章后[1]，類(lèi)器官技術(shù)作為新興的體外培養(yǎng)技術(shù)得到了重視。這種三維的器官類(lèi)型系統(tǒng)可以從細(xì)胞系、原發(fā)組織、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和胚胎整個(gè)器官（如由多種組織類(lèi)型組成的器官外植體）衍生而來(lái)[2]，具有自我更新和自我組織的能力。類(lèi)器官作為一個(gè)功能單元，可以模仿原始組織，以相似的生物學(xué)行為發(fā)揮病理或生理作用。產(chǎn)生類(lèi)器官的方法多種多樣，在泌尿系腫瘤方面的腫瘤類(lèi)器官研究也不例外。

1 研究背景

1.1 傳統(tǒng)體外培養(yǎng)技術(shù)

泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)癌癥主要為前列腺癌、腎癌及膀胱癌。2018年全球腫瘤年報(bào)中，男性前列腺癌發(fā)病率（所有統(tǒng)計(jì)癌癥病例）為7.1%，居男性癌癥發(fā)病率第二位，其次，膀胱癌及腎癌發(fā)病率居于前十，整體上泌尿系腫瘤在全球發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[3-4]。泌尿系腫瘤研究領(lǐng)域中，科學(xué)家們以單層細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)以及動(dòng)物模型兩種常用腫瘤模型為代表，進(jìn)行了大量的腫瘤生物學(xué)行為研究和試驗(yàn)，但這種腫瘤生物學(xué)研究單純停留在腫瘤細(xì)胞系和動(dòng)物成瘤模型層面，無(wú)法準(zhǔn)確地概括真實(shí)的體外器官系統(tǒng)，且研究中細(xì)胞行為也很容易受到微環(huán)境等外來(lái)因素的影響，例如細(xì)胞外基質(zhì)[5]。

腫瘤細(xì)胞系是用來(lái)了解基因和分子改變?cè)诎┌Y中作用的常用重要手段[6]。自成功開(kāi)發(fā)HeLa細(xì)胞系以來(lái)[7]，癌細(xì)胞系對(duì)于腫瘤發(fā)生的機(jī)理研究以及治療反應(yīng)標(biāo)志物的鑒定具有不可估量的價(jià)值。但腫瘤細(xì)胞系在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)很多額外的突變，不能將腫瘤原有特性很好地表現(xiàn)出來(lái)，也不能模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞和其他基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用，并且體外培養(yǎng)多次的傳代會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞失去異質(zhì)性[8]。

與癌細(xì)胞系模型相比，患者來(lái)源的異種移植（Patient-derived tumor xenograft, PDX）癌癥模型的開(kāi)發(fā)雖然帶來(lái)了一些改進(jìn)，保留了腫瘤異質(zhì)性[9]，但PDX模型仍然具有植入成功率低、不適合高通量篩選及不適合于遺傳研究操作的局限性，這些阻礙了在癌靶向治療中的發(fā)展應(yīng)用。所以傳統(tǒng)的體外2D培養(yǎng)系統(tǒng)技術(shù)成為了高通量組學(xué)研究應(yīng)用于臨床的障礙。

1.2 新興3D類(lèi)器官發(fā)展背景

為了能夠體外模擬腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)的結(jié)構(gòu)關(guān)系及原位組織器官的發(fā)育和功能，三維體外模型系統(tǒng)是一種趨勢(shì)。泌尿系腫瘤可以通過(guò)細(xì)胞系或腫瘤干細(xì)胞等在一定條件下發(fā)育成多種多細(xì)胞實(shí)體，可以與體內(nèi)相似的方式經(jīng)增殖和分化實(shí)現(xiàn)自我更新、自我組織和區(qū)分的功能，進(jìn)而形成類(lèi)似體內(nèi)的腫瘤結(jié)構(gòu)。類(lèi)器官成功應(yīng)用于泌尿外科癌癥的研究可以進(jìn)一步了解這些疾病，創(chuàng)建臨床前癌癥模型，通過(guò)對(duì)個(gè)體患者的樣品進(jìn)行治療性篩選來(lái)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)。例如，源自人多能干細(xì)胞的器官分化使得基因編輯能夠模擬上皮細(xì)胞中的疾病[10]；前列腺癌類(lèi)器官可以幫助鑒定腫瘤起始細(xì)胞來(lái)自上皮細(xì)胞譜系[11]。人體類(lèi)器官培養(yǎng)技術(shù)在腎臟、膀胱和前列腺疾病的基礎(chǔ)和臨床研究中具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值（見(jiàn)圖1）。

