miR-29b在慢性淋巴細胞白血病中的研究進展

李高強，李燕

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，烏魯木齊 830001； 2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院血液病科，烏魯木齊 830001)

慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)是一種成熟B淋巴細胞在外周血、骨髓、脾臟和淋巴結(jié)異常增殖的血液腫瘤[1-2]。CLL的發(fā)生可能與免疫、感染、遺傳等因素有關(guān)。CLL是西方國家最常見的成人白血病類型之一，發(fā)病率約為5.1/10萬，占成人白血病的25%～40%[3]。據(jù)調(diào)查顯示，在亞洲地區(qū)，成人CLL白血病不足5%[4]，發(fā)病率遠遠低于歐美國家[5]。目前，CLL的診斷及分期主要依靠外周血、骨髓涂片、流式細胞學(xué)及染色體核型分析等多種檢測手段。由于CLL患者病情異質(zhì)性較大，為準確判斷預(yù)后及采取相應(yīng)治療手段，需對初治CLL患者病情進行客觀評估。目前已明確分期、β2微球蛋白、乳酸脫氫酶、免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(immunoglobulin heavy chain variable region，IGVH)及TP53(tumor protein p53)基因突變等指標與CLL預(yù)后密切相關(guān)，但對于CLL相關(guān)的分子機制尚不清楚，因此探索能將疾病進展和臨床預(yù)后緊密聯(lián)結(jié)的新型生物學(xué)標志物顯得尤為重要[6]。微RNA(microRNA，miRNA)是一種由8～25個堿基對組成的非編碼RNA，通過信使RNA降解或抑制翻譯來調(diào)節(jié)基因的表達，同時還具有轉(zhuǎn)化激活、穩(wěn)定和誘導(dǎo)RNA的功能；miRNA參與分化、增殖、調(diào)節(jié)細胞周期及細胞凋亡等細胞活動，這些過程在人類癌癥中失衡，并導(dǎo)致癌癥的發(fā)生、發(fā)展[7]。研究發(fā)現(xiàn)，與CLL發(fā)病及病情進展相關(guān)的miRNA有miR-29s、miR-155、miR-181b、miR-223、miR-17-92、miR-146a等[3-4，8-9]，其中一部分起到抑癌作用，另一部分發(fā)揮致癌作用?，F(xiàn)就miR-29b在CLL中的有關(guān)研究予以綜述。

1 miR-29b

1.1miR-29家族 miR-29家族主要包括miR-29a、miR-29b(miR-29b-1和miR-29b-2)、miR-29c，其中miR-29b-1和miR-29b-2分別位于人染色體7q32.3和1q32.2。成熟miR-29家族具有相同的堿基序列AGCACCA，在序列上具有很大相似性，其中miR-29b與細胞核內(nèi)物質(zhì)結(jié)合起作用，具有核定位AGUGUU序列。miR-29b在哺乳動物細胞代謝蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)降解氨基酸分解過程中發(fā)現(xiàn)，miR-29b分子是針對支鏈α酮酸復(fù)合物的二氫硫辛酰胺支鏈酰基轉(zhuǎn)移酶組分的miRNA，與之結(jié)合時阻止其翻譯[10]。研究顯示，miR-29b作為一種腫瘤抑制因子，通過促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤基因DNA甲基化、減少腫瘤增殖和增加化療敏感性來抑制腫瘤的進展，雖然部分腫瘤以及參與非惡性疾病的發(fā)病機制尚未完全闡明，但可以明確miR-29b參與了腫瘤細胞調(diào)控分化、凋亡及轉(zhuǎn)錄[11]。

