焦亡在常見消化道疾病中的機(jī)制研究

洪坤巧，邱虎，余保平

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，武漢 430060)

自Cookson和Brennan[1]在2001年繼壞死和細(xì)胞凋亡后首次提出焦亡的術(shù)語，焦亡便引起學(xué)術(shù)界高度的關(guān)注，在全身系統(tǒng)疾病中的作用機(jī)制和疾病的發(fā)生發(fā)展、診斷、預(yù)后方面被廣泛深入探索。最初在巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)胱天蛋白酶(caspase)參與疾病免疫性應(yīng)答，后來在肝細(xì)胞和腎臟細(xì)胞均發(fā)現(xiàn)了參與細(xì)胞焦亡的caspase和炎性小體等物質(zhì)，并參與炎癥的發(fā)生和纖維化[2-3]。此外，焦亡還參與腫瘤的侵襲、種植和轉(zhuǎn)移，通過阻斷焦亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或剔除Gasdermin D(GSDMD)能延緩腫瘤的進(jìn)展[4]。細(xì)胞焦亡涉及精確的信號(hào)級(jí)聯(lián)，由一組確定的效應(yīng)分子執(zhí)行，形成了較復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，并伴隨大量的炎癥介質(zhì)釋放，細(xì)胞焦亡是機(jī)體與生俱來的自我保護(hù)和對細(xì)胞內(nèi)外有害物質(zhì)的應(yīng)答反應(yīng)。細(xì)胞焦亡根據(jù)始動(dòng)因子不同分為經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑，通過細(xì)胞內(nèi)脂多糖結(jié)合caspase-11、caspase-4、caspase-5或炎性體(caspase-1)激活炎性caspase，激活的炎性caspase切割GSDMD，從自身抑制性GSDMD-C結(jié)構(gòu)域釋放N端p30結(jié)構(gòu)域，然后活化的GSDMD-N與質(zhì)膜中的脂質(zhì)結(jié)合并形成大的寡聚孔，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的釋放和細(xì)胞死亡[5]?，F(xiàn)就焦亡在消化道疾病相關(guān)機(jī)制的研究進(jìn)展予以綜述。

1 調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡的相關(guān)分子

1.1模式識(shí)別受體家族 焦亡發(fā)生的第一步是配體與受體[包括Toll樣受體、NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)、C型凝集素受體和維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ樣受體，這4種受體是一組進(jìn)化保守的受體]的識(shí)別啟動(dòng)先天性免疫應(yīng)答，然后，識(shí)別結(jié)合到胞外或胞內(nèi)病原微生物或者傷害性刺激的相關(guān)分子模式(病原相關(guān)分子模式、損傷相關(guān)分子模式及其他免疫相關(guān)分子模式)，最終啟動(dòng)焦亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[6]。在胃腸道相關(guān)疾病中涉及最多的是NLRs，它富含亮氨酸重復(fù)序列，包括多個(gè)亞系(NLRA、NLRB、NLRC和NLRP)，其中又以NLRC和NLRP最突出；NLRC蛋白在其N端具有一個(gè)或多個(gè)caspase募集結(jié)構(gòu)域(CARD)，通過它們可以直接與受體相互作用蛋白2或pro-caspase-1相互作用形成炎性小體；NLRP蛋白則與之不同，其具有熱蛋白樣結(jié)構(gòu)域(PYD)，NLRP有14個(gè)家庭成員即NLRP1～14，其中NLRP3是炎性小體的重要組成部分，參與多種疾病的發(fā)生，它具有C端富含亮氨酸重復(fù)序列、中心NACHT結(jié)構(gòu)域和N端PYD，當(dāng)被激活時(shí)，PYD允許通過同型PYD-PYD相互作用募集細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis associated speck-like protein，ASC)[7]。