圖1 類(lèi)器官模型Figure 1.Organoid model

2 類(lèi)器官在泌尿系腫瘤的研究進(jìn)展

2.1 前列腺類(lèi)器官的技術(shù)發(fā)展

目前對(duì)于前列腺癌的許多遺傳畸變研究很少，對(duì)治療反應(yīng)的影響尚不清楚。這主要與缺乏優(yōu)質(zhì)體外模型系統(tǒng)有關(guān)，而現(xiàn)建立的前列腺癌細(xì)胞系數(shù)量有限（僅有7個(gè)系），不能代表臨床疾病的多種表型[12]。其次，從治療層面來(lái)看，用于藥物篩選、鑒定和開(kāi)發(fā)的傳統(tǒng)二維培養(yǎng)系統(tǒng)可能在藥物劑量、體內(nèi)環(huán)境相互作用的復(fù)雜性和結(jié)果對(duì)臨床的適用性方面存在明顯的缺陷。為解決這兩個(gè)問(wèn)題，前列腺類(lèi)器官的相關(guān)研究進(jìn)展使前列腺癌細(xì)胞在更復(fù)雜和多元的生物培養(yǎng)系統(tǒng)中對(duì)大量前列腺癌細(xì)胞進(jìn)行一致性及持續(xù)性的原代培養(yǎng)[13]。

目前較成熟的前列腺類(lèi)器官模型包括：鼠正常前列腺組織、人正常前列腺組織[13]、前列腺癌患者轉(zhuǎn)移灶樣本以及源于去勢(shì)抵抗性前列腺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞的類(lèi)器官[12]。前列腺癌已經(jīng)證明很難在體外培養(yǎng)，只有七個(gè)公開(kāi)可用的細(xì)胞系。此外，在前列腺癌細(xì)胞系中，許多復(fù)發(fā)性遺傳病灶，例如SPOP突變、FOXA1突變、TMPRSS2-ERG間質(zhì)缺失和CHD1缺失，均未表現(xiàn)出來(lái)。這些遺傳性病變對(duì)前列腺癌也具有高度特異性。這既限制了對(duì)這些遺傳損傷的機(jī)理研究，也限制了它們?cè)谥委煼磻?yīng)中的作用。Yu Chen等[14]使用針對(duì)良性前列腺上皮細(xì)胞優(yōu)化的類(lèi)器官培養(yǎng)系統(tǒng)[13]，成功地建立了七個(gè)前列腺類(lèi)器官系統(tǒng)。他們對(duì)這七個(gè)類(lèi)器官的系統(tǒng)進(jìn)行了詳細(xì)的分子學(xué)表征，發(fā)現(xiàn)類(lèi)器官的組織學(xué)表現(xiàn)與原始腫瘤組織學(xué)高度相似。類(lèi)器官還表現(xiàn)出來(lái)前列腺癌的兩大特征：少量體細(xì)胞突變及大量的拷貝數(shù)改變。這七個(gè)系包含許多前列腺癌典型的復(fù)發(fā)性基因組改變，包括PTEN缺失，TMPRSS2-ERG間質(zhì)缺失，SPOP突變，F(xiàn)OXA1突變和CHD1丟失[12]，轉(zhuǎn)錄組分析表明，這七個(gè)系高度多樣化，概括了去勢(shì)抵抗性前列腺癌的表型多樣性[15]。他們對(duì)腫瘤組織進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序和RNA測(cè)序，并從中獲得了細(xì)胞系。結(jié)果表明，在體外傳代3個(gè)月后，這些細(xì)胞系與腫瘤具有相同的體細(xì)胞突變，并具有相似的轉(zhuǎn)錄組，證實(shí)了培養(yǎng)出的腫瘤類(lèi)器官可以代表體內(nèi)的腫瘤組織。有實(shí)驗(yàn)證明，慢病毒與CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯等技術(shù)也可以在前列腺類(lèi)器官中進(jìn)行[16]，在研究前列腺癌相關(guān)基因方面將發(fā)揮巨大作用?？梢?jiàn)，前列腺癌的腫瘤類(lèi)器官可以很好的還原原位組織的基因型和生物學(xué)特性，也能在基因研究方面發(fā)揮作用，勢(shì)必將成為前列腺腫瘤研究領(lǐng)域的強(qiáng)有力工具。