1.2miR-29b的作用 研究表明，miR-29b在大多數(shù)腫瘤中起到抑癌作用，在婦科腫瘤(如乳腺癌、宮頸癌)、消化道腫瘤(如肝癌、胃癌)、血液腫瘤(急性髓系白血病、多發(fā)性骨髓瘤等)中的表達下調(diào)[10-12]。在某些腫瘤(如結(jié)腸癌)中miR-29b表達上調(diào)，預(yù)示病情較重，預(yù)后差[13]。miR-29b通過以下生物學(xué)效應(yīng)發(fā)揮作用。①抑制血管生成：miR-29b靶向血管內(nèi)皮生長因子A路徑，通過促分裂原活化的蛋白激酶/胞外信號調(diào)節(jié)激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B抑制血管生成，影響癌細胞的生長[14]；②抑制癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移：CC趨化因子配體11、CXC趨化因子配體14水平增高促進癌細胞生長增殖及產(chǎn)生耐藥，miR-29b通過下調(diào)p38-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1信號通路及CC趨化因子配體11、CXC趨化因子配體14來抑制癌細胞的增殖與轉(zhuǎn)移[15]；③誘導(dǎo)細胞凋亡：TP53是一種編碼蛋白p53的抑癌基因，在細胞分裂、凋亡與核酸損傷修復(fù)中扮演著重要角色，在miR-29b誘導(dǎo)HeLa和MCF7細胞中合成肽LK-L1C/K6W/L8C，通過促進miR-29b的表達、增強p53活性以及提高p53的穩(wěn)定性來刺激細胞凋亡[16]；④促進細胞衰老：MYC是重要的抗衰老基因，致癌轉(zhuǎn)錄因子MYC恢復(fù)程序基因表達，促進細胞增殖和腫瘤形成，miR-29b通過與MYC蛋白的信使RNA結(jié)合而抑制其表達，促進細胞衰老[17]；在Burkitt淋巴瘤細胞和急性早幼粒細胞白血病中，MYC與細胞物質(zhì)結(jié)合，抑制細胞內(nèi)miR-29b的表達[18]；⑤調(diào)節(jié)細胞周期：miR-29b調(diào)節(jié)細胞周期的途徑不同，在受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1，ROR1+)CLL細胞中，miR-29b過表達可下調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)1和DNMT3A表達，通過減少特異性β1糖蛋白SP1(specificity protein 1)的表達和增加細胞周期抑制劑p21的表達來調(diào)節(jié)細胞周期[19]。miR-29b通過靶向髓樣細胞白血病1(myeloid cell leukemia-1，MCL-1)、細胞周期蛋白CCND2(cyclin D2)的3′端非翻譯區(qū)，誘導(dǎo)G1/S期細胞周期停滯并促進凋亡來抑制肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)增殖[20]。

2 miR-29b與CLL

目前有關(guān)miR-29b在CLL中的研究較少。有研究表明，IGVH基因無突變狀態(tài)的CLL患者預(yù)后較差，且具有17p缺失和(或)TP53基因突變、染色體復(fù)雜核型異常的患者預(yù)后最差，而11q缺失也是預(yù)后不良的標志[21-22]。在Visone等[23]通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)驗證的與CLL相關(guān)的32種miRNAs中，有9種miRNAs(包括miR-29b)的表達與特定的核型有關(guān)，表明miR-29b和miR-29c在11q缺失的CLL中表達較低；進一步比較亞組之間的分析結(jié)果表明，在17p-侵襲性病例中，miR-29b、miR-29c均下調(diào)，這一發(fā)現(xiàn)與這些患者的臨床過程相一致，提示miR-29b對于評估伴有17p缺失的CLL患者的腫瘤負荷具有重要的綜合診斷價值。Santanam等[24]對侵襲性CLL(29例)和惰性CLL(33例)患者進行研究，運用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)方法檢測miR-29b表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-29b在CLL患者中過表達，與普通CD19+B細胞相比，miR-29b在惰性CLL中高4～4.5倍，在侵襲性CLL中高3倍，但miR-29b在侵襲性CLL與惰性CLL中表達水平無差異。Zhu等[25]研究表明，CLL患者miR-29b的表達與IGVH的突變狀態(tài)相關(guān)性很大，IGVH基因未突變患者較IGVH突變患者具有較低的miR-29b水平，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。另外，F(xiàn)ulci等[26]通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，在54例CLL患者中miR-29b過表達，而且IGVH突變組較未突變組CLL細胞上調(diào)更顯著。上述研究均表明，在CLL患者中，miR-29b的低表達與疾病進展密切相關(guān)。但目前有部分研究結(jié)果顯示CLL患者與正常人miR-29b的表達無差異。例如，F(xiàn)urtado等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在Binet A期CLL、高計數(shù)單克隆B細胞淋巴細胞增多癥及正常的B細胞中miR-29b表達水平相似，未見顯著差異；Santanam等[24]比較了46例CLL患者和9例正常淋巴細胞者miR-29b的表達水平，結(jié)果顯示，70%的CLL患者與正常人B細胞相比，miR-29b具有相似的表達水平，其中，miR-29b的表達水平與正常健康對照者相比，46例CLL樣本中7例miR-29b的表達水平較高，32例表達水平相當，7例表達水平較正常健康對照者顯著降低，而miR-29b的水平在IGVH突變的和未突變的樣本中沒有差異。