1.2傳感器炎性小體 炎性小體是一種細(xì)胞溶質(zhì)多蛋白復(fù)合物，控制炎癥反應(yīng)，協(xié)調(diào)宿主防御病原微生物。目前已鑒定并被廣泛接受的炎性小體復(fù)合物有7種，即NLRP1、NLRC4、AIM2(absent in melanoma 2)、人γ干擾素誘導(dǎo)蛋白16、熱蛋白、NLRP3和非經(jīng)典的caspase-4[8]。普遍認(rèn)為，炎性小體由NLRP3、ASC和pro-caspase-1組成，炎性小體傳感器通過識(shí)別和響應(yīng)病原體(脂多糖、病原微生物DNA和細(xì)菌鞭毛蛋白)或危險(xiǎn)信號(hào)(離子通量、自身DNA和ATP)起作用[9]。ASC是一個(gè)銜接蛋白，由PYD和CARD組成，通過連接NLR的PYD和pro-caspase-1的CARD起作用，ASC作為中間橋梁將上游炎性體傳感器分子橋接至pro-caspase-1，誘導(dǎo)催化具有活性caspase-1的形成，切割白細(xì)胞介素(interleuki，IL)-1β前體為成熟的IL-1β，通過細(xì)胞膜上的通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔釋放到細(xì)胞外啟動(dòng)下游[10]。

1.3調(diào)節(jié)器caspase caspase是哺乳動(dòng)物具有的含15個(gè)成員的高度保守的天冬氨酸特異性半胱氨酸家族，在調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡、發(fā)育、炎癥和免疫相關(guān)中起關(guān)鍵作用[11-12]。caspase和多數(shù)的酶一樣最初以無活性的酶原存在，只有在被炎性小體激活后才能發(fā)揮功能。caspase-8/10是具有4個(gè)結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，包括小亞基、大亞基、CARD和死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(DED)，caspase-1/2/4/5/9/12缺乏DED基序，但包含其他結(jié)構(gòu)域；效應(yīng)子caspase-3/6/7則需要將其他caspase切割成小亞基和組裝成活性酶的大亞基，這些活化的caspase可以切割底物，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡和炎癥；caspase-1/4/5/11通過切割GSDM家族成員尤其是GSDMD引發(fā)焦亡，以誘導(dǎo)膜孔的形成和質(zhì)膜破裂[13]。caspase-1作為焦亡的啟動(dòng)子，促進(jìn)炎癥因子成熟和釋放，但它使炎癥因子釋放的具體機(jī)制目前仍不清楚。有學(xué)者認(rèn)為，caspase-1早期切割細(xì)胞核內(nèi)的自身抗原1促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放，而活化的自身抗原1對caspase-1形成正反饋，這個(gè)過程與GSDMD形成的細(xì)胞膜孔道無關(guān)[14]。

1.4執(zhí)行者GSDMD家族 GSDMD是caspase作用的底物，同時(shí)也是經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑的共同底物，是焦亡的關(guān)鍵物質(zhì)；GSDMD被caspase-1或caspase-11切割成N端和C端，C端能抑制N端的功能，這種自身抑制作用在GSDMD被裂解后喪失，而GSDMD-C并不是無活性的片段，GSDMD-C的過表達(dá)可以阻斷脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡[15-17]。GSDMD-N端部分能夠易位至脂質(zhì)膜中，寡聚化形成內(nèi)徑>3.5 nm的孔道，細(xì)胞焦亡時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)容物的流出最終導(dǎo)致膜裂解[18]。GSDMD在焦亡最后環(huán)節(jié)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是IL-1β分泌的中間媒介，甚至N端片段也能促發(fā)細(xì)胞死亡，在N端被修飾后其功能也被相應(yīng)破壞，GSDMD在焦亡中的多種功能也越來越突出[17,19]。