2.2 腎類(lèi)器官的技術(shù)發(fā)展

腎細(xì)胞癌為異質(zhì)性腎癌，在疾病生物學(xué)、臨床行為、預(yù)后，以及對(duì)全身治療的反應(yīng)方面均不相同。建立患者來(lái)源的腎細(xì)胞癌3D類(lèi)器官培養(yǎng)系統(tǒng)可以克服傳統(tǒng)2D培養(yǎng)系統(tǒng)的缺點(diǎn)，彌補(bǔ)體外細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)患者來(lái)源的異種移植模型之間的差距。

基于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，腎臟類(lèi)器官也已經(jīng)被建立并應(yīng)用于相關(guān)研究[17-18]。Takasato等[17]利用小分子抑制劑CHIR99021改變WNT信號(hào)，成功誘導(dǎo)出人類(lèi)多能干細(xì)胞。由這些細(xì)胞形成的復(fù)合多細(xì)胞腎類(lèi)器官，其具有超過(guò)八種不同的細(xì)胞類(lèi)型，包括由遠(yuǎn)端小管組成的分段腎單位、Henle環(huán)、近端小管和含有頂葉上皮細(xì)胞和足細(xì)胞的囊結(jié)構(gòu)及基質(zhì)細(xì)胞。同時(shí)觀察到毛細(xì)血管參與了原始腎小球的血管網(wǎng)絡(luò)，為研究腎臟血管系統(tǒng)祖細(xì)胞的起源提供了有力的工具。Joon Chae Na等[18]利用他們先前在腎小管類(lèi)器官模型中的經(jīng)驗(yàn)[19]建立了晚期腎細(xì)胞癌類(lèi)器官。他們所建立的腫瘤類(lèi)器官與腎細(xì)胞癌組織學(xué)的結(jié)構(gòu)相當(dāng)，類(lèi)器官細(xì)胞集群表現(xiàn)出類(lèi)似于原始細(xì)胞集落的模式，細(xì)胞形態(tài)的主要特征（豐富的脂質(zhì)、透明的細(xì)胞質(zhì)和多樣的菌落）都在類(lèi)器官培養(yǎng)中得到了很好的維持。他們還發(fā)現(xiàn)，腎癌細(xì)胞中常見(jiàn)的生物標(biāo)志物：CA9、角蛋白和波形蛋白表達(dá)水平與原位癌組織相當(dāng)。Samoylenko等[20]利用類(lèi)器官技術(shù)，建立用于癌癥基因發(fā)現(xiàn)的腎癌類(lèi)器官。他們利用經(jīng)典的后腎間充質(zhì)（MM）腎小管誘導(dǎo)模型[21]，比較非誘導(dǎo)性和誘導(dǎo)性MM的轉(zhuǎn)錄組譜后，確定了一些相關(guān)的特征基因。通過(guò)siRNA介導(dǎo)，高效敲除Bnip3、Gsn、Lgals3、Pax8、Cav1、Egfr和Itgb2基因在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)，細(xì)胞遷移、細(xì)胞活力以及侵襲能力均受到抑制。腎癌的3D培養(yǎng)條件能高效率地復(fù)制親本腫瘤的分子和組織學(xué)表型，與患者的預(yù)后相關(guān)，這可以為腫瘤生物學(xué)的基礎(chǔ)研究提供解決方案，并有效地評(píng)估靶向和針對(duì)患者的個(gè)性化療法。