此外，多項研究表明，miRNA發(fā)生基因突變和單核苷酸序列的改變可以影響miRNA的表達，序列變異可能與CLL生物學(xué)特性和發(fā)病機制有關(guān)；在CLL患者的miRNA基因中發(fā)現(xiàn)單核苷酸序列新的突變，其中大多存在于成熟miRNA中，可改變特定miRNA的二級結(jié)構(gòu)[27-28]。Kminkova等[28]研究顯示，含有多態(tài)性插入+107+A的pri-miR-29b-2的CLL患者的B細胞，與正常B細胞相比，miR-29b表達水平降低；在CLL患者中，攜帶多態(tài)性插入的miR-29b的表達水平在IGVH未突變組較IGVH突變組降低，可能影響CLL中B細胞的生物學(xué)特性，而沒有序列變異的CLL患者可能存在不同的調(diào)節(jié)機制。

3 miR-29b與靶基因

一個miRNA可以有多個靶基因，多個miRNA可以共同調(diào)節(jié)同一個靶基因，這些靶基因共同參與多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，又受到細胞中多個調(diào)節(jié)機制(如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、表觀遺傳學(xué)修飾)的調(diào)控，構(gòu)成了復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miR-29b在腫瘤進展中至關(guān)重要，可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子SP1、蛋白酪氨酸激酶、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、過氧蛋白、細胞周期激酶、DNMT3a/3b、T細胞淋巴瘤/白血病1(T-cell lymphoma/leukemia 1，TCL-1)、MCL-1等多種靶基因的表達[10，25，29-30]。

3.1miR-29b與TCL-1 TCL-1蛋白最初在人的T細胞幼淋巴細胞白血病中發(fā)現(xiàn)[31]。TCL-1是一種在前T細胞、樹突狀細胞及發(fā)育中的B細胞內(nèi)表達的蛋白。有研究認為，由于TCL-1的基因過表達導(dǎo)致CLL的發(fā)生，在B細胞內(nèi)，TCL-1可與原癌基因c-Jun 氨基端激酶、c-Fos互相協(xié)同，抑制激活蛋白1依賴的轉(zhuǎn)錄；此外，還可與核因子κB共激活物p300/cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白結(jié)合，激活核因子轉(zhuǎn)錄途徑，抑制細胞凋亡[31]。研究表明，TCL-1的表達與miR-29b的表達水平呈負相關(guān)，TCL-1的高表達與IGVH未突變及CD38+、ZAP70+高表達以及11q缺失相一致，與CLL的侵襲性疾病特征相關(guān)[25]。研究表明，miR-29b表達水平與IGVH突變狀態(tài)顯著相關(guān)，與正常對照組相比CLL患者B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)和TCL-1表達水平顯著上調(diào)，在IGVH未突變組CLL細胞中，miR-29b低表達，TCL-1高表達，作為miR-29b的預(yù)測靶點，盡管在CLL樣本中TCL-1的表達從完全缺失變?yōu)閺姳磉_，但在相當多的CLL樣本中，TCL-1的表達顯著增加[32]。但Santanam等[24]發(fā)現(xiàn)，在人與小鼠實驗中，TCL-1在侵襲性CLL中表達下調(diào)，miR-29b與TCL-1在惰性CLL中均較正常CD19+B淋巴細胞高表達。另外，TCL-1在CLL調(diào)節(jié)微環(huán)境已知的信號增強子和促存活分子中具有積極作用。研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細胞的TCL-1相關(guān)信使RNA和蛋白質(zhì)上調(diào)與TCL-1相互作用的原癌基因c-Fos/c-Jun氨基端激酶的降低相平行，基質(zhì)介導(dǎo)的TCL-1增加與TCL-1調(diào)節(jié)的miRNA(miR-29b、miR-181b和miR-34b)的水平降低相關(guān)[33]。