1.5細(xì)胞焦亡的經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑 細(xì)胞焦亡通常由人體內(nèi)促炎性caspase-1/4/5的激活引發(fā)，從而導(dǎo)致炎癥介質(zhì)(IL-1β和IL-1)釋放，GSDMD被切割、膜孔形成，最終導(dǎo)致細(xì)胞裂解。焦亡主要受兩種主要途徑調(diào)節(jié)，即caspase-1誘導(dǎo)的經(jīng)典炎性途徑和caspase-4/5誘導(dǎo)的非經(jīng)典炎性途徑。經(jīng)典途徑：胞質(zhì)模式識(shí)別受體(如NLRP1/2/3/6/7和NLRC4的CARD結(jié)構(gòu)域)識(shí)別病原等相關(guān)分子模式，隨之激活炎性小體，炎性小體使caspase-1活化，直接切割GSDMD，游離的N端移至內(nèi)膜，與膦脂結(jié)合形成膜孔道，同時(shí)caspase-1促進(jìn)IL-1β和IL-18成熟和分泌，最終細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)、鉀離子透過GSDMD-N孔，炎癥介質(zhì)大量釋放，由此導(dǎo)致細(xì)胞焦亡[20]。非經(jīng)典途徑：人的caspase-4/5通過其CARD直接識(shí)別革蘭陰性菌脂多糖，而在大鼠中脂多糖能夠直接進(jìn)入細(xì)胞并激活caspase-11[21]，作用于與經(jīng)典途徑一樣的底物GSDMD，后面的環(huán)節(jié)大致與經(jīng)典途徑相似。目前認(rèn)為，經(jīng)典和非經(jīng)典途徑之間并不是獨(dú)立的，兩者相互作用可以放大炎癥反應(yīng)和焦亡[22]。

2 焦亡與消化道相關(guān)疾病

2.1焦亡與肝病 肝炎常見于各型肝炎病毒、藥物、酒精、自身免疫等因素?fù)p傷引起的炎癥，炎癥如果得不到控制，可刺激肝星狀細(xì)胞的活化和促纖維化因子的上調(diào)，最終發(fā)展為肝硬化。GSDMD在多種細(xì)胞類型和組織中表達(dá)，除常見的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞外，還包括肝細(xì)胞[23-24]，參與炎癥因子的釋放和組織纖維化[25]。Xu等[26]也證明了人類非酒精性肝病中GSDMD能顯著促進(jìn)肝細(xì)胞因子分泌、巨噬細(xì)胞浸潤，并激活核因子κB信號(hào)通路，推動(dòng)肝脂肪變性向肝炎的轉(zhuǎn)化。焦亡的終末環(huán)節(jié)釋放大量促炎物質(zhì)，由庫普弗細(xì)胞釋放的IL-1β促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化，增加了細(xì)胞外基質(zhì)和膠原蛋白的沉積，從而促進(jìn)肝纖維化和隨后的肝硬化[27]。有學(xué)者進(jìn)一步做了相關(guān)研究，結(jié)果顯示，條件缺失的Ⅰ型IL-1受體通過阻斷IL-1驅(qū)動(dòng)的局部和全身炎癥細(xì)胞因子和趨化因子水平，減輕肝損傷，同時(shí)，NLRP3炎性小體的表達(dá)和capase-1的活化被抑制，抑制細(xì)胞炎癥性質(zhì)的釋放，也能阻止病變的進(jìn)展[28]。NLRP3炎性小體激活可誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死、肝臟炎癥和纖維化[27,29]。在體外和細(xì)胞水平上同時(shí)驗(yàn)證了在急性肝損傷模型中與焦亡相關(guān)的蛋白caspase-1和NLRP3 的表達(dá)水平顯著增加，給予相應(yīng)的抑制劑預(yù)處理肝細(xì)胞，結(jié)果均顯示，細(xì)胞凋亡率下降，細(xì)胞損傷減輕[30]。在肝臟的缺血再灌注損傷中，二十二碳六烯酸通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B途徑抑制肝細(xì)胞焦亡，從而改善心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的損傷[31]。因此，焦亡在肝臟的損傷、炎癥、肝硬化等疾病的發(fā)生、發(fā)展環(huán)節(jié)中發(fā)揮了重要作用，藥物阻斷或靶向基因剔除成為潛在的治療靶點(diǎn)。