2.3 膀胱類(lèi)器官的技術(shù)發(fā)展

目前，很少有模型系統(tǒng)能夠客觀模擬正常尿路上皮和膀胱癌的生物學(xué)特性。原代小鼠和人類(lèi)膀胱細(xì)胞的培養(yǎng)已有報(bào)道，但由于其壽命較短而受到限制[22-23]，科學(xué)家們便從誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中進(jìn)行嘗試，Osborn等[24]開(kāi)發(fā)了一種無(wú)基質(zhì)及細(xì)胞接觸的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，誘導(dǎo)人類(lèi)多能干細(xì)胞進(jìn)入最終內(nèi)胚層，于特定的培養(yǎng)基中定向分化成尿路上皮。Kang等[25]使用新的分化方法誘導(dǎo)人類(lèi)多能干細(xì)胞分化為內(nèi)胚層，然后誘導(dǎo)膀胱尿路上皮細(xì)胞的產(chǎn)生。但這些并不能很好表現(xiàn)原發(fā)腫瘤的特征[26-27]。目前已經(jīng)建立了用于膀胱癌的基因小鼠模型和原位異種移植[28]，但建立和維護(hù)過(guò)程卻很費(fèi)時(shí)。Jasper Mullenders等[29]介紹了小鼠和人類(lèi)尿路上皮癌類(lèi)器官的培養(yǎng)系統(tǒng)。他們基于以前發(fā)表過(guò)的影響尿路上皮培養(yǎng)的生長(zhǎng)因子和抑制劑[30]，調(diào)整出不同培養(yǎng)基條件，建立了膀胱癌基底細(xì)胞類(lèi)器官，該類(lèi)器官中存在Ck5 +細(xì)胞（基底細(xì)胞存在），且大多數(shù)細(xì)胞CD44呈陽(yáng)性（膀胱癌干細(xì)胞標(biāo)記物）。他們還使用了CRISPR / Cas9技術(shù)來(lái)創(chuàng)建基因敲除的基礎(chǔ)尿路上皮類(lèi)器官。對(duì)于人類(lèi)來(lái)源膀胱癌類(lèi)器官，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明FGF7和FGF10均足以促進(jìn)人膀胱癌類(lèi)器官的生長(zhǎng)，提高了效率約50%，延長(zhǎng)了傳代時(shí)間，成功地培養(yǎng)了超過(guò)30個(gè)傳代的多個(gè)類(lèi)器官系。膀胱癌的兩個(gè)常見(jiàn)亞型是管腔和基底亞型[31]，管腔亞型的特征是Ck20 +細(xì)胞，而基底亞型包含Ck5 +細(xì)胞[32]，基于這些標(biāo)準(zhǔn)，組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：有一個(gè)樣本被歸類(lèi)為腔內(nèi)膀胱癌，而其他大多數(shù)樣本則更類(lèi)似于基底亞型。值得注意的是，源自某同一個(gè)患者的腫瘤的兩個(gè)類(lèi)器官系統(tǒng)之間存在差異：兩者中只有一個(gè)包含Ck20 +細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證明，作為類(lèi)器官的腫瘤樣品培養(yǎng)是研究腫瘤異質(zhì)性的重要資源，人膀胱類(lèi)器官可根據(jù)其基因表達(dá)特征進(jìn)行分類(lèi)，類(lèi)似于針對(duì)腫瘤樣品的研究[33]。膀胱癌類(lèi)器官在功能研究的可行性，以及在類(lèi)器官培養(yǎng)物中篩選而鑒定出陽(yáng)性藥物，都將有助于進(jìn)一步指導(dǎo)膀胱內(nèi)治療。