3.2miR-29b與MCL-1 Bcl-2是一種定位于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白，Bcl-2通過減少細胞色素的釋放而成為線粒體途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，是細胞凋亡的關(guān)鍵抑制劑[34]。MCL-1是一種Bcl-2家族的抗凋亡蛋白，是活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3通路下游的靶點，在大多數(shù)CLL細胞中，Bcl-2家族受到廣泛的細胞過程的動態(tài)調(diào)控，包括B細胞抗原受體的連接和通過CD40、血管內(nèi)皮生長因子和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[35-36]。有研究發(fā)現(xiàn)，MCL-1和miR-29b不僅參與器官的纖維化，還介導(dǎo)細胞增殖與凋亡[37]。MCL-1通過白細胞介素-6/白細胞介素-8結(jié)合miR-29b的3′端非翻譯區(qū)被直接下調(diào)，進而通過miR-29b/白細胞介素-6或白細胞介素-8/MCL-1L軸影響CD中的腸纖維化，miR-29b不僅能與MCL-1特異性結(jié)合，還能抑制癌細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，從而抑制MCL-1蛋白活性[38]。miR-29b可以抑制MCL-1和CCND2蛋白的表達，而沉默的MCL-1和CCND2則可以消除PASMCs增殖和凋亡的變化，miR-29b通過抑制MCL-1和CCND2從而抑制PASMCs的細胞增殖并促進PASMCs凋亡[20]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-29b可通過對原癌基因MCL-1和TCL-1的負調(diào)控，在具有TP53異常的侵襲性CLL中發(fā)揮抑癌作用[39]。促凋亡和抗凋亡信號在CLL患者中聚集在MCL-1上，表明該蛋白在調(diào)節(jié)該疾病中起關(guān)鍵作用。組蛋白去乙酰酶(histone deacetylases，HDACs)是染色質(zhì)調(diào)節(jié)酶，通過觸發(fā)組蛋白上賴氨酸4的去甲基化，阻止轉(zhuǎn)錄因子的獲得，從而導(dǎo)致表觀遺傳基因沉默。有研究表明，HDACs在CLL中過表達并介導(dǎo)miR-29b的表觀遺傳沉默，而HDACs抑制劑可以恢復(fù)這些miRNAs的表達以拮抗MCL-1蛋白的活性，從而抑制CLL細胞的增殖[26]。多項研究表明，miR-29b的水平降低與Bcl-2和MCL-1的高表達水平密切相關(guān)[27，36-37]。HDACs表達水平在CLL中上調(diào)，介導(dǎo)了miR-15a、miR-16和miR-29b的表觀遺傳沉默，進一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制HDACs可誘導(dǎo)miR-15a、miR-16和miR-29b表達上調(diào)，導(dǎo)致與線粒體功能喪失和誘導(dǎo)原發(fā)性白血病細胞死亡相關(guān)的MCL-1蛋白水平降低，使CLL患者存活率降低[26]。