2.2焦亡與炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD) IBD是一組原因不明的慢性腸道炎癥疾病，容易復(fù)發(fā)且難治愈，包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。焦亡是先天免疫應(yīng)答的重要組成部分，焦亡信號(hào)通路以及IL-1β的釋放在炎癥反應(yīng)疾病中起著關(guān)鍵作用，炎性小體參與IBD的具體發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，包括不當(dāng)?shù)酿つっ庖邞?yīng)答和腸道微生物群紊亂等，capase-1、IL-1β和IL-18在IBD的表達(dá)也較正常組織升高[32]；caspase-1在被炎性小體激活后促進(jìn)IL-1β的復(fù)合物的成熟，負(fù)責(zé)釋放IL-1家族成員(如IL-1β和IL-18)，在細(xì)胞焦亡中扮演著重要的角色，在應(yīng)用capase-1的抑制劑后IBD的癥狀顯著改善[33]。IL-1β和IL-18都是有效的促炎細(xì)胞因子，對先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)具有廣泛的影響，IL-1β的上調(diào)與疾病活動(dòng)和IBD中活動(dòng)性病變的存在相關(guān)，用IL-1阻斷劑治療可降低疾病的嚴(yán)重程度[34]。NLRP3是焦亡經(jīng)典信號(hào)通路的炎性小體，免疫失調(diào)引起炎性小體的活化，NLRP3炎性體激活與IBD息息相關(guān)，在動(dòng)物模型中，1,25-二羥維生素D3的前體膽固醇乳劑可以通過抑制炎性小體減輕結(jié)腸炎或者自身免疫性心肌炎的癥狀[35-36]。IBD的發(fā)生最常見的是免疫性因素，免疫相關(guān)的GTP酶M通過作用于NLRP3和ASC阻斷其寡聚化來阻礙炎性小體組裝，同時(shí)抑制炎癥因子的成熟，免疫相關(guān)的GTP酶M在克羅恩病實(shí)驗(yàn)小鼠模型中具有減輕焦亡和腸道炎癥的保護(hù)作用，藥物的臨床相關(guān)價(jià)值還需要大量的研究提供依據(jù)[37]。在骨相關(guān)的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞中，通過啟動(dòng)焦亡促進(jìn)炎癥反應(yīng)，其抑制劑66PR可能通過降低NLRP3和caspase-11的表達(dá)抑制炎性小體，提高細(xì)胞存活率，在IBD的治療方面有較好的療效，具有很好的應(yīng)用前景[32-33]。

2.3焦亡與相關(guān)消化道腫瘤

2.3.1焦亡與肝癌 caspase-1作為啟動(dòng)子在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和其他細(xì)胞中引發(fā)了焦亡，在腫瘤中的作用已逐漸被發(fā)現(xiàn)[8]。焦亡使大量炎癥介質(zhì)釋放，促進(jìn)肝炎、肝硬化的發(fā)生，而肝硬化進(jìn)一步發(fā)展成肝癌。而Chu等[38]在肝癌組織中觀察到caspase-1的表達(dá)顯著下調(diào)，焦亡信號(hào)通路的改變影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，caspase-1的抑制劑Ac-YVAD-CMK可間接增強(qiáng)HepG2細(xì)胞的活力以及遷移和侵襲能力。caspase-1在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用，caspase-1通過焦亡通路調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖和凋亡，而caspase-1缺陷小鼠具有增強(qiáng)腫瘤形成的作用[39]。同樣，肝X受體控制癌細(xì)胞增殖和死亡，有研究者用激動(dòng)劑特異性誘導(dǎo)肝X受體β，發(fā)現(xiàn)pannexin 1和NLRP3依賴性caspase-1的活化可抑制結(jié)腸腫瘤生長，抑制caspase-1成為腫瘤治療的新標(biāo)靶[39-40]。