3 泌尿系腫瘤類(lèi)器官的相關(guān)應(yīng)用

要在體外研究藥物敏感性和耐藥性的機(jī)制，首先需要癌細(xì)胞株滿足不易衰老、易于維護(hù)、易于高通量篩選和可異種移植等要求[34]。3D類(lèi)器官是一種優(yōu)化的選擇，可用于藥物敏感性篩選及識(shí)別與腫瘤藥物反應(yīng)改變相關(guān)的分子特征，將藥物敏感性與基因組特征聯(lián)系起來(lái)。

Chen Yu等[12]建立7個(gè)前列腺癌細(xì)胞系（6個(gè)活組織樣品和1個(gè)來(lái)自循環(huán)腫瘤細(xì)胞）。利用DNA的全外顯體測(cè)序、陣列比較基因組雜交和雙端RNA測(cè)序?qū)@7個(gè)前列腺癌細(xì)胞系表征，結(jié)果表明患者來(lái)源的細(xì)胞系具有與腫瘤組織相同的突變。7條細(xì)胞系也概括了前列腺癌亞型的分子多樣性，包 括TMPRSS2-ERG融 合、SPOP突 變、SPINK1過(guò)表達(dá)和CHD1丟失。p53和RB抑癌通路功能的缺失是細(xì)胞系間最常見(jiàn)的共同特征。為了研究這些細(xì)胞系是否適合研究治療反應(yīng)，所有7個(gè)系都用抗雄激素恩雜魯胺、PI3K抑制劑和BKM-120治療。發(fā)現(xiàn)類(lèi)器官細(xì)胞系有AR擴(kuò)增，PTEN丟失和PIK3R1突變的發(fā)生，對(duì)恩雜魯胺和PI3K抑制劑均表現(xiàn)出敏感性。Chen Yu和他的同事在此研究基礎(chǔ)上[35]，使用人工基底膜作為生物支架，首次實(shí)現(xiàn)了前列腺癌類(lèi)器官可以很可靠地實(shí)現(xiàn)體外培養(yǎng)，建立良性和惡性前列腺細(xì)胞來(lái)源的類(lèi)器官。其中關(guān)鍵的突破點(diǎn)是該系統(tǒng)中的培養(yǎng)基，須達(dá)到使良性和惡性前列腺細(xì)胞可無(wú)限傳代的作用。這一突破為高通量藥物篩選提供了重要的可能性。

小鼠模型已被用作臨床前腎毒性篩查的制藥工具。然而，這些模型無(wú)法以完全準(zhǔn)確的方式概括人類(lèi)的細(xì)胞。因此，需要人源的體外模型進(jìn)行腎毒性篩查。來(lái)自誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的腎臟類(lèi)器官已被用于測(cè)試腎近端小管的反應(yīng)（在腎毒性中起重要作用：重吸收作用），例如劑量為5μm的腎毒性藥物順鉑[19]，結(jié)果表明，這藥物可誘導(dǎo)近端成熟腎小管細(xì)胞發(fā)生特異性急性凋亡，但對(duì)未成熟腎小管細(xì)胞無(wú)明顯作用。國(guó)內(nèi)趙瀛蘭等[36]在治療腎細(xì)胞癌方面的研究表明，氯喹（CQ）可增強(qiáng)舒尼替尼的抗腎細(xì)胞癌作用（抑制細(xì)胞增殖），并提高細(xì)胞凋亡率。抑制細(xì)胞增殖也可以在舒尼替尼和CQ的協(xié)同抗腫瘤作用中起作用。增殖實(shí)驗(yàn)方面，經(jīng)免疫組織化學(xué)分析顯示，共處理組中代表LC3-II的自噬標(biāo)記的棕色點(diǎn)狀染色增加，表明共處理可以增強(qiáng)舒尼替尼抗腫瘤的活性。