3.3miR-29b與DNMT DNA甲基化是調(diào)控表觀遺傳水平基因表達的重要途徑。DNMT催化DNA的甲基化修飾，DNMT活性及功能的改變與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，DNA高甲基化可抑制基因轉(zhuǎn)錄，而低甲基化可使染色質(zhì)不穩(wěn)定并導(dǎo)致異常細胞出現(xiàn)。抑癌基因啟動子區(qū)的高甲基化是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要因素。DNMT家族包括DNMT1(維持甲基化)、DNMT3a和DNMT3b(催化DNA的從頭甲基化)，DNA甲基化通過各種機制在多種癌癥中發(fā)生[40]。有研究發(fā)現(xiàn)，DNMT1信使RNA水平的降低與miR-29b在急性髓系白血病中的過表達有關(guān)，異常的DNA高甲基化通過沉默結(jié)構(gòu)正常的基因來促進急性髓系白血病的發(fā)生；miR-29b在急性髓系白血病細胞中的過表達導(dǎo)致DNMT1、DNMT3a和DNMT3b在RNA和蛋白質(zhì)水平上的表達顯著降低，從而導(dǎo)致DNA甲基化的水平降低；進一步的實驗表明，miR-29b可通過靶向DNMT1基因的反式激活因子SP1間接下調(diào)DNMT1[41]。目前，有研究通過動物實驗證實了DNMT的功能與miR-29b在CLL中的表達水平有關(guān)，ROR1在惡性B-CLL細胞中表達，但不在正常B細胞中表達，將miR-29b靶向遞送至ROR1+CLL細胞，可導(dǎo)致DNMT1和DNMT3a的下調(diào)、轉(zhuǎn)錄因子SP1的減少以及細胞周期蛋白激酶抑制劑p21表達的增加；用miR-29b處理的原代CLL細胞中DNMT和SP1下調(diào)與調(diào)節(jié)細胞周期的miR-29b/SP1有關(guān)，隨著CLL細胞中miR-29b表達水平增高，DNMT及SP1下降[19]?？傊?，上述研究通過動物體內(nèi)和體外實驗證實了ROR1的遞送可以有效地增加miR-29b的表達水平，從而實現(xiàn)阻滯白血病細胞的細胞周期，證明了miR-29b在CLL細胞中的抗腫瘤效果。

3.4miR-29b與DNAJB11 DNAJB11是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的關(guān)鍵伴侶BiP的輔助因子，控制分泌和膜蛋白的折疊、運輸及降解。DNAJB11被證實是HEK293細胞系中miR-29b的靶點，并且這些基因(sfpq、hmgb1、serbp1)被強烈建議作為CLL的miRNAs成員的直接目標[42]；研究發(fā)現(xiàn)，表達miR-29b的載體中，含有全長DNAJB11 3′端非翻譯區(qū)的熒光素酶報告基因的表達降低至約40%，表明DNAJB11確實受到miR-29b的調(diào)節(jié)；當內(nèi)源性miRNA與DNAJB11的全長3′端非翻譯區(qū)融合時，與對照轉(zhuǎn)染組相比，miR-29b的抑制導(dǎo)致熒光素酶活性增強；另外，DNAJB11是編碼熱激蛋白40變體的信使RNA，進一步證實，DNAJB11是miR-29b的靶基因[43]。

4 小 結(jié)

近年來，miRNA已成為腫瘤發(fā)病機制的研究熱點。miRNAs在CLL發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)研究已經(jīng)取得了很大進展，并且基于已發(fā)現(xiàn)CLL中存在的靶基因，為靶向治療提供了一定的方向。然而，miRNA參與CLL調(diào)控靶基因的機制研究仍在探索中。miR-29b在CLL中表達上調(diào)，作為抑癌基因的作用存在，與疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。但miR-29b在CLL的發(fā)生、發(fā)展中調(diào)控病理生理進程的作用機制目前尚不清楚，還需通過大量研究得以驗證。miR-29b可能會成為CLL臨床診斷、分期和判斷預(yù)后的重要指標。