2.3.2焦亡與胰腺癌 胰腺癌是一種病死率極高的惡性腫瘤，其起病隱匿、發(fā)展迅速，小干擾RNA、非編碼RNA、缺氧等通過作用于靶基因或相關(guān)信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞焦亡在胰腺癌中發(fā)揮的作用尚不明確，焦亡與人類胚胎發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持和疾病病理學(xué)有關(guān)，由于信號(hào)通路的改變，癌癥導(dǎo)致細(xì)胞分裂與細(xì)胞死亡之間失去平衡[40]。細(xì)胞接收特定的死亡信息后發(fā)生腫脹、爆破，產(chǎn)生細(xì)胞因子，并最終死亡。由caspase-1介導(dǎo)的經(jīng)典途徑的表達(dá)缺乏可能導(dǎo)致炎癥介導(dǎo)的腫瘤進(jìn)展，STE20樣激酶1通過活性氧類誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡抑制胰腺癌進(jìn)展，焦亡參與胰腺癌的發(fā)病機(jī)制，并且可能是治療胰腺癌的新的腫瘤靶標(biāo)[41]。

2.3.3焦亡與胃癌 GSDMD參與焦亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是焦亡的最終和直接執(zhí)行者。GSDMD在胃癌中的表達(dá)水平較正常組織降低，可顯著促進(jìn)體內(nèi)和體外腫瘤的增殖，GSDMD的下調(diào)通過激活胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3以及調(diào)節(jié)胃癌中的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白來加速S/G2期細(xì)胞轉(zhuǎn)變[4]。GSDM家族的其他成員(GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDME/DFNA5和GSDMA3)在破膜的細(xì)胞毒性方面具有相似的功能[42]。以往認(rèn)為主要是GSDMD參與了焦亡，新近的研究表明，GSDME通過調(diào)節(jié)caspase-3促進(jìn)炎性小體的活化，與腫瘤等疾病的發(fā)生相關(guān)[43-44]。Wang等[45]證明，GSDME依賴性caspase-3的焦亡也參與胃癌的發(fā)生，并且5-氟尿嘧啶的治療可以誘導(dǎo)GSDME表達(dá)的胃癌細(xì)胞焦亡，由此認(rèn)為，焦亡通路以及相關(guān)蛋白表達(dá)在消化道相關(guān)腫瘤中是下調(diào)的，通過藥物上調(diào)可以抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移。此外，在腫瘤高表達(dá)GSDMD與侵襲性狀相關(guān)，GSDMD表達(dá)下調(diào)可限制腫瘤的生長和擴(kuò)散，可作為判斷腫瘤預(yù)后的指標(biāo)[4]。

3 小 結(jié)

焦亡是先天免疫的重要組成部分，焦亡中的炎性小體NLRP3的高效抑制劑JC124可顯著減輕腦創(chuàng)傷后炎癥應(yīng)答的癥狀[46]。此外，NLRP3在炎癥免疫等多數(shù)疾病中是上調(diào)的，而在腫瘤中呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢，在肝癌中NLRP3表達(dá)下調(diào)，17β-雌二醇通過激活NLRP3抑制肝癌的發(fā)生與進(jìn)展，成為治療腫瘤的新靶標(biāo)[47]。caspase-1參與多種急慢性炎癥和免疫失調(diào)的發(fā)生，caspase-1抑制劑還能促進(jìn)肺泡和血管發(fā)育，對肺具有保護(hù)作用，可轉(zhuǎn)化運(yùn)用到臨床肺發(fā)育不成熟的早產(chǎn)兒[48-49]。在類鼻疽感染的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，GSDMD引發(fā)焦亡，直接發(fā)揮殺菌作用[50]，而且抑制GSDMD可以減輕肝缺血再灌注和庫普弗細(xì)胞的焦亡[19]?？傊?，焦亡作為炎癥細(xì)胞死亡在消化道相關(guān)疾病的調(diào)節(jié)機(jī)制仍需不斷地完善和補(bǔ)充，為攻克疑難疾病提供新方案和理論依據(jù)。