Suk Hyung Lee等[37]為了探索自己建立的膀胱癌類(lèi)器官作為藥物反應(yīng)評(píng)估的臨床前模型的實(shí)用性，進(jìn)行了劑量滴定分析，藥物的選擇是基于其與膀胱癌治療的臨床相關(guān)性，包括正在臨床試驗(yàn)中測(cè)試的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)療法和研究試劑。結(jié)果顯示出不同類(lèi)器官系之間驚人的相似性和差異性，以及它們的變異曲線的部分相關(guān)性。例如，有的顯示出對(duì)MEK抑制劑曲美替尼和ERK抑制劑SCH772984治療的顯著反應(yīng)，這與FGFR3中存在激活突變一致，但有的含有FGFR3突變，卻未顯示對(duì)曲美替尼或SCH772984的顯著應(yīng)答；所測(cè)試的類(lèi)器官系統(tǒng)均未顯示出對(duì)三種不同F(xiàn)GFR抑制劑的反應(yīng)，考慮是缺乏能引起反應(yīng)的更復(fù)雜的刺激因素；他們注意到腫瘤進(jìn)展與藥物反應(yīng)之間存在相關(guān)性，從肌肉浸潤(rùn)癌以及治療失敗后復(fù)發(fā)的疾病建立的類(lèi)器官系顯示出最大的耐藥性。這些結(jié)果表明，可以在類(lèi)器官中驗(yàn)證通過(guò)在類(lèi)器官培養(yǎng)物中篩選而鑒定出的陽(yáng)性藥物反應(yīng)，原則上可將其用于指導(dǎo)膀胱內(nèi)治療。

泌尿系類(lèi)器官的研究和進(jìn)展，創(chuàng)造了很多可能性，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，類(lèi)器官技術(shù)存在不具備人體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境，缺少人體組織中必要成分，如脈管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等一些缺陷；不同腫瘤甚至不同亞型腫瘤類(lèi)器官培養(yǎng)技術(shù)復(fù)雜，需要進(jìn)一步研究不同的、個(gè)性化、最優(yōu)化的培養(yǎng)條件，但是類(lèi)器官技術(shù)發(fā)展?jié)摿薮?，未?lái)三維有機(jī)體培養(yǎng)技術(shù)的研究將有助于泌尿系腫瘤發(fā)生的建模和腫瘤表型的分子表征，以便發(fā)現(xiàn)各種泌尿系器官腫瘤細(xì)胞起源的生物標(biāo)志物以及腫瘤譜系。例如，F(xiàn)ONG等[38]在研究肝癌類(lèi)器官方面，創(chuàng)新性用多孔水凝膠代替常用的基質(zhì)膠建立起了“海綿系統(tǒng)”，能夠改善類(lèi)器官的更高效地保持癌來(lái)源組織的特征；微移動(dòng)陣列(Microraft array, MRA)、高內(nèi)涵篩選(High-content screening, HCS)、CRISPR-Cas9等技術(shù)也在不斷持續(xù)地發(fā)展。這些新的系統(tǒng)及技術(shù)都可以為泌尿系腫瘤類(lèi)器官技術(shù)的發(fā)展開(kāi)辟新的新思路。

在研究中使用類(lèi)器官平臺(tái)為開(kāi)發(fā)新療法、識(shí)別預(yù)測(cè)或預(yù)后的生物標(biāo)志物、開(kāi)發(fā)篩選系統(tǒng)和識(shí)別患者特定的治療方法創(chuàng)造了令人興奮的可能性，在未來(lái)會(huì)使精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)成為現(xiàn)實(shí